Name: O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões Na Vivo Modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede Interações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda metodologia in vivo para caracterizar vias de sinalização e redes reguladoras de genes em embriões de invertebrados. Esta abordagem sistemática revela interações complexas que direcionam processos de desenvolvimento.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Robert Angerer por sua cuidadosa leitura e edição do manuscrito. O NIH R15HD088272-01, bem como o Escritório de Pesquisa e Desenvolvimento e o Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Estadual do Mississippi, forneceram apoio para este projeto ao RCR.

1. Rendimento Morpholino Estratégia de alto design <ol><li> Identificar um gene (s) de interesse (por exemplo, abordagem do gene candidato, análise de cis-regulatórias, RNA-Seq e ou telas diferenciais / proteômica). </li><li> Use genômica, transcriptomic, e dados de expressão de genes disponíveis em sites atualizados com freqüência (por exemplo SpBase http://www.echinobase.org 20 e S. purpuratus Genome Pesquisa http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) para determinar se o perfil de expressão espaço-temporal sobrepõe-se com o mecanismo de desenvolvimento em questão. Se não houver dados disponíveis expressão é, em seguida, gerar iniciadores qPCR e / ou um anti-sentido na sonda in situ para avaliar o padrão de expressão do gene. </li><li> Depois de determinar o padrão de expressão espacial e temporal, obter a sequência de DNA a partir dos sites genômicos. <ol><li> Para a geração de oligonucleótidos morfolino-tradução de bloqueio, obter sequência óf a &quot;região não-traduzida (5 &#39;5 UTR) directamente a montante do codão de iniciação de expresso Sequence Tag (EST) bases de dados disponíveis no SpBase ou S. purpuratus Genoma sites de busca. Se esta informação não está disponível para o gene de interesse, em seguida, executar 5 &#39;RACE. </li><li> Para projetar um morfolino-blocking emenda, procure a seqüência genômica incluindo os exons e introns usando a ferramenta de andaime BLASTN em SpBase ou S. purpuratus Genome ferramenta de busca. </li></ol></li><li> Use o site oligonucleotídeo concepção http://oligodesign.gene-tools.com a fim de projetar a sequência par morfolino 25 base desejada. <ol><li> Para um bloqueio de morfolino-translacional, utilizar a sequência de ARNm a partir de 5 &#39;para 3&#39; como a fonte da sequência alvo de translação. Incluir sequência a 5 &#39;UTR (cerca de 70 nucleótidos a montante do sítio do início da transcrição), mais 25 bases da região de codificação (a jusante do local de início) com o codão de iniciação Wi acentuadath parênteses (ATG). </li><li> Para um bloqueio de morfolino-splicing, seleccionar intrão-exão ou uma sequência de fronteira exão-intrão e incluem 50 bases (25 bases da sequência de exão e 25 bases da sequência do intrão) em torno das regiões de fronteira. Digitalizar o genoma com a sequência morfolino para verificar que a sequência é única. </li></ol></li></ol> 2. A microinjecção de morfolino oligonucleótidos <ol><li> Prepare 3 soluções de mM dos oligonucleï¿½idos morfolino pela adição de 100 mL de água livre de nuclease para dentro do frasco morfolino 300 nmol. NOTA: Não use DEPC água tratada para a re-suspensão porque dietilpirocarbonato pode danificar o morfolino. </li><li> Para a primeira rotação reconstituição sobre o frasco contendo a solução de oligonucleótido durante 30 s à velocidade máxima (14000 - 16000 xg), vortex brevemente, aquece-se a 65 ° C durante 5 a 10 min, vortex brevemente, e manter o estoque morfolino no quarto temperatura durante pelo menos 1 h. solução de morfolino<html> s são armazenados de -20 ° C a 4 ° C. </li><li> Preparar a solução de injecção contendo oligonucleótidos morfolino na concentração desejada. Esta solução normalmente contém 20% de glicerol ou KCl 125 mM como um transportador e 15% de FITC-Dextrano (isotiocianato de f luoresceina de dextrano 10.000 MW de 2,5 mg Solução de estoque / mL). outros conjugados de dextrano fluorescente FITC-Dextrano e são rotineiramente usadas para identificar embriões injectados por microscopia de epifluorescência. soluções para injecção armazenar a -20 ° C. </li><li> Aquece-se a solução de morfolino a 65 ° C num bloco de aquecimento ou banho de água, durante pelo menos 2-5 minutos. </li><li> Resumidamente girar a solução de morfolino por 30 s em velocidade máxima (14000 - 16000 xg), vortex durante 1 min e centrifuga-se a toda a velocidade (14.000 - 16.000 xg) durante pelo menos 10 min. </li><li> Coloque as agulhas de injecção com a solução morfolino. Para um protocolo de microinjeção detalhadas, por favor consulte Stepicheva e Song, 2014 21 e Felicidades e Ettensohn de 2004&quot;&gt; 22. </li></ol> 3. Fixação e in situ Protocolo às 24 horas pós-fertilização (hpf) em S. purpuratus Embriões NOTA: Este protocolo é modificado a partir Arenas-Mena et al. , 2000 23 e Sethi et ai. De 2014 24. <ol><li> Fixação <ol><li> Adicione algumas gotas de fixador (veja abaixo) para poços contendo embriões, misture delicadamente por pipetagem, e permitir-lhes para resolver. Remover a solução fixadora, e, em seguida, misturar embriões com duas lavagens de 180 ul adicionais de fixador. NOTA: É importante para misturar completamente os embriões durante as lavagens por pipetagem suave para cima e para baixo várias vezes. Não fazer isso pode reduzir a relação sinal-ruído. </li><li> Deixar os embriões para fixar na segunda lavagem fixador durante 50 min a 1 h à temperatura ambiente (TA) em paraformaldeído grau de microscopia electrónica de 4% que consiste em MOPS 10 mM, pH 7,0, 0,1% de Tween-20, e artificial seawateR (ASW). Faça esta solução fresca de cada vez para obter melhores resultados. Além disso, para facilidade e praticidade embriões foram fixados em placas de 96 poços. <ol><li> Para 20 mL de utilização fixador 5 mL de 16% de paraformaldeído, 15 mL ASW, 200 mL 1 M de MOPS pH 7,0, e 20 uL de Tween-20. </li></ol></li><li> Lavar 5 vezes à temperatura ambiente com 180 ul de MOPS tampão de lavagem consistindo em MOPS 0,1 M pH 7,0, NaCl 0,5 M e 0,1% de Tween-20 durante pelo menos 5 min ou até que os embriões cair para o fundo do poço. Mais uma vez, é importante para misturar bem os embriões para o tampão de lavagem cuidado pipetando para cima e para baixo várias vezes. MOPS tampão de lavagem pode ser utilizado para 2 dias se armazenado a 4 ° C. <ol><li> Para 40 mL de MOPS lavar utilização tampão 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 mL de 5 M de NaCl, 32 mL de dH2O e 40 ul de Tween-20. </li><li> Embriões fixos pode ser armazenado a 4 ° C durante 2 dias. NOTA: Se o armazenamento de embriões fixos mais, em seguida, adicionar 0,2% de azida de sódio em MOPS tampão de lavagem para impedir o crescimento bacteriano.</li></ol></li></ol></li><li> Pré-hibridação <ol><li> Aspirar as MOPS tampão de lavagem e adicionar 180 uL de uma proporção de 2: 1 de tampão de lavagem para MOPS tampão de hibridação, mistura embriões para dentro da solução por pipetagem suave várias vezes, e incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente. tampão de hibridação constituída por formamida a 70%, MOPS 0,1 M pH 7,0, NaCl 0,5 M, 1 mg / mL de BSA e 0,1% de Tween-20. <ol><li> Para 40 mL de tampão de hibridação utilização 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 mL de NaCl 5 M, 4 mL de dH 2 O, 0,04 g de BSA, e 40 uL de Tween-20. Misture bem num vórtice, e adicionar 28 ml de formamida, e novamente vórtice. </li></ol></li><li> Remover a relação de 2: 1 de MOPS lavar e tampões de hibridação e adicionar 180 uL de uma proporção de 1: 2 de MOPS tampão de lavagem de tampão de hibridação, mistura embriões para dentro da solução, e incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Antes de hibridação com sonda de misturar suavemente embriões em 100 - 150 ul de tampão de hibridação. Incubar os embriões a 50 ° C durante pelo menos 1h. NOTA: A incubação de embriões durante a noite é aceitável. Antes da incubação, os poços de selar com uma folha adesiva, a fim de evitar a evaporação. </li></ol></li><li> hibridização <ol><li> Num tubo separado adicionar 0,1-0,3 ng / mL de sonda e 500 ug / mL de ARNt de levedura em tampão de hibridação, seguida de vórtice suavemente para criar solução de sonda. ARNt de levedura é adicionada à solução de sonda para diminuir a ligação não específica da sonda anti-sentido. Pré-aqueça esta solução a 50 ° C e tampão de hibridação aspirado. </li><li> Misture embriões pré-hibridados em 100 mL da solução de sonda, selar com uma folha adesiva, e hibridar a 50 ° C durante 2 a 7 dias dependendo da sonda (sonda foxq2 podem ser incubadas durante 2 dias). NOTA: Os tempos de incubação varia com base fora da sonda. Alguns genes expressos em níveis baixos requerer até um período de incubação de 7 dias. placas de 96 poços pode ser colocado em uma caixa de umidade como um seguro contra a evaporação se os ADHESfolha ive não selar corretamente. </li><li> Lavagem de 5 vezes a 50 ° C com 180 ul de MOPS recém-preparadas tampão de lavagem para um total de 3 h. Em seguida, lavar 3 vezes (15 min) com 180 uL de tampão de MOPS lavar à TA. Lembre-se de misturar os embriões para o tampão de lavagem a cada vez com cuidado pipetando várias vezes. </li></ol></li><li> incubação de anticorpos <ol><li> Aspirar as MOPS tampão de lavagem e misturar embriões em 180 uL de tampão de bloqueio que consiste em 10% soro de ovelha normal e 5 mg / mL de BSA em MOPS tampão de lavagem e incubar durante pelo menos 45 min à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite. </li><li> Remover o tampão de bloqueio e, em seguida, misturar embriões em tampão contendo um bloqueio 1: 1500 de diluição de anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina diluído em tampão de bloqueio. Incubar durante a noite à temperatura ambiente numa placa selada para evitar a evaporação. NOTA: Não deixe de anticorpos em mais do que durante a noite. </li><li> Lavar embriões 6 vezes (5 min ou até que os embriões gota) em MOPS tampão de lavagem à temperatura ambiente. embriões podemser armazenado durante a noite a 4 ° C. </li></ol></li><li> No desenvolvimento in situ <ol><li> Lavar os embriões 3 vezes (10 min) à temperatura ambiente com tampão acabado de fazer pH 9,5 constituído por Tris 0,1 M pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM, Levamisol 1 mM e 0,1% de Tween-20. <ol><li> Para 20 mL de tampão de pH 9,5 utilização 2 mL de 1 M de Tris pH 9,5, 400 ul de NaCl 5 M, 1 mL de 1 M de MgCl2, 20 uL de Tween-20, 16,6 ml de dH2O, e 0,0048 g Levamisol. </li></ol></li><li> Incubar os embriões a 37 ° C em tampão de coloração protegida da luz. Tampão de Coloração consiste de 10% de dimetil formamida, 4,5 mL / mL de 4-nitro cloreto de azul de tetrazólio (NBT) e 3,5 uL / ​​mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) em recém-feitos tampão de pH 9,5 . <ol><li> Para 1 mL de tampão de coloração utilizar 100 mL de dimetilformamida, 4,5 mL de NBT e BCIP 3,5 mL. </li></ol></li><li> Parar a reacção com fosfatase alcalina de lavagem de 3 a 5 vezes em tampão MOPS lavar. O wi reaçãoth da sonda foxq2 tipicamente leva cerca de 30 min a 1 h. Algumas sondas podem necessitar de incubação durante a noite a RT, quer ou 4 ° C. </li><li> Misture embriões em uma solução de lavagem de MOPS 70% e 30% de glicerol. O glicerol proporciona um índice de refracção necessárias para microscopia. Os embriões podem ser armazenados nesta solução por várias semanas. Selar as placas com parafina de plástico para evitar a evaporação. </li></ol></li><li> Preparação da lâmina e captura de imagem <ol><li> Prepare um slide, organizando três pequenas tiras de fita dupla face em um triângulo com pequenos intervalos entre as tiras numa lâmina. </li><li> Transferir os embriões na lavagem MOPS 70% e solução de glicerol a 30% para o centro do triângulo e cobrir com uma lamela. </li><li> Selar a lamela por aplicação de uma camada de unha polonês em torno das arestas da lamela. </li><li> Capturar imagens usando um microscópio composto luz com um objetivo 20X e uma câmera acoplada. </li></ol></li></ol>

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<li>Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+hedgehog+signaling+to+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin.</a> Dev Biol. 411, 314-324 (2016).</li>
<li>Rottinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signals+guide+migration+of+mesenchymal+cells%2C+control+skeletal+morphogenesis+%5Bcorrected%5D+and+regulate+gastrulation+during+sea+urchin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development.</a> Development. 135, 353-365 (2008).</li>
<li>Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+requires+motile+cilia+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin.</a> Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).</li>
<li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cnidaria.+Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology.</a> Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).</li>
<li>Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Wnt-Nodal+Signals+Regulate+the+Patterning+of+Anterior+Neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.</a> PLoS Genet. 12, e1006001(2016).</li>
<li>Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+and+BMP2%2F4+signaling+organizes+the+oral-aboral+axis+of+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo.</a> Dev Cell. 6, 397-410 (2004).</li>
<li>Bradham, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+neural+but+not+axial+development+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos.</a> Dev Biol. 328, 221-233 (2009).</li>
<li>Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+for+ectoderm+specification+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).</li>
<li>Lin, C. Y., Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+sea+urchin+embryos+by+using+a+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system.</a> Dev Biol. 409, 420-428 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A metodologia aqui apresentada é um exemplo que ilustra o poder de usar embriões com menos complexidade genômica e morfológica de vertebrados para compreender as vias de transdução de sinalização e GRNs regem mecanismos de desenvolvimento fundamentais .. Muitos laboratórios estão usando ensaios semelhantes durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar cedo para dissecar o vias envolvidas em outros eventos de especificação destino de sinalização celular (por exemplo, Notch, Hedgehog, TGF-β, e FGF sinalização) <sup ...

redes de genes reguladores (GRNs) e vias de transdução de sinal estabelecer a expressão espacial e temporal dos genes durante o desenvolvimento embrionário que são usados ​​para construir o plano de adulto corpo do animal. Célula-a-célula vias de transdução de sinal são componentes essenciais destas redes reguladoras, que proporciona os meios pelos quais as células comunicam. Estas interacções celulares estabelecer e aperfeiçoar a expressão de genes reguladores e diferenciação dentro e entre os vários territórios durante a embriogênese 1, 2. Interações entre os moduladores secretadas extracelulares (ligantes, antagonistas), receptores e co-receptores controlar as atividades de vias de transdução de sinal. Uma variedade de moléculas intracelulares transduz estas entradas resultando na expressão alterada do gene, divisão, e / ou a forma de uma célula. Enquanto muitas das moléculas-chave utilizadas nos níveis extracelulares e intracelulares nas vias principais sãoconhecido, é um conhecimento incompleto, devido em grande parte à complexidade das vias de sinalização individuais. Além disso, diferentes vias de sinalização, muitas vezes interagem uns com os outros, positivamente ou negativamente na extracelular, intracelular, e os níveis de transcrição de 3, 4, 5, 6. É importante ressaltar que os principais componentes de vias de transdução de sinal são altamente conservadas em todas as espécies de metazoários, e, curiosamente, a maioria das principais vias de sinalização, muitas vezes executar funções de desenvolvimento semelhantes em muitas espécies quando se comparam os organismos de filos intimamente relacionados, em especial, 7, 8, 9, 10, 11. O estudo da sinalização durante o desenvolvimento é uma tarefa difícil em qualquer organismo, e hávários desafios significativos para estudar vias de sinalização na maioria dos modelos deuterostomia (vertebrados, cordados invertebrados, hemichordates, e equinodermes): 1) Em vertebrados há um grande número de possíveis ligandos e as interacções receptor / co-moduladores, moléculas de transdução intracelular, bem como potenciais interacções entre diferentes vias de sinalização, devido à complexidade do genoma de 12, 13, 14; 2) A morfologia complexa e movimentos morfogenéticos em vertebrados muitas vezes tornam mais difíceis de interpretar as interações funcionais em e entre vias de transdução de sinal; 3) As análises na maioria dos não-equinodermos espécie modelo de invertebrados deuterostomia são limitados por janelas curtas de gravidity com exceção de algumas espécies de tunicados 15, 16. oouriço-do-mar embrião tem algumas das limitações acima mencionadas e oferece muitas qualidades únicas para a realização de uma análise detalhada das vias de transdução de sinal in vivo. Estes incluem o seguinte: 1) A relativa simplicidade do genoma do ouriço-do-mar reduz significativamente o número de possíveis do ligando, do receptor / co-receptor e molécula de transdução intracelular interacções 17; 2) Os GRNs que controlam a memória descritiva e modelação das camadas germinativas e grandes eixos embrionários são bem estabelecida em embriões de ouriço-do-mar, auxiliando na compreensão do contexto regulamentar da célula / território receber os sinais 18, 19; 3) Muitas vias de transdução de sinal podem ser estudadas entre as fases de clivagem e de gástrula inicial quando embriões consistem de um único epitélio em camadas cuja morfologia é mais fácil de analisar; 4) As moléculas envolvemd nas vias de sinalização nas ouriços do mar são facilmente manipulados; 5) Muitas ouriços do mar estão grávidas de 10 a 11 meses por ano (por exemplo, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus). Aqui, apresentamos um método para caracterizar de forma sistemática e eficiente componentes das vias de sinalização que especificam e territórios padrão em embriões de ouriço-do-mar para ilustrar as vantagens que vários sistemas modelo de invertebrados oferecem no estudo dos mecanismos moleculares complexas.

<table><tbody><tr><td>Morfolino bloqueador translacional e/ou morfolino bloqueador de emenda</td><td>Gene Tools LLC</td><td>Personalizado Mais</td><td>informações em www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>FITC (isotiocianato de fluoresceína dextrano)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D1821</td><td>Faça 25 mg/mL solução estoque</td></tr><tr><td>Paraformaldeído 16% solução EM</td><td>Grade Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23336-0010</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Levedura tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cabra Normal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina</td><td>Roche</td><td>11 093 274 910</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de tetramisol (levamisol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris UltraPure</td><td>Research Products Internationall Corp</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>BCIP (5-Bromo-4-Cloro-3-indolil-fosfato</td><td>Roche</td><td>11 383 221 001</td><td></td></tr><tr><td>4 Nitro cloreto de tetrazólio azul (NBT)</td> <td>Roche</td><td>11 383 213 001</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Formamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

o poder da simplicidade: sea urchin embriões<em&gt; na vivo</em&gt; modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede interações

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Notavelmente, poucas vias de transdução de sinal célula a célula são necessárias durante o desenvolvimento embrionário para gerar a grande variedade de tipos de células e tecidos na forma do corpo adulto. No entanto, a cada ano, mais componentes de vias de sinalização individuais são descobertos, e estudos indicam que, dependendo do contexto, há uma conversa cruzada significativa entre a maioria dessas vias. Essa complexidade torna o estudo da sinalização célula a célula em qualquer sistema de modelo de desenvolvimento in vivo uma tarefa difícil. Além disso, análises funcionais eficientes são necessárias para caracterizar moléculas associadas a vias de sinalização identificadas a partir dos grandes conjuntos de dados gerados por telas diferenciais de próxima geração. Aqui, ilustramos um método simples para identificar com eficiência os componentes das vias de transdução de sinal que governam o destino celular e a especificação do eixo em embriões de ouriço-do-mar. A simplicidade genômica e morfológica de embriões semelhantes aos do ouriço-do-mar os torna poderosos modelos de desenvolvimento in vivo para a compreensão de interações complexas de sinalização. A metodologia descrita aqui pode ser usada como um modelo para identificar novas moléculas de transdução de sinal em vias individuais, bem como as interações entre as moléculas nas várias vias em muitos outros organismos.

No embrião ouriço-do-mar temos demonstrado que 3 diferentes sinalização Wnt ramos (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, e Wnt / PKC) 4, 25 interagem de modo a formar uma rede de sinalização de Wnt que governa ântero-posterior padronização (AP). Uma das consequências mais importantes destes eventos de sinalização é que a GRN inicial amplamente expressa neuroectoderma anterior (ANE) torna-se restrita a um pequeno território ao redor do pól...

Este artigo de vídeo detalha uma simples em metodologia in vivo que pode ser utilizado para caracterizar de forma eficiente e sistematicamente componentes de vias de sinalização complexas e redes reguladoras em muitos embriões de invertebrados.

O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões<em&gt; Na Vivo</em&gt; Modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede Interações

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

O objetivo geral desses experimentos é ilustrar as vantagens que organismos simples oferecem no estudo de interações complexas entre redes reguladoras de genes que orientam processos de desenvolvimento. Esta metodologia pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia evolutiva e no desenvolvimento, como as formas pelas quais vias de sinalização regulam a especificação do destino celular ao longo dos eixos embrionários principais em metazoários. Uma das principais vantagens dessa metodologia é que ela pode ser usada para caracterizar de maneira eficiente as vias de sinalização e as redes reguladoras de genes que elas ativam em um contexto de desenvolvimento in vivo. A demonstração deste procedimento será realizada por Marina Martinez-Bartolomé

the-power-simplicity-sea-urchin-embryos-as-vivo-developmental-models

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este artigo descreve uma técnica de transplante de tecido que foi projetado para testar a sinalização e padronização das propriedades ectoderma de superfície cefálica durante o desenvolvimento craniofacial.

Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

Descrevemos aqui um protocolo revisto para a cultura em grande escala de embrionário C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parece diferenciar e recapitular a expressão de genes de uma forma específica de célula. As técnicas que necessitem de acesso directo para as células ou o isolamento de tipos específicos de células a partir de outros tecidos podem ser aplicadas em C. elegans células cultivadas.

Um Método para o cultivo embrionário<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

A microinjecção é uma técnica comum usada para fornecer estruturas de ADN, ARNm, oligonucleidos morfolino anti-sentido ou outros tratamentos em ovos, embriões, e as células de várias espécies.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Métodos que produzem embriões morphant são essenciais para estudar mecanismos de desenvolvimento e redes de regulação gênicas. A estrela do mar Patiria miniata é um sistema modelo emergente para estes estudos. Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de gametas, produzindo culturas de embriões, e microinjeção rápida de zigotos de esta espécie.

Um Método para microinjeção de Patiria minata zigotos

Desenvolvemos um protocolo para gerar agregados de células-tronco embrionárias de camundongos que exibem auto-organização, quebra de simetria e alongamento paralelo ao desenvolvimento axial. Esta técnica permite o estudo de processos de desenvolvimento axial e a geração de tipos de células que de outra forma seriam difíceis de realizar em cultura de monocamada.

Geração de Agregados of Mouse Células-Tronco Embrionárias que mostram quebra de simetria, Polarização e Comportamento Coletivo Emergent<em&gt; In Vitro</em

Nos embriões de Xenopus, as células do teto do blastocele são pluripotentes e podem ser programadas para gerar vários tecidos. Aqui, descrevemos protocolos para usar explantes de telhado de blastocele de anfíbios como um sistema de ensaio para investigar as principais características in vivo e in vitro do desenvolvimento neural inicial.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

As complexidades dos tecidos dos sistemas multicelulares confundem a identificação da relação causal entre pistas extracelulares e comportamentos celulares individuais. Aqui, apresentamos um método para estudar a ligação direta entre pistas dependentes de contato e eixos de divisão usando blastômeros de embriões c. elegans e contas de poliestireno adesivo.

In Vitro Reconstituição de Padrões de Contato celular espacial com caenorhabditis isolado elegans embrião blastômeros e contas adesivas de poliestireno

As explanações de blastoderme de zebrafish são geradas por células embrionárias isolantes de centros de sinalização endógenos dentro do embrião inicial, produzindo aglomerados celulares relativamente ingênuos facilmente manipulados e cultivados ex vivo. Este artigo fornece instruções para fazer tais explantes e demonstra sua utilidade interrogando papéis para sinalização nodal durante a gastrulação.

Geração de Explantes de Blastoderm ingênuos de Embriões de Zebrafish

Descrevemos aqui uma caracterização proteômica baseada em espectrometria de massa de linhagens celulares com destino tecidual conhecido no embrião do vertebrado Xenopus laevis .

Proteômica por Espectrometria de Massas Guiada por Linhagem Celular no Embrião em Desenvolvimento (Rã)

A manipulação optogenética de vias de sinalização pode ser uma estratégia poderosa para investigar como a sinalização é decodificada no desenvolvimento, regeneração, homeostase e doença. Este protocolo fornece diretrizes práticas para o uso de ativadores de sinalização nodal e proteína morfogênica óssea (BMP) baseados em luz-oxigênio-voltagem no embrião inicial do peixe-zebra.

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

Aprenda metodologia in vivo para caracterizar vias de sinalização e redes reguladoras de genes em embriões de invertebrados. Esta abordagem sistemática revela interações complexas que direcionam processos de desenvolvimento.

O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões Na Vivo Modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede Interações (Vídeo) | JoVE Journal

O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões

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