Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando episs�ica Vectors

O objetivo geral deste procedimento é gerar células iPS a partir de células mononucleares do sangue periférico humano adulto usando vetores epissómicos não integradores. Este protocolo pode ajudar os cientistas no campo das células-tronco que desejam gerar células iPS para monitoramento de doenças, triagem de drogas e radiomedicina regular. Nosso protocolo de reprogramação é muito simples, mas altamente eficiente.

Seguindo este procedimento, pode-se facilmente dominar a técnica de reprogramação de células sanguíneas. A qualidade do plasma é igualmente importante para uma reprogramação bem-sucedida. Os contaminantes podem diminuir a eficiência da reprogramação, portanto, recomendamos o uso de kits Endofree para purificar plasmídeos epissómicos.

As células iPS são mais frágeis do que outras células. A preparação de células para mais de uma durante a passagem do gene pode induzir mortes celulares maciças, em particular nas primeiras passagens. Para iniciar este procedimento, prepare todos os meios de cultura necessários de acordo com o manuscrito que o acompanha.

Em seguida, combine 10 mLs de amostra fresca de PB e dez mLs de tampão PBS em um tubo de 50 mL e misture bem. Leve o PBS à temperatura ambiente ou 37 graus Celsius antes de usar. Em seguida, adicione 10 mL de filo no fundo do tubo.

Este processo deve ser realizado lentamente para garantir que a camada de ficoll não se misture com o PB. Centrifugar a mistura a 400 x g durante 30 minutos com uma fraca aceleração e desaceleração. Após a centrifugação, os PB MNCs estão na camada branca localizada entre o plasma PB e o ficoll. Aspire lentamente 10 mL de plasma PB sem perturbar a camada de ficoll amarelada.

Em seguida, colha cuidadosamente a camada branca em um novo tubo de 50 mL. O volume total das células coletadas da camada branca deve ser de cerca de três a seis mL. Depois disso, adicione PBS para trazer o volume total para 30 mL e misture bem.

Em seguida, centrifugue a amostra a 400 x g durante dez minutos. Após dez minutos, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 20 ml de meio de cultura. Misturar bem e centrifugar a amostra a 400 x g durante cinco minutos para remover a maioria das plaquetas.

Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um a dois mL de IMDM. As células podem ser usadas para cultura imediata ou congeladas para uso posterior. Para criopreservação, adicione uma quantidade igual de meio de criopreservação.

Aliquota as células em criogeniais e transfira-as para um freezer de 80 graus Celsius imediatamente. Neste procedimento, prepare cinco mL de meio IMDM em um tubo de 15 mL. Descongele rapidamente os PB MNCs congelados em banho-maria a 37 graus Celsius antes de transferi-los para o tubo com meio IMDM.

Centrifugar a amostra a 400 x g durante cinco a dez minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em meio eritróide. Em seguida, conte as células ao microscópio usando um hemocitômetro.

Posteriormente, a cultura PB MNCs em uma cultura não tecidual tratou a placa de seis poços com dois mL de meio por poço a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono. Um dia três e um dia cinco, adicione um mL de meio eritróide fresco diretamente em cada poço sem alterar o meio. No sexto dia, colha PB MNCs para nucleofecção.

Um dia antes da nucleofecção, pré-revestir a cultura de tecidos tratada com seis poços com 0,1% de gelatina a 37 graus Celsius por 20 minutos. Descongele as células alimentadoras de MEF inativadas em banho-maria a 37 graus Celsius e transfira-as imediatamente para um tubo de 15 mL contendo cinco mL de meio MEF. Em seguida, centrifugue-os a 400 x g por cinco minutos e remova o sobrenadante.

Em seguida, remova a gelatina da placa de seis poços e ressuspenda o pellet celular em meio MEF. Em seguida, semeie as células MEF inativadas em dois mL de meio MEF em cada poço de uma placa de seis poços pré-tratada com gelatina e cultive-as a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. No dia da nucleofecção, aspire o meio MEF e substitua-o por um mL de meio eritróide.

Em seguida, pré-equilibre a placa de cultura por 10-30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. Adicione dois microgramas de PEV OCT4 a Sox2, um micrograma de PEV MYC, um micrograma de PEV KLF4 e 0,5 microgramas de PEV Bcl-XL em um tubo estéril de 1,5 mL. Aqueça o tubo a 50 graus Celsius por cinco minutos para evitar contaminação e depois resfrie-o até a temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 57 microlitros de tampão de nucleofecção e 13 microlitros de tampão de suplemento à amostra. Colher duas vezes dez elevado ao sexto PBMNCs cultivados para um tubo de cinco ml por centrifugação a 200 x g durante sete minutos. Depois disso, remova o sobrenadante e adicione a mistura de plasmídeo e tampão de nucleofecção ao pellet celular.

Em seguida, misture bem sacudindo o tubo com um dedo. Em seguida, transfira o DNA em suspensão celular para a cubeta fornecida pelo kit e tampe a cubeta. Selecione o programa U-008 no dispositivo de nucleofecção.

Em seguida, insira a cubeta no suporte e pressione OK. Depois, retire a cubeta do suporte. Adicione 0,5-1 mL de meio eritróide pré-aquecido a cada cubeta e transfira as células para a placa MEF pré-equilibrada imediatamente. Para algumas amostras, você pode obter milhares de colônias de um mil de sangue.

Se você deseja escolher uma única colônia para cultivo posterior, pode ser necessário semear um poço extra com apenas 1 milhão de células. Logo antes de colocar a câmara de hipóxia na incubadora, agite suavemente a câmara várias vezes para criar uma distribuição uniforme de células nos poços de cultura. Em seguida, transfira a placa para uma câmara de hipóxia.

Lave a câmara com um gás misturado por um a dois minutos a uma taxa de 20 litros por minuto. Em seguida, sele a câmara e cultive a amostra a 37 graus Celsius. No segundo dia após a nucleofecção, adicione dois mL de meio iPSC diretamente em cada poço.

No quarto dia após a nucleofecção, remova três mL de meio e adicione dois mL de meio iPSC fresco. Nesta fase, a maioria das células vivas se ligou à camada de alimentação. Após o sexto dia após a nucleofecção, troque o meio a cada dois dias, deixando 500 microlitros de meio gasto e adicionando dois mL de meio E8 fresco suplementado com butirato de sódio 0,25 milimolares até os dias 14-18.

Aqui é mostrado um esquema do protocolo para reprogramação de células sanguíneas periféricas. Esta imagem mostra o AP em pé na tigela, e esta mostra uma colônia típica de iPSC semelhante a ESC no dia 14 após a nucleofecção de PB MNCs. Aqui estão diagramas FACS representativos de iPSCs na passagem cinco expressando TRA-1-60 ou SSEA4.

Aqui estão as imagens confocais representativas de colônias iPSC expressando NANOG e OCT4. As imagens aqui mostram a coloração H & E do terratoma, compreendendo todas as três camadas germinativas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar células iPS livres de integração a partir de células mononucleares do sangue periférico humano.

Uma vez dominado, pode-se gerar grandes quantidades de células iPS em três semanas, portanto, o tempo prático será inferior a três horas. Desenvolvemos um sistema de vetor epissómico simples para uma reprogramação eficiente das células sanguíneas. Acreditamos que esse sistema acessível pode ser facilmente adotado, principalmente em pequenos laboratórios com recursos limitados.

Não se esqueça de que trabalhar com sangue e plasma humanos pode ser perigoso, e precauções devem ser tomadas, como usar luvas e jalecos durante a realização deste procedimento.