Name: Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda cultura de órgãos e imunofluorescência em montagem total do ducto de Wolff de camundongo. Este método permite visualizar o enrolamento e desenvolvimento do tecido, oferecendo vantagens sobre culturas celulares tradicionais.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo de oncologia ginecológica para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é em parte suportado pelo financiamento do National Health and Medical Research Council, o Conselho Australiano de Pesquisas, eo Cancer Institute NSW (PST). MK é um receptor da Universidade de Newcastle Postgraduate Research Fellowship.

cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as orientações do Comitê de Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle e confirmou à Lei New South Wales animal Research, Nova Gales do Sul Regulamento Research Animal, eo código da Austrália para o cuidado e utilização de animais para fins científicos. Todos os procedimentos realizados em ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle. 1. Tempo Acasalamento <ol><li> Par 6 - 8 semanas de idade do sexo masculino e do sexo feminino ratos um pouco antes do final do ciclo de luz do dia. </li><li> Verificar as fêmeas para a presença de tampões vaginais de manhã cedo (em ou antes de 08:00), todos os dias. Dia do plugue é considerado como 0,5 dpc. </li><li> Transferir a fêmea com plug vaginal em uma nova gaiola (sem masculino) e rotular a data da tomada. </li></ol> 2. Isolamento de rato embrionárias Gonadais Ridges <ol><li> Isolar embryon ratoic cristas gonadais de 15,5 dpc fêmeas grávidas como descrito em 9, com algumas modificações como descrito em baixo. </li><li> Realizar dissecção antes do meio-dia como o tempo de fêmeas grávidas são consideradas para entrar no dia seguinte da gravidez pela tarde. </li><li> Sacrifício 15,5 DPC fêmeas grávidas que usam deslocamento cervical (ou de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da institucional). </li><li> Mantenha o mouse sobre as suas costas em um papel absorvente absorvente e pulverizar o lado ventral do abdômen com etanol 70%. </li><li> Levante a pele abdominal inferior (lado ventral) com uma pinça e fazer uma incisão lateral usando uma tesoura cirúrgica, que se estende desde a abertura urogenital até o fim para caixa torácica. Puxar a pele para a cabeça do animal para expor o abdômen. </li><li> Corte os músculos abdominais com uma tesoura cirúrgica para expor a cavidade peritoneal. Pegue o útero grávido com uma pinça pouco acima do colo do útero e fazer um corte. Agora, levante o útero, segurando em to da bexiga urinária e cortar o ligamento largo do útero seguido por cortes nas junções uterotubal destacar útero do anexo peritoneal. </li><li> Transferir o útero para um tubo de 50 mL contendo HBSS gelada (Solução Salina Equilibrada de Hank). Lavar o útero grávido suavemente com HBSS arrefecido em gelo para remover o excesso de sangue. </li><li> Manter o útero de uma placa de Petri contendo HBSS arrefecido com gelo e manter em gelo. Corte a parede uterina e tirar os embriões. Manter os embriões numa placa de Petri fresca com HBSS em gelo. </li><li> Pegue um papel de seda estéril limpo e colocá-lo em uma nova placa de Petri. Spray de etanol a 70% sobre o papel de tecido. Mantenha embrião sobre este papel de tecido na face lateral e cortá-la de abdômen inferior utilizando uma lâmina estéril na direção mostrada pela linha pontilhada na Figura 1. </li><li> Corrigir o embrião em uma base de esponja esterilizada fixando a coluna vertebral. </li><li> Colocá-lo sob o microscópio estereoscópico de dissecação e cuidadosamente cortada ao longo da linha média ventral. Remover o fígado e intestinos. O sistema do mouse urogenital (rim, ureter, testículos, WD e canal deferente) deverão ser agora visíveis. </li><li> Recorte o testículo e WD, mantendo-os num prato fresco Petri com HBSS, em gelo. Para tirar o WD e testículos, cortar os canais deferentes perto de seu apego à uretra e cortar a ligação da porção inferior do WD de gubernaculum. </li><li> Reúnem-se os testículos e WDs a partir dos embriões do mesmo grupo (pode variar de acordo com o plano experimental). </li></ol> 3. Cultura de Embryonic gonadal Ridges (Figura 2) <ol><li> Preparar o meio para a cultura das cristas gonadais embrionárias, completando DMEM / F12 com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino), 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina. Aquece-se a meios para 37 ° C num banho de água. </li><li> Adicionar 300 uL de meios de comunicação por poço de uma placa de cultura celular de 24 poços. </li><li> Pegue um prato Petri fresco e colocar uma pequena gota de HBSS estéril nele. Coloque uma membrana de policarbonato trilha etch (0,881; m) nesta gota de HBSS com a sua superfície brilhante virada para o HBSS. </li><li> Utilizando uma pinça limpa colocar dois WDs e gônadas na membrana (em sua superfície áspera, voltada para cima) e remova a quantidade máxima de HBSS usando lenços estéreis / papel absorvente. Não toque o tecido com papel absorvente; caso contrário, irá danificar o tecido. </li><li> Certifique-se de que nem os WDs nem as gónadas estão tocando um ao outro. Caso contrário, eles vão ficar juntos durante a incubação subsequente. </li><li> Transferir a membrana com os tecidos do poço de uma placa de 24 poços contendo meio de cultura de 300 mL e a cultura los na interface ar-meio. meio de cultura muito em membranas resulta em um crescimento cística do WDS. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C incubadora, na presença de 5% de CO 2. </li><li> Alterar o meio de cultura todos os dias. Para alterar a forma, com a pipeta, retire a forma do poço primeiro e, em seguida, adicionam-se 300 uL do meio fresco pré-aquecido. Nota:Para estudar o efeito de diferentes vias de sinalização na morfogénese WD, activadores e / ou inibidores químicos às concentrações requeridas podem ser adicionados ao meio de cultura. </li><li> Cultura tecidos para 3 d. Dentro de 3 d, WDs desenroladas recolhidos a partir de um embrião dpc 15,5 transformar em tubos altamente complicadas (Figura 3B). A adição do inibidor de Wnt, IWR1, resulta em inibição da WD bobinamento (Figura 3C). </li><li> Para a colheita destes tecidos tomar uma placa de Petri com PBS gelado. Transferir a membrana com gônadas culta e WD na placa de Petri. A membrana irá flutuar no PBS. Pressione a membrana para afundá-lo em PBS e tirar a gônada e WD. </li><li> Fixar os tecidos com 4% de paraformaldeído (PFA) O / N a 4 ° C ou durante 1 h à TA. Se necessário, tomar as imagens de campo claro de WDS antes da fixação. </li></ol> 4. Imunofluorescência Monte Whole <ol><li> Lava-se a tecidos fixados 3x com PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) com agitação lenta, de 10 minutos cada, à temperatura ambiente. </li><li> Desidratar os tecidos numa série graduada de etanol (25%, 50%, 75% e 100%), 10 min cada, a 4 ° C, com balanço lento (~ 30 rpm). Neste passo, os tecidos podem ser armazenadas a 4 ° C em 75% de etanol. <ol><li> Para alterar o etanol, manter os tecidos não perturbadas por 2 min e deixe os tecidos se acalmar. Tome-se como muito sobrenadante quanto possível e, em seguida, adicione a maior concentração próxima de etanol. Para evitar qualquer dano aos tecidos, a ponteira não deve tocar os tecidos em qualquer fase. </li></ol></li><li> Após desidratação, a re-hidratar os tecidos numa série graduada de etanol (100%, 75%, 50% e 25%), 10 min cada, a 4 ° C, com agitação lenta. </li><li> Lavar os tecidos com PBS-T (PBS + 0,1% de Triton X-100), 4x, 20 minutos cada, à RT, com agitação suave (~ 30 rpm). </li><li> Bloquear os tecidos durante 1 h à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (PBS + BSA a 1% + 0,2% de leite seco sem gordura em pó + 0,3% de Triton X-100). </li><li> afteR bloqueio, transferir os tecidos a solução de anticorpo primário (diluído em tampão de bloqueio) e incubar O / N a 4 ° C com agitação suave (~ 30 rpm). As diluições dos anticorpos primários utilizados são descritos na Tabela Materiais. </li><li> No dia seguinte, lavar tecidos com PBS-MT (PBS + 2% de leite magro em pó seco + 0,5% de Tween-20), 4x, 30 minutos cada, à RT, com agitação suave (~ 30 rpm). </li><li> Após este passo de lavagem, adicionar o anticorpo secundário, a uma diluição de 1: 250 (Este passo necessita de optimização para anticorpos individuais) em tampão de bloqueio e incubar durante 1 h, à RT, com agitação suave. </li><li> De agora em diante, manter os tecidos cobertos com folha de alumínio para evitar a exposição à luz como anticorpos secundários são rotuladas com fluoróforos sensíveis à luz. </li><li> Lavar os tecidos 3x com PBS-T (PBS + 0,1% de Tween-20), 30 min cada, com agitação suave. </li><li> Preparar lâminas para a montagem dos tecidos manchados. <ol><li> Para isso, cortar as lamelas de vidroem tiras finas usando uma caneta de diamante e ficar duas tiras de um sobre o outro na lâmina de vidro usando esmalte de unhas. Adicione dois limites e tecidos lugar entre estes dois limites. </li><li> Adicionar DAPI contendo meio de montagem e colocar uma lamela. Aplicar esmalte nos cantos da lâmina de cobertura para corrigi-lo ao slide. Nota: Os tecidos estão agora prontos para a imagem latente. Armazenar esses slides a -20 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian%2Fepididymal+duct%2C+more+twists+and+turns%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li>
<li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian%2Fepididymal+duct+by+using+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li>
<li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li>
<li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Wnt%2F%CE%B2catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li>
<li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li>
<li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+In+Vitro+Culture%3A+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li>
<li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343(2015).</li>
<li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+Development%3A+Methods+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li>
<li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li>
<li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O sistema de cultura de órgãos tem muitas vantagens sobre o sistema de cultura celular tradicional. Este sistema retém as relações estruturais originais e as interacções entre diferentes tipos de células. Ele imita em sistemas in vivo e dá informações mais precisas do que os estudos de cultura de células, onde o fator de nicho está ausente. A utilização de sistemas de cultura de órgãos mesmo tem vantagens sobre o uso de todo o animal. Estes incluem o custo mais elevado de utilização de todo o animal, f...

O sistema reprodutor masculino é composto principalmente de testículo, o local para o desenvolvimento de células germinativas e diferenciação, e um sistema ductal complexo que é necessário para a maturação, de transporte, de armazenamento e de esperma. Epidídimo é um órgão tubular que liga testículo com vasos deferentes e, principalmente, envolvidos no desenvolvimento pós-testicular e maturação das células germinativas 1. O epidídimo altamente enrolados do rato adulto desenvolve a partir de um tubo simples e direto precursor, duto de Wolff (WD) 1. A estrutura complexa e enrolada de epidídimo é essencial para o esperma para adquirir a capacidade de fertilizar células germinativas femininas 2. Como tal órgão essencial para a fertilidade masculina e desenvolve fica em forma não é bem compreendido. Várias vias de sinalização foram mostradas para ser envolvido no desenvolvimento de WD, tais como a via de sinalização Wnt 3,4 e o androgénio via da 5 sinalização. Nosso trabalho recente estabeleceu a exigência de balANCED Wnt sinalização para WD enrolamento durante o desenvolvimento pré-natal 4. No entanto, mais estudos são necessários para entender os mecanismos envolvidos no enrolamento pós-natal do epidídimo, diferenciação celular, e comunicação célula-célula dentro do epitélio do epidídimo e com células intersticiais. Modelos de ratos geneticamente modificados têm sido provado ser uma poderosa ferramenta para a identificação / validação dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e doenças de diversos sistemas de órgãos 6. Apesar de sua ampla utilização, existem limitações significativas de modelos de ratos geneticamente modificados, incluindo o fenótipo imprevisíveis de ratos mutantes alvo com relação à função do gene presumido, e nenhum fenótipo em mutantes nulos em alguns modelos, a influência de fatores genéticos e ambientais, trabalho intensivo e demorado processo de desenvolvimento de modelos de ratinho. Portanto, a interpretação do significado dos resultados apenas dos geneticamente modimodelos ficados rato nem sempre é simples 6. Estas limitações podem ser superadas utilizando em sistema de cultura de órgãos in vitro que nos dá a flexibilidade de manipular múltiplas vias de sinalização em tempo real, em condições de cultura controladas. Sistema de cultura de órgãos é fundamental para a compreensão da fisiologia e patologia dos órgãos inteiros 7. Além disso, a imagiologia de órgãos inteiros coradas com anticorpos etiquetados fluoróforo nos permite visualizar os marcadores de interesse num contexto tridimensional, tal como existe in vivo, proporcionando assim uma melhor compreensão da forma do órgão, estrutura, função e 8. Aqui, descrevemos os métodos para isolamento de rato cumes gonadal embrionárias, a cultura in vitro e toda imagem imunofluorescência monte da WDS, que podem ser aplicados para responder a uma variedade de questões relativas à morfogênese de órgãos tubulares, tais como WDS. Neste protocolo,isolado de rato embrionário pregas genitais de 15,5 dias post coitum (DPC) vacas prenhes e cultivaram-durante 3 d seguido de imunocoloração para um marcador das células epiteliais (citoqueratina 8, CK8), um marcador de proliferação celular (fosfo-Histona 3, PH3) e activa βcatenin.

<table><tbody><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>podem ser adquiridas de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Hank' s Solução Salina Balanceada (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, EUA</td><td>SH30031.02</td><td>pode ser comprada de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco: Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)</td><td>Sigma, EUA</td><td>D8437</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Interpath,&nbsp; Austrália</td><td>SH30034.02</td><td>10% FBS usado em meio</td></tr><tr><td>de cultura L-Glutamina</td><td>GE Healthcare Life Sciences, EUA</td><td>SH30034.01</td><td>concentração de 1% usada</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco, EUA</td><td>15070-063</td><td>concentração de 1% usada</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&nbsp;</td><td>Whatman, EUA</td><td>110409</td><td>Membrana (0.8 &micro; m)</td></tr> <tr><td>IWR1</td><td>Sigma, EUA</td><td>10161-5mg</td><td>100 &micro; Concentração M usada</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences, EUA</td><td>15710</td><td>16% de estoque, 4% em PBS para uso. TÓXICO - use luvas e não ser descartado na pia</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Thermo Scientific Fisher, EUA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, faça 25, 50 e 75% com água miliQ.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, EUA</td><td>2509-500ml</td><td>Muito viscoso, cuidadoso ao dispensar</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, EUA</td><td>T8787-50ml</td><td>Muito viscoso, cuidadoso ao dispensar</td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato Dissódico</td><td>Thermo Scientific Fisher, EUA</td><td>621-500mg</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de Sódio</td><td>Ajax Finechem, EUA</td><td>4745-500g</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores Cloreto de</td></tr><tr><td>Sódio</td><td>Thermo Scientific Fisher, EUA</td><td>465-500g</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Cytokeratin8/Troma I</td><td>Estudos de Desenvolvimento Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td><td>TROMA-I</td><td>1:250 em tampão de bloqueio</td></tr><tr><td>ativo &beta; catenina&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular,&nbsp; EUA</td><td>D13A1</td><td>1:200 in tampão</td></tr><tr><td>de bloqueio fosfo-histona 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 in tampão de bloqueio</td></tr><tr><td>Alexa488 IgG anti-coelho de cabra Jackson</td><td>ImmunoResearchLabs,&nbsp; EUA</td><td>111-545-047</td><td>1:250 in buffer de bloqueio</td></tr><tr><td>Alexa594 IgG anti-rato de cabra</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&nbsp; EUA</td><td>112-585-072</td><td>1:250 in tampão de bloqueio</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>242-500ml</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>n-Propil galato</td><td>Sigma, EUA</td><td>2370-2</td><td></td></tr><tr><td>-(4-amidinofenil)-1H -indol-6-carboxamidina (DAPI)</td><td>Sigma, EUA</td><td>D9564-10mg</td><td>Use para manchar ácidos nucleicos (DNA)</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2225-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de Solvente (24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td>CS24501GP</td><td>-</td></tr></tbody></table>

Órgão cultura e whole mount imunofluorescência coloração de rato wolff dutos

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

morfogénese tubária é um requisito fundamental para o desenvolvimento da maioria dos órgãos de mamíferos, incluindo o sistema reprodutivo masculino. O epidídimo, parte integrante do sistema reprodutor masculino, é responsável pela estocagem de esperma, maturação e transporte. O epidídimo adulto é um tubo altamente enrolada que se desenvolve a partir de um precursor embrionária simples e direto conhecido como duto de Wolff (WD). enrolamento adequada do epidídimo é essencial para a fertilidade masculina, como o esperma no testículo são incapazes de fertilizar um óvulo. No entanto, o mecanismo responsável pelo desenvolvimento e epididimal de enrolamento permanece pouco clara, parcialmente devido à falta de métodos de cultura de órgãos e de imagem inteiros. Neste estudo, descrevemos um sistema de cultura in vitro e todo o protocolo de imunofluorescência de montagem para visualizar melhor o processo de enrolamento de WD e desenvolvimento, o que pode também ser aplicada ao estudo de outros órgãos tubulares.

Durante o desenvolvimento, o WD sofre alterações significativas no qual um tubo simples e direto é transformado em um duto altamente complexo e enrolada. Utilizando os métodos descritos acima, o WDS sofrer uma transformação similar em condições de cultura. Aqui temos mostrado os resultados de WDs cultivadas durante 3 d (Figura 3). Para dissecar os mecanismos moleculares envolvidos na morfogénese WD, o meio de cultura pode ser suplementado com inibidores e activadores, dirigidos a diferentes vias de sina...

Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

O objetivo geral deste método de cultura de órgãos e imunofluorescência em montagem inteira é visualizar e compreender melhor o processo de enrolamento e desenvolvimento do ducto de Wolff. Este método ajudará a responder perguntas fundamentais na área da biologia do desenvolvimento sobre os mecanismos envolvidos na formação da forma, estrutura e função dos órgãos. As principais vantagens desta técnica são que ela simula sistemas in vivo e fornece informações mais precisas do que estudos de cultura celular, que carecem de fatores de nicho.Antes do meio-dia no 15º dia pós-concepção, posicione um camundongo grávido em posição supina sobre papel toalha absorvente e pulverize a face ventral do abdômen com etanol 70%. Usando pinça, levante a pele do abdômen inferior na face ventral do animal e use tesoura cirúrgica para fazer uma incisão lateral que se estende da abertura urogenital até a caixa torácica. Segure a bexiga urinária com a pinça logo acima do colo uterino e faça uma incisão no útero.Segurando a bexiga urinária, faça uma incisão no ligamento largo do útero e na junção uterossalpingiana para destacar o útero das aderências parateniais. Coloque o útero em um tubo de 50 mililitro

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo descreve a técnica de coloração imunofluorescente de organoides intactos de câncer de próstata e sua imagem por microscopia confocal de montagem total. Esta técnica tem como objetivo avaliar a capacidade de diferenciação ex vivo de células epiteliais basais e luminais da próstata.

Imagem de imunofluorescência de montagem total: uma técnica de fixação e coloração para avaliar organoides intactos

A tecnologia de imagem aprimorada está permitindo imagens tridimensionais de órgãos durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos todo um sistema de cultura de órgãos que permite imagens ao vivo das vilosidades em desenvolvimento no intestino fetal de camundongo.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

A cultura de gotículas verticais ex vivo é uma alternativa às técnicas experimentais atuais in vitro e in vivo. Este protocolo é fácil de executar e requer quantidades menores de reagente, ao mesmo tempo em que permite a capacidade de manipular e estudar a vascularização, morfogênese e organogênese fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar os folículos nos ovários culturas de ratos jovens sem seccionamento serial. Usando a imunofluorescência todo órgão e tecido de compensação, seccionamento físico é substituído com seccionamento óptico. Este método de preparação da amostra e visualização mantém a integridade do órgão e facilita a quantificação automatizada de células específicas.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Camundongos geneticamente modificados são modelos úteis para investigar mecanismos de câncer de próstata. Aqui nós apresentamos um protocolo para identificar e dissecar os lobos da próstata de um sistema urogenital do rato, diferenciá-los com base em histologia e isolar e cultura primária de células da próstata em vitro como esferoides para análises a jusante.

Identificação, caracterização histológica e dissecação dos lobos da próstata do rato para em Vitro Spheroid 3D modelos de cultura

Os organóides da próstata do rato representam um contexto prometedor para avaliar os mecanismos que regulam a diferenciação. Este artigo descreve uma abordagem melhorada para estabelecer organóides da próstata e introduz métodos para (1) coletar lysato de proteína de organóides e (2) corrigir e manchar organóides para microscopia confocal de montagem inteira.

Avaliando a capacidade de diferenciação das células epitelias da próstata do camundongo usando a cultura organóide

Aqui, são descritos quatro métodos para a geração de organoides testiculares testiculares de células testiculares neonatais primárias, ou seja, matriz extracelular (ECM) e ambientes de cultura 2D e 3D livres de ECM. Essas técnicas possuem múltiplas aplicações de pesquisa e são especialmente úteis para estudar desenvolvimento testicular e fisiologia in vitro.

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Este protocolo apresenta um método otimizado para isolar o revestimento epitelial da uretra da fêmea adulta do camundongo para análises posteriores, incluindo citometria de fluxo, imunocoloração e cultura organoide. Os métodos forneceram células epiteliais uretrais enriquecidas e viáveis, como evidenciado pela análise de citometria de fluxo, imagem de montagem total e formação eficiente de organoides.

Um método otimizado para isolar epitélio uretral feminino de camundongos para análise de células únicas e imunofluorescência

Estudos de desenvolvimento palato são motivadas pela incidência de fenda palatina, um defeito de nascença que impõe uma carga tremenda de saúde e pode deixar desfiguração duradoura. Nós demonstramos aqui uma técnica para prateleiras palatinas cultura que podem ser utilizados para estudar diferentes vias de sinalização envolvidos no desenvolvimento do palato e de fusão.

Método de Estudar Palatal Fusão usando estático Órgão Cultura

Aprenda cultura de órgãos e imunofluorescência em montagem total do ducto de Wolff de camundongo. Este método permite visualizar o enrolamento e desenvolvimento do tecido, oferecendo vantagens sobre culturas celulares tradicionais.

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

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