Name: Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a técnica de injeção intracarotídea de células cancerígenas para criar modelos murinos de metástase cerebral com alta reprodutibilidade. Este método permite avaliar novas terapias e estudar a biologia das metástases cerebrais em neurociência e oncologia.

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Os autores não têm agradecimentos.

declaração de ética: Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center. 1. Prepare células cancerosas para Injection <ol><li> Semear as células cancerosas um ou dois dias antes da injecção. Use meio DMEM / F12 suplementado com 10% FBS, a menos que uma forma especializada é indicada na literatura para uma linha de células particular. </li><li> No dia da intervenção cirúrgica, as células da colheita quando atingem 70-80% de confluência, em primeiro lugar a lavagem com meio isento de soro, uma vez antes de tripsinização (0,25%) de 1 - 2 minutos a 37 ° C. Adicionar em células 10% FBS contendo DMEM media / F12 para saciar a tripsina 0,25%. </li><li> Centrifugar as células a 80 x g durante 3 min. Lave as células em meio isento de soro duas vezes para remover o soro residual, a contagem das células com um hemocitómetro e re-suspender em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) a 1 - 5 x 10 6 células / ml, dependendo da linha celular. Manter em geloaté ao momento da injecção. NOTA: MDA-MB-231 de cancro da mama e células de melanoma K1735 foram utilizados neste estudo, e ambas as linhas de células foram usadas em 2 × 10 6 células / ml de concentração. Manter a duração tripsinização tão curto quanto possível, como sobretratamento pode influenciar os resultados de ensaios de metástase. </li></ol> 2. Prepare Mice para Tumor injeção de células <ol><li> Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal (ip) de cetamina / xilazina cocktail (cetamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Confirmar anestesia completa por beliscar os pés animais e observar falta de resposta. </li><li> Posicione o mouse sobre uma placa de vidro (usado para a fundição de géis de proteína), e prenda com elásticos. </li><li> Se necessário, remover os pêlos do pescoço raspando ou aplicar uma pequena quantidade de produto de depilação e limpando o cabelo fora com toalha de papel. NOTA: Se estiver usando ratinhos nus, ignore este passo como eles não têm pêlos do corpo. </li><li> Limpe a pele do pescoço, aplicandoiodopovidona e álcool a 70%. </li><li> Coloque o mouse no palco do microscópio de dissecação </li><li> Realizar uma incisão na pele ~ 1 cm de comprimento com um bisturi cirúrgico. </li><li> Bluntly dissecar o músculo com pinças dentadas para expor a artéria carótida por baixo. </li><li> Separar a artéria carótida do nervo vago adjacente com pinça cirúrgica. </li><li> Utilizando uma pinça cirúrgica, separe um pouco de algodão de uma bola de algodão, umedeça e moda em uma bola de algodão menor. Coloque esta bola de algodão hidratada-buffer debaixo da artéria carótida do local pretendido da injeção. </li><li> Coloque um distal sutura e proximal à bola de algodão e fazer nós soltos. Apertar o nó proximal para bloquear o fluxo sanguíneo para o local de injecção. </li><li> Prossiga para a injeção de células de câncer se a artéria carótida na bola de algodão parece totalmente pressurizada com sangue vermelha fresca. </li></ol> Injeção celular 3. Cancer em Carótida <ol><li> Vortex e desenhar 100 ul océlulas cancerosas f para a seringa. </li><li> Sob o microscópio de dissecação, lentamente inserir a agulha 31 G (com bisel para cima) para dentro do lúmen da artéria carótida senta-se sobre a bola de algodão. </li><li> Lentamente injectar as células a partir da seringa para dentro da artéria carótida. injecção bem sucedida pode ser observada sob o microscópio através da mudança de cor dos vasos sanguíneos mais próximos e musculatura quando células cancerosas tamponadas são empurrados para a circulação. </li><li> Quando a injecção de todo o volume é completa, levantar a artéria carótida distai suavemente para evitar a regurgitação. </li><li> Rapidamente apertar o nó distal para completar o processo de injecção. </li><li> Depois de completar a injecção, aperte as ligaduras e aparar o excesso de fio de seda com micro-tesoura sob o microscópio de dissecação. Mover para trás o músculo separadas para cobrir o local da ferida. Feche a pele com dois grampos. </li></ol> 4. A recuperação cirúrgica <ol><li> Mova o animal operado em uma almofada de aquecimentopara recuperar. Pode demorar 30 - 60 min para os animais a recuperar a consciência. No entanto, administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) via injecção subcutânea como analgesia pós-cirúrgica. Nota: Analgesia devem ser fornecidos de acordo com o seu IACUC local aprovou o protocolo. </li><li> Uma vez que os animais despertar e retomar o seu comportamento normal, retornar os ratos para o seu local de moradia. Fornecer os ratos com comida gel durante vários dias pós-cirurgia. Mantenha um registro cirúrgico e mantê-lo no quarto. </li></ol> 5. Non-invasive In vivo de imagens <ol><li> Para as células marcadas com construções repórter de luciferase, medir a eficiência da injecção de células de cancro utilizando em sistema de imagem in vivo 14. NOTA: A imagiologia não é realizada no dia da injecção para evitar tensões excessivas para animais de pesquisa. </li></ol>

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<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+family+kinases+as+novel+therapeutic+targets+to+treat+breast+cancer+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases.</a> Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).</li>
<li>Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescent+imaging+of+mammary+tumors+using+IVIS+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta2+is+a+molecular+determinant+for+site-specific+melanoma+metastasis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain.</a> Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os passos mais críticos para injecção arterial da carótida bem sucedida de células de cancro são: 1) anestesia profunda de rato, em preparação para a operação cirúrgica; 2) colocação constante de artéria carótida em cima do suporte de algodão; 3) a ligação apertada da artéria carótida após a injecção bem sucedida. anestesia profunda de ~ 30 min é normalmente necessário para o desempenho cirúrgico estável sob o microscópio de dissecação. Usamos cocktail de cetamina / xilazina comercialmente r...

A metástase do cancro para o sistema nervoso central (SNC) é uma doença devastadora, e pode envolver o parênquima cerebral ou as leptomeninges ( &quot;metástase cerebral&quot; refere-se tanto neste artigo). É o tumor maligno intracraniana predominante, ultrapassando gliomas primários por&gt; 10: 1 1, 2. O câncer de pulmão, câncer de mama e melanoma são as principais três principais doenças neoplásicas que produzem alta incidência de metástases cerebrais 3, 4. Nos últimos anos, avanços impressionantes em novas terapias contra o câncer ter prolongado drasticamente a sobrevivência ea melhoria da qualidade de vida de muitos pacientes com câncer. No entanto, após recorrência, a incidência de metástase cerebral está a aumentar rapidamente. Por exemplo, o trastuzumab anticorpo anti-HER2 (Herceptin) demonstrou eficácia clínica significativa em pacientes com cancro da mama HER2 +; ainda uma tendência preocupante surgiunestes doentes: até 1/3 daqueles cuja doença sistêmica extracraniana inicialmente beneficiou de tratamento trastuzumab mais tarde desenvolver metástases cerebrais 5, 6, 7. Infelizmente, os pacientes com metástases cerebrais são refratários a quase todos os tratamentos atuais, geralmente experimentando uma deterioração traumática da qualidade de vida, e sua sobrevivência de um ano após o diagnóstico é apenas ~ 20% 8. As terapias atuais para metástases cerebrais (incluindo esteróides, radioterapia craniana e ressecção cirúrgica em pacientes selecionados) são meramente paliativas, não curativa 9. Portanto, metástase cerebral está a emergir como o próximo desafio imponente nesta era de novas terapias contra o câncer. Para enfrentar o desafio não satisfeitas pacientes enfrentam todos os dias na clínica, precisamos urgentemente para entender melhor o mecanismo subjacente de metástase cerebral e usar esse conhecimento para desenvolver novas terapias. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; colonização bem sucedida do cérebro por células de cancro metastáticas requer execução de uma série de funções mediadas pela interacção complexa de múltiplos jogadores biológicos, tais como o desvio da barreira hematoencefálica (BHE) e escapar a partir do cérebro do intrínseca mecanismos de defesa do sistema imunológico 10, nenhum dos quais se condensa em um ex vivo ou in vitro sistema. Assim, adequada e fiel em modelos in vivo são fundamentais para estudos de metástase cerebral. Um ensaio in vivo convencional metástase introduz células cancerosas por via de injecção na veia da cauda, o que leva a maioria das células para se alojar no pulmão. Lesões metastáticas cerebrais raramente são produzidos nestes modelos animais antes da morte causada pela carga de tumor nos pulmões 11. injecção intracerebral directa de células de cancro produz desenvolvimento de tumor consistente no SNC e é amplamente utilizada nos estudos de gliomas primárias. No entanto, such injecção compromete a certificação e provoca lesão traumática no local da injeção, ambos principais pontos de preocupação quanto à relevância fisiológica deste modelo. Outra via introdução de células de câncer freqüentemente usado, injeção intracardíaca, é fácil de administrar e não produz metástase experimental para o SNC. No entanto, as metástases simultâneas para outros do que o CNS sites de órgãos são sempre produzidos e pode causar a mortalidade de animais 11; por conseguinte, o elevado grau de variabilidade deste modelo torna-o inadequado para a avaliação quantitativa dos mecanismos biológicos ou agentes terapêuticos, com um número limitado de animais. Aqui nós descrevemos os procedimentos para produzir metástase cerebral experimental através da injeção de células cancerígenas na artéria carótida comum. Nós temos usado essa abordagem para dissecar as contribuições dos genes individuais para a cascata metastática de metástases cerebrais e para avaliar a eficácia da intervenção terapêuticas 12, 13. As principais vantagens desta abordagem são o elevado grau de reprodutibilidade e de baixo grau de variabilidade; A maior desvantagem é a sofisticação e habilidade necessário para executar a microcirurgia.

<table><tbody><tr><td>Solução de cloridrato de cetamina/cloridrato de xilazina</td> Estereomicroscópio de rotina <td>Sigma-Aldrich</td><td>K113</td><td></td></tr><tr><td>Leica M50</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>O microscópio é modular e altamente configurável para atender a requisitos de espaço específicos.</td></tr><tr><td>Escapo cirúrgico descartável</td><td>Integra Miltex</td><td>4-410</td><td>para fazer incisões na pele</td></tr><tr><td>Fórceps de Tecido - 1 x 2 Dentes</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>11021-12</td><td>para dissecar sem rodeios os mucos</td></tr><tr><td>Dumont #5 - Fórceps com Acabamento Espelhado</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>11252-23</td><td>para separar e preparar a artéria carótida para injeção</td></tr><tr><td>Tesoura de Mola</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>15025-10</td><td>para cortar suturas</td></tr><tr><td>EZ Clip Kit</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>para cloure de ferida</td></tr><tr><td>Seringa de insulina BD</td><td>Becton Dickinson</td><td>328438</td><td>para injeção de células</td></tr><tr><td>Sistema de imagem IVIS Spectrum In Vivo</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr></tbody></table>

intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Metástase, a propagação e crescimento de células malignas em locais secundários dentro do corpo do paciente, representa&gt; 90% da mortalidade relacionada ao câncer. Recentemente, avanços impressionantes em novas terapias têm prolongado significativamente a sobrevivência e melhor qualidade de vida para muitos pacientes com câncer. Infelizmente, a incidência de cérebro recorrências metastáticas está a aumentar rapidamente, e todas as terapias atuais são apenas paliativos. Assim, bons modelos animais experimentais são urgentemente necessárias para facilitar os estudos em profundidade da biologia da doença e avaliar novos regimes terapêuticos para a avaliação pré-clínica. No entanto, o padrão no ensaio de metástases in vivo por via de injecção na veia da cauda de células cancerosas produz predominantemente lesões metastáticas do pulmão; animais costumam sucumbir à carga tumoral pulmonar antes de qualquer crescimento significativo de metástases cerebrais. Intracardíaca injecção de células tumorais produz lesões metastáticas para locais múltiplos órgãos, incluindo o cérebro; No entanto, o variabidade do crescimento do tumor produzidos com este modelo é grande, amortecendo a sua utilidade na avaliação de eficácia terapêutica. Para gerar modelos animais fiáveis e consistentes para o estudo metástase cerebral, aqui descrevemos um procedimento para produzir metástase cerebral experimental na casa do rato (Mus musculus) através de injecção intracarotídeo de células tumorais. Esta abordagem permite que se produzem grande número de ratos metástase de sustentação do cérebro com características de crescimento e mortalidade semelhantes, facilitando assim os esforços de investigação para estudar mecanismos biológicos básicos e avaliar novos agentes terapêuticos.

Existem dois pontos em que a qualidade da injecção podem ser avaliadas. A primeira chance é pela observação do operador de mudar as cores dos vasos sanguíneos durante a injeção. Vazamento de injeções pobres pode ser facilmente observado sob o microscópio de dissecação. A colocação firme e segura do corpo do ratinho (Figura 1A) e da sua artéria carótida (Figura 1B) sobre a bola de algodão de suporte são factores críticos para injecção suave e bem sucedida...

Metástases cerebrais tornou-se uma necessidade médica não atendida urgente como a sua incidência tem aumentado enquanto as opções terapêuticas têm permanecido paliativos. Criando modelos animais experimentais de metástase cerebral através de injecção arterial intracarotídeo de células cancerosas facilita estudos sobre os mecanismos da biologia da doença e avaliação de novos regimes de intervenção.

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

O objetivo geral desta injeção microcirúrgica de células cancerígenas através da artéria carótida é produzir modelos experimentais consistentes de metástase cerebral in vivo em camundongos. Assim, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de metástase cerebral, como se um novo tratamento pode demonstrar eficácia no combate à metástase cerebral. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a obtenção de metástase cerebral experimental in vivo com alta reprodutibilidade e baixa variabilidade.Em geral, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades inicialmente, pois é necessária uma certa quantidade de prática para manter a mão firme ao injetar células cancerígenas na artéria carótida desses camundongos sob o microscópio. Inicie este procedimento semeando as células cancerígenas em meio DMEM F12 suplementado com 10% de FPS e cultivando-as por um a dois dias antes da injeção. No dia da cirurgia, remova as células do incubador e colete-as quando atingirem de 70% a 80% de confluência, lavando com meio sem soro.Em seguida, incubar as células com tripsina a 0,25% por um a dois minutos a 37 graus Celsius. Depois, removê-las do incubador e adicionar meio

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra a implantação de células tumorais no cérebro de camundongos realizando injeção intracraniana.

Modelo ortotópico intracraniano: um procedimento para implantar células cancerígenas no cérebro de camundongos

Este vídeo demonstra o estabelecimento de um modelo de camundongo com metástase cerebral por injeção intracarotídea de células cancerígenas marcadas com fluorescência. O modelo de camundongo pode ser usado para estudar os efeitos de novas terapêuticas e os mecanismos fisiológicos subjacentes.

Modelo de camundongo com metástase cerebral: um método para gerar o modelo de camundongo com metástase cerebral por injeção intracarotídea de células cancerígenas

Fonte: Lim, M., et al. Modelagem de metástases cerebrais por injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2022)Neste vídeo, um camundongo anestesiado é submetido a um procedimento cirúrgico no qual células cancerígenas são injetadas na artéria carótida comum (CCA) para facilitar a entrega direcionada ao cérebro. O procedimento envolve sutura e manipulação precisas das artérias carótidas para direcionar as células injetadas para a artéria carótida interna (ACI),...

Modelagem de metástase de tumor cerebral por meio de injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna

Um modelo do rato de mama câncer no cérebro metástase é estabelecida com ultra-som guiada por imagem injeção intracardíaca de células MDA-MB231/Br-GFP. Desenvolvimento de metástases intracranianas multifocais tem sido monitorada longitudinalmente usando alta resolução de 9.4 T MRI.

Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI

A modelagem da metástase cerebral intracraniana é complicada pela incapacidade de monitorar o tamanho do tumor e a resposta ao tratamento com métodos precisos e oportunos. A metodologia apresentada casais injeção de tumor intracraniano com análise de ressonância magnética, que, quando combinada, cultiva injeções precisas e consistentes, monitoramento animal aprimorado e medições precisas de volume de tumor.

Modelando metástases cerebrais através de injeção intracraniana e ressonância magnética

Descrevemos um modelo de metástase cerebral de câncer de mama em camundongos xenoenxerto gerada por injeção na veia caudal de uma linhagem de células inflamatórias de câncer de mama amplificadas endogenamente por HER2.

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. A maioria dos modelos de camundongos com metástases cerebrais é complicada por metástases sistêmicas que confundem a análise da mortalidade e os resultados da intervenção terapêutica. Apresenta-se aqui um protocolo para injeção carotídea interna de células cancerígenas que produz tumores intracranianos consistentes com tumores sistêmicos mínimos.

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Os tumores do sistema nervoso central (SNC) são a principal causa de morte relacionada ao câncer em crianças, e as terapias loco-regionais baseadas em imunidade estão sendo cada vez mais testadas para pacientes em ensaios clínicos. Este protocolo descreve métodos de implante de cânula locorregional em camundongos para avaliação pré-clínica de infusões imunoterápicas direcionadas a tumores do SNC.

Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos

O reparo da artéria intracarótida em um modelo de camundongo após a injeção retorna o fluxo sanguíneo para a artéria sem afetar negativamente a distribuição do material injetado. O reparo no local da injeção facilita as injeções subsequentes através da mesma artéria e previne a isquemia cerebral em cepas de camundongos que não possuem um Círculo de Willis completo.

Facilitando injeções intracarotídeas repetidas em modelos de camundongos por uma nova técnica de reparo no local da injeção

Este manuscrito fornece o procedimento detalhado de injeção de artéria intra-ilíaca (IIA), uma técnica para entregar células cancerígenas especificamente aos tecidos dos membros posteriores, incluindo ossos, para estabelecer metástases ósseas experimentais. Embora inicialmente estabelecido com modelos de tumor de mama, esse protocolo pode ser facilmente estendido a outros tipos de câncer.

Injeção Artéria Intra-ilíaca para eficiente e seletiva Modelagem de microscópico metástase óssea

Aprenda a técnica de injeção intracarotídea de células cancerígenas para criar modelos murinos de metástase cerebral com alta reprodutibilidade. Este método permite avaliar novas terapias e estudar a biologia das metástases cerebrais em neurociência e oncologia.

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

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