Name: Murino Transplante de pele de espessura total (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda o transplante de pele de espessura total em camundongos para estudar respostas aloimunes e rejeição de enxertos. Este método reprodutível permite monitorar a rejeição por inspeção direta sem necessidade de microcirurgia avançada.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01AI077610.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e foram aprovados pela Comissão de Johns Hopkins University animal Cuidado e Uso (JHUACUC). Os procedimentos específicos foram realizados sob a MO13M292 protocolos ACUC aprovado e MO13M370. 1. Donor Colheita da pele <ol><li> Anestesiar o rato doador com isoflurano (vaporizador de indução a 4%, manutenção a 1 - 2% através do cone mouse). Use o dedo retirada pitada reflexo para monitorizar a profundidade de anestesia. </li><li> Usando uma máquina de barbear, a barba do dorso do animal e desinfecção com 10% de iodo de povidona (por exemplo, Betadine). </li><li> Com uma tesoura estéril, luvas e técnica asséptica, colheita doador de pele de volta a partir do quadril para o pescoço, com dissecção romba ao nível do tecido conjuntivo areolar. </li><li> Eutanásia do animal por deslocamento cervical após a colheita daenxerto de pele. </li><li> Sob um microscópio, separar o tecido conjuntivo, tecido adiposo, e panículo carnoso da pele do dorso utilizando tesouras finas Tenotomia. O panículo carnoso é um músculo fino e transparente responsáveis ​​por movimentos espasmos pele. </li><li> Utilizando uma técnica estéril instrumentos, cortar enxertos de 15 mm x 15 mm a partir da pele de volta para uma de 10 mm x 10 mm para a cama enxerto de 15 mm x 15 mm. </li><li> Armazenar os enxertos em gazes impregnadas com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) numa placa de petri em gelo. NOTA: 8 - 10 enxertos pode ser obtido a partir de um rato dador. </li></ol> Transplante de pele 2. Destinatário <ol><li> Anestesiar o mouse destinatário com isoflurano (vaporizador de indução a 4%, manutenção a 1 - 2% através do cone mouse). Use o dedo retirada pitada reflexo para monitorizar a profundidade de anestesia. </li><li> Administrar 0,02 mg / kg de peso corporal de buprenorfina para o alívio da dor pós-operatória. </li><li> Raspar o lado das costas do animal, onde o wi enxertoll ser inserido e desinfectar com 10% de iodopovidona. </li><li> Com uma tesoura, corte de 10 mm x 10 mm a 15 mm x 15 mm quadrado de pele. O tamanho de defeito deve ser ligeiramente maior (10%) do que o enxerto. Corte o mais superficialmente possível. Tome cuidado para preservar o panículo carnoso e vasos. O panículo carnoso pode ser distinguida da fáscia subjacente por sua mobilidade e os vasos sanguíneos superficiais que executam a ele. </li><li> Posicionar o enxerto no leito de enxerto, evitando dobras ao longo das bordas. </li><li> Coloque 8 suturas nos cantos e no meio de cada borda. Para cada fio de sutura, a agulha passar através do enxerto e, em seguida, através do panículo carnoso do enxerto de leito inferior a pele circundante destinatário. </li><li> Retire a máscara de anestésico e deixar o animal recuperar parcialmente da anestesia antes de aplicar a bandagem adesiva. </li><li> Enrole o mouse destinatário em uma bandagem adesiva com gaze dobrada sobre o enxerto. Faça o curativo pela combinação de duas ataduras, cortandoa parte adesiva de um e colocando as duas almofadas absorventes em conjunto. </li><li> Monitorar o mouse de perto durante a recuperação para garantir que o curativo não está restringindo tórax excursão e respirar. Remover o curativo, se a taxa respiratória diminui ou o animal começa a ofegar ou respiração superficial. </li></ol> 3. Cuidados Pós-Operatórios <ol><li> Administrar enrofloxacina 5 mg / kg após a cirurgia para a profilaxia da infecção. </li><li> Posicione o mouse transplantado em uma gaiola limpa sobre uma almofada de aquecimento no forno até que se recupere totalmente da anestesia. </li><li> Observe o mouse por 1 hora de pós-operatório antes de retornar para a instalação de habitação. </li><li> Sete dias após a cirurgia, anestesiar o rato como no Passo 2.1. Remover o curativo, cortando apenas através do lado ventral do curativo. </li><li> Observar e palpar o enxerto no dia seguinte para sinais de formação de crostas, contração ou dureza. Se estiver presente, o enxerto pode não ter alcançado vasculariza adequadação e deve ser considerada uma falha técnica. </li><li> Monitorizar diariamente quanto a sinais de rejeição. Considere enxertos rejeitada quando ≥90% do tecido do enxerto torna-se necrótica. </li><li> Eutanásia dos animais rejeitados e colhê-las para análise. </li></ol>

<ol><li>Furtmuller, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+Hind+Limb+Transplantation+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Oh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Microsurgical+Model+for+Heterotopic%2C+En+Bloc+Chest+Wall%2C+Thymus%2C+and+Heart+Transplantation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
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<li>Pollizzi, K. N., Powell, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+canonical+and+metabolic+signalling+programmes+in+the+regulation+of+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses.</a> Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).</li>
<li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+immunity%3A+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342, 1242454(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Desde a sua introdução por Medawar, primeiro em estudos humanos e, em seguida, em coelhos e ratinhos, o transplante de pele tem sido um modelo de valor inestimável para o estudo das respostas imunitárias alogénicas 6,7. Neste artigo, apresentamos um modelo de grande escala, o transplante de pele não-vascularizado de espessura total com a pele para trás superior e inferior. Vários métodos alternativos, incluindo o uso da pele da cauda ou da pele da orelha de rato como fonte de tecido do enxerto, foram relatado...

O transplante de órgãos é o tratamento de escolha para pacientes com casos de insuficiência terminal de órgãos, e os resultados têm melhorado notavelmente com os avanços em procedimentos cirúrgicos e protocolos de imunossupressão. No entanto, a imunossupressão a longo prazo está associada a efeitos colaterais significativos, e o desenvolvimento de novas estratégias que promovem a tolerância continua a ser o objectivo da investigação moderna transplante. Numerosos modelos animais têm sido desenvolvidos para a pesquisa básica em transplante, para estudar os mecanismos da rejeição do enxerto e para testar se aproxima de imunossupressão para a prevenção da rejeição de enxertos e para promover a tolerância a longo prazo 1-3. mouse modelos tornaram-se o esteio da pesquisa imunológica devido à disponibilidade exclusiva e vasta de anticorpos diagnósticos e terapêuticos e estirpes puras e transgênicas bem definidas. transplante de pele é um procedimento simples que não requer habilidades especiais de microcirurgia e podeser facilmente monitorizado no pós-operatório. Tomados em conjunto, o transplante de pele de ratinho tem sido uma ferramenta excepcional para estudar muitos aspectos envolvidos na resposta aloimune, incluindo a entrega de antigénio, o tráfico de células, e a destruição do tecido durante a rejeição de enxerto de 4,5. Aqui, mostramos o procedimento passo-a-passo para o transplante de pele de espessura total utilizando o modelo de rato, e descrevemos as etapas importantes necessárias para um enxerto bem-sucedida da pele transplantada.

<table><tbody><tr><td>Micro pinça reta</td><td>Sigma</td><td>F4017</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinça curva</td><td>Aesculap</td><td>BD333R</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de tenotomia Stevens curva</td><td>Aesculap</td><td>BC905R</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação Mayo</td><td>Sigma</td><td>S3146</td><td></td></tr><tr><td>Micro porta-agulha</td><td>Aesculap</td><td>BM563R</td><td></td></tr><tr><td>Gaze estéril</td><td>Covidien</td><td></td><td></td>441218</tr><tr><td>6-0 Sutura de Nylon</td><td>MWI</td><td>31849</td><td></td></tr><tr><td>Tira de Plástico Banda&#45; Ajuda</td><td>Johnson & Johnson</td><td></td><td>Obtido da farmácia</td></tr><tr><td>10 cm Placa de Petri</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Qualidade Biológica</td><td>119069131</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td>Número DEA necessário; Obtido da farmácia hospitalar</td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Bayer Health Care</td><td>186599</td><td></td></tr></tbody></table>

murino transplante de pele de espessura total

Murine Full-thickness Skin Transplantation

O transplante de pele de espessura total de murino é um modelo bem estabelecido para o estudo in vivo de resposta aloimune e rejeição de enxerto. Apesar da sua aplicação limitada a seres humanos, o transplante de pele em ratinhos tem sido amplamente utilizada para a pesquisa em transplantes. O procedimento é fácil de aprender e executar, e não requer técnicas de microcirurgia delicada, nem treinamento extensivo. Além disso, a rejeição do enxerto neste modelo ocorre em uma reacção imunológica muito reprodutível e é facilmente monitorizado por inspecção e palpação directa. Além disso, o transplante de pele secundário combinados com enxertos de pele de doadores ou de terceiros pode ser realizada em modelos de transplante mais complexos como um método alternativo e simples para avaliar a tolerância específica do dador. As complicações são baixos e são, em geral, limitado a uma overdose de anestesia ou angústia respiratória após o procedimento. falha do enxerto, por outro lado, ocorre geralmente como um resultado da má preparação da Grpopa, posicionamento incorreto no leito do enxerto, ou posicionamento inadequado de o curativo. Neste artigo, apresentamos um protocolo para o transplante de pele de espessura total em ratos e descrever os passos importantes necessários para o sucesso do procedimento.

A colocação do curativo sobre o mouse destinatário é um passo importante do processo. O enxerto de pele é posicionada no tronco recipiente, entre o ombro, anca e espinha (Figura 1). A ligadura é feita com gaze dobrada e a combinação de duas ataduras adesivas de plástico. O rato receptor é colocado com o enxerto para baixo sobre a gaze sobre o centro da ligadura. Usando dois micro pinças curvas, a extremidade inferior da ligadura é primeiro removido, e em seguida, a parte...

transplante de pele de espessura total murino é um modelo bem estabelecido para estudar a rejeição em um ambiente alloimmune. Aqui, nós fornecemos um tutorial de cada etapa envolvida na realização de um / c BALB -&gt; C57BL / 6 transplante de pele de espessura total.

Murino Transplante de pele de espessura total

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

O objetivo geral deste artigo em vídeo é realizar um transplante de pele com espessura total e descrever os passos importantes necessários para um procedimento bem-sucedido. O transplante de pele com espessura total em camundongos é um modelo bem estabelecido para estudar respostas aloimunes e rejeição de enxerto. O procedimento é fácil de executar e não requer técnicas microcirúrgicas delicadas.A rejeição do enxerto, neste modelo, ocorre como uma reação imunológica altamente reprodutível e pode ser facilmente monitorada por inspeção direta e palpação. Além disso, transplantes cutâneos secundários com enxertos de pele compatíveis com o doador ou de terceiros podem ser realizados para modelos de transplante mais complexos, como um método alternativo e simples para avaliar a tolerância específica ao doador. Após anestesiar um camundongo doador de acordo com o protocolo descrito, utilize uma máquina de cortar cabelo elétrica para raspar as costas do animal.Além disso, com iodo-povidona a 10%, desinfete a pele. Usando tesoura e dissecação romba, retire a pele dorsal do doador do quadril até a nuca ao nível do tecido conjuntivo areolar. Coloque a pele dorsal sob um microscópio e use tesoura fina de tenotomia para separar o tecido conjuntivo e o pânico carnoso da pele.Recorte enxertos de 15 por 15 milímetros da pele das costas para um leito de enxerto de 10 por 10 a 15 por 15 milímetros. Armazene os enxertos em gaze embebida com PBS em uma placa de Petri e coloque-a sobre gelo. Anestesie o camundongo receptor de acordo com o protocolo descrito no texto.Apare a lateralidade das costas do animal, onde o enxerto será inserido, e administre então 0,02 miligramas por quilograma de buprenorfina para alívio da dor pós-operatória. Utilize 10% de povídona-iodo para desinfetar a área. Com tesoura, e de forma o mais superficial possível, corte um quadrado de pele de 10 por 10 a 15 por 15 milímetros.Tenha cuidado para preservar o pânico carnoso e os vasos sanguíneos que correm superficialmente a ele. Em seguida, posicione o enxerto sobre o leito do enxerto, evitando dobras nas bordas. Depois, coloque oito suturas nos cantos do enxerto e na metade de cada borda, passando a agulha através do enxerto e, em seguida, através do pânico carnoso do leito do enxerto, abaixo da pele receptora circundante.Coloque uma gaze dobrada sobre uma atadura dobrada e, em seguida, posicione o animal sobre a atadura, com o lado do enxerto voltado para baixo, removendo a máscara anestésica para permitir que o animal se recupere parcialmente. Em seguida, enrole a atadura ao redor do animal. O fator mais crítico no processo de enxertia é a revascularização do tecido enxertado pelo crescimento de vasos do hospedeiro em direção ao enxerto.A dissecação do pânico carnoso e a colocação correta do curativo são os passos mais importantes. Imediatamente após a cirurgia, administre 5 miligramas por quilograma de enrofloxacina para profilaxia contra infecção. Coloque o camundongo transplantado em uma gaiola limpa até que se recupere completamente da anestesia.Observe o camundongo por uma hora após a cirurgia, antes de devolvê-lo ao alojamento. Monitore cuidadosamente o camundongo durante a recuperação para garantir que o curativo não esteja restringindo a excursão torácica e a respiração. Oito dias depois, observe e palpe o enxerto em busca de sinais de crostas, contração ou endurecimento.Se algum desses sinais estiver presente, o enxerto pode não ter alcançado uma vascularização adequada e deve ser considerado uma falha técnica. Monitore o enxerto diariamente quanto aos sinais de rejeição. Considere os enxertos rejeitados quando maior ou igual a 90% do tecido do enxerto se tornar necrótico.Em modelos de incompatibilidade completa, enxertos de pele de espessura total geralmente são rejeitados em oito a 12 dias. Em modelos de incompatibilidade menor, as respostas de rejeição são mais lentas, mais variáveis, e a aparência do enxerto de pele é caracterizada por alterações menos nítidas, como contração ou perda de pelos. A rejeição aguda do enxerto geralmente começa com inchaço e eritema do enxerto.Esses eventos são seguidos por dessecação do enxerto, formação de crosta e retração, conforme observado aqui. Dependendo do grau de incompatibilidade de MHC e do protocolo de imunossupressão, a rejeição pode ocorrer por um processo subagudo marcado por alterações sutis, como perda de pelos, pigmentação, sulcos dérmicos e volume do enxerto. Nessas situações, um enxerto rejeitado apresenta-se brilhante, branco e sem pelos, com bordas irregulares.Usando camundongos BALB/c como doadores e C57 black 6 como receptores, observou-se que a inibição da glicólise e da fosforilação oxidativa, ou do metabolismo da glutamina isoladamente, prolongou a sobrevida do enxerto de pele. No entanto, bloquear simultaneamente os três caminhos metabólicos resultou em aumento significativo da sobrevida do enxerto. Além disso, a terapia metabólica tripla foi mais eficaz do que a ciclosporina convencional ou a rapamicina.Além disso, a histologia dos enxertos de pele do grupo com terapia metabólica exibiu um alinhamento tecidual mais preservado e menor infiltrado inflamatório linfocítico, em comparação com o tecido não tratado. Os resultados dos transplantes de órgãos melhoraram significativamente com os avanços nos procedimentos cirúrgicos e nos protocolos de imunossupressão. No entanto, a imunossupressão de longo prazo está associada a efeitos colaterais significativos, e novas estratégias que promovam tolerância continuam sendo o objetivo da pesquisa moderna em transplantes.Sabe-se bem da importância do metabolismo na regulação dos linfócitos T. Ao inibir a glicólise, a fosforilação oxidativa e o metabolismo da glutamina, fomos capazes de aumentar significativamente a sobrevida do aloenxerto. Essa abordagem inovadora foi mais eficaz do que a terapia convencional e representa uma mudança de paradigma na abordagem potencial da regulação imunológica e do transplante.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Transplante alogênico de pele é um modelo padrão para ensaio de anfitrião respostas das células T aos antígenos MHC-díspares doador. Este vídeo-artigo fornece um tutorial visual de cada etapa envolvida na realização de um transplante de BALB/c--&gt; C57BL / 6 da pele.

Transplante de pele murinos

Neste relatório, nós descrevemos a pele tridimensional reconstruir modelo que imita a pele humana em arquitetura e composição. Fisiologia dos melanócitos, a progressão de melanoma eo destino de células-tronco dérmica foram investigados usando a pele reconstruir modelo. O modelo também é útil como uma ferramenta de pré-clínicos para avaliação de drogas.

A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Este vídeo demonstra um método para enxertar pele humana em um camundongo imunodeficiente com uma resposta de neutrófilos suprimida. O método envolve a aplicação de pele humana de espessura dividida no leito do enxerto do camundongo, selando-o e cobrindo-o para recuperação. Eventualmente, a pele humana adere à pele do camundongo, estabelecendo vascularização e circulação, resultando em um xenoenxerto cutâneo bem-sucedido.

Uma técnica para enxerto de pele humana em um modelo de camundongo

A vascularização é essencial para abordagens de engenharia de tecidos bem sucedida. Portanto, tecnologias confiáveis ​​são necessários para avaliar o desenvolvimento de redes vasculares em tecido construções. Aqui apresentamos um método simples e de baixo custo para visualizar e quantificar a vascularização in vivo.

A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

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O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

Durante o desenvolvimento dos mamíferos, as feridas cutâneas gestacionais precoces cicatrizam sem cicatriz. Aqui, detalhamos um modelo confiável e reprodutível de cicatrização de feridas sem cicatrizes fetais no dorso cutâneo de embriões de camundongos E16.5 (sem cicatrizes) e E18.5 (cicatrizes).

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O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo murino de cicatrização de feridas queimadas. Uma queimadura térmica foi induzida na pele dorsal de camundongos usando um modelo de latão pré-aquecido. Tecido queimado foi desbridado e sobreposto com um enxerto de pele colhido da cauda de um rato doador geneticamente semelhante.

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O presente artigo descreve uma técnica modificada para transplante cardíaco vascularizado heterotópico com técnica asséptica atualizada, analgesia e anestesia.

Protocolo de transplante cardíaco heterotópico murino modificado que atende aos padrões contemporâneos de técnica asséptica, anestesia e analgesia

Apresentamos um modelo reprodutível de camundongo de alotransplante composto vascularizado de membros posteriores para pescoço, heterotópico. Esse protocolo supermicrocirúrgico, envolvendo anastomoses de vasos de 0,3 a 0,5 mm, integra guiagem com filamento de náilon e algemamento venoso. Ela oferece uma plataforma confiável para estudos translacionais sobre tolerância, lesões por isquemia-reperfusão e mecanismos imunológicos em alotransplante composto vascularizado.

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