Name: Genoma-largo mediada por análise de inibidor HDAC modulação de microRNAs e mRNAs em B células induzidas a recombinação de DNA de classe-interruptor sofrem e diferenciação de células plasmáticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda a induzir linfócitos B de camundongos C57BL6J a sofrer troca de classe de anticorpos e diferenciação em células plasmáticas, analisando a regulação epigenética por inibidores de HDAC.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH bolsas 105813 AI e AI 079705 (para PC), a Aliança para identificação de alvo de pesquisa de Lúpus no lúpus Grant ALR 295955 (para PC) e a pesquisa da artrite National Research Foundation concedem (a HZ). TS foi apoiado pelo centro médico de Pediatria, segundo Xiangya Hospital, Universidade de South Central, Changsha, China, no contexto do programa visita Xiangya-UT escola de medicina, San Antonio de estudante de medicina.

o protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais de The cuidados institucionais do Animal e uso de comitês da University of Texas Health Science Center em San Antonio.
 1. estimulação de pilhas do rato de B para a RSE, diferenciação de células plasmáticas e HDI tratamento <ol><li>preparação de suspensões celulares de baço Nota: executar todas as etapas em uma capa de fluxo laminar, com exceção do mouse eutanásia e dissecção.
	<ol><li>Euthanize a isentos de agentes patogénicos específicos C57BL/6J mouse (8-12 semanas de idade) por inalação de CO 2.</li>
		<li>Colocar o mouse na placa de dissecação com o abdome virado para cima. Colocar todos os quatro pés do mouse com agulha de calibre 18, 1.5 - na.</li>
		<li>Esterilizar a pele usando toalhetes de encharcada de etanol 70%.</li>
		<li>Usar um conjunto de instrumentos cirúrgicos esterilizados em autoclave (pinças e tesouras dissecação) para cortar a pele logo abaixo da caixa torácica para visualizar o baço (no lado esquerdo do abdômen, logo abaixo do fígado).</li>
		<li>Usar outra pinça estéril e tesouras tesouras para extrair o baço, que se encontra abaixo da curvatura maior do estômago, por aperto o baço suavemente com fórceps e cortando todo o tecido de conexão com a dissecação. Certifique-se de remover todo o tecido conexão.</li>
		<li>Colocar o baço em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga contendo 1.000 µ l de meio RPMI1640 completo (RPMI 1640 meio suplementado com soro 10% inactivadas pelo calor fetal bezerro (FBS), 2 mM L-glutamina, a penicilina 100 µ g/mL, 100 mg/mL estreptomicina, anfotericina B de 0,25 µ g/mL e 50 µM β-Mercaptoetanol).</li>
		<li>Coloque um coador de célula de 70 µm em um tubo de centrifuga conico polipropileno de 50 mL e despeje o baço do tubo microcentrifuga no filtro da célula. Use a ponta de um tubo de centrifuga conico polipropileno de 15 mL para amasse delicadamente o baço através do filtro. Lave o filtro de célula com 15 a 20 mL de meio completo.</li>
		<li>Spin-down as células a 350 x g, durante 5 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Remover os glóbulos vermelhos de suspensões de células do baço. Ressuspender as células em tampão de Lise ACK (5 mL por baço). Incubar durante 4 min em temperatura ambiente com agitação ocasional e depois saciar com 25 mL de meio completo.</li>
		<li>Spin para baixo as células a 350 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ou 10 mL de meio completo. Contar as células viáveis usando um hemocytometer.</li>
	</ol></li> <li>Célula B isolamento Nota: as células B isolar pela seleção negativa, seguindo o fabricante &#39; instruções s. Non-B células são direcionadas para remoção com biotinilado anticorpos dirigidos contra células não-B (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) e TER119) e partículas magnéticas streptavidin-revestido.
	Tubo de fundo redondo de <ol><li>Prepare uma suspensão de células de 0,25 a 2 mL de 1 x 10 8 células/mL em meio completo em um poliestireno estéril 5 mL (12 x 75 mm). Adicionar soro rato normal (50 µ l/mL) para a amostra.</li>
		<li>Isolamento de adicionar 50 µ l/mL cocktail à amostra. Misture as células pipetando suavemente para cima e para baixo 2 - 3 vezes e incubar a temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Adicionar 75 µ l/mL streptavidin-revestido partículas magnéticas para a amostra. Misture a mistura suavemente pipetando acima e para baixo 2 - 3 vezes e incube por 2,5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicionar meio RPMI 1640 completo. Misture as células pipetando delicadamente acima e abaixo de 2 - 3 vezes.</li>
		<li>Colocar o ímã do tubo (sem a tampa) e incubar a temperatura ambiente por 2,5 min. deite fora o sobrenadante contendo intocadas células B em um novo tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Contar as células viáveis usando um hemocytometer e mancha azul Trypan. Avaliar a pureza das células B por análise de citometria de fluxo de marcadores de superfície de células B, como B220 e CD19.</li>
	</ol></li> <li>Estimulação de células B e tratamento HDI <ol><li>Ressuspender as células B purificadas em meio RPMI 1640 completo em uma concentração final de 0,3 x 10 6 células/mL.</li>
		<li>Usar uma placa de cultura de células de 48-bem para cultura de células. Para cada poço, adicionar 1 mL de suspensão de células B purificado (0,3 x 10 6 células/mL), LPS (concentração final de 3 µ g/mL) de Escherichia coli, IL-4 (concentração final de 5 ng/mL) e 0 ou 500 µM HDI (ácido valproico; VPA).</li>
		<li>Incube as celulas em 37 ° C e 5% CO 2 para 60h por qRT-PCR e análise do elevado-throughput do mRNA - e miRNA-sequenciamento, ou 96 h para análise de citometria de fluxo.</li>
	</ol></li> <li>Flow cytometry análise de RSE e diferenciação de células plasmáticas <ol><li>após 96 h de cultura, separar as células de cada poço pipetando as células acima e para baixo várias vezes. Transferi a suspensão de células para um tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Gire para baixo as células a 350 x g por 5 min utilizando uma centrífuga de bancada e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células com 100 µ l de tampão HBSS contendo 1% de BSA e 0,5 ng/mL fluoresceína (FITC) cabra conjugada anti anticorpos de IgM de rato de – (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-anti-rato conjugados rato IgG1 Ab monoclonal (mAb), 0,2 ficoeritrina ng/mL (PE)-conjugados rato anti-rato B220 mAb, 0,2 ng/mL PE-Cy7-conjugados rato anti-rato CD138 mAb e 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).</li>
		<li>Incubar as células com anticorpos conjugados de fluorescência (etapa 1.4.2) no escuro à temperatura ambiente por 30 min.</li>
		<li>Lavar as células com 1 mL de HBSS com 1% de BSA.</li>
		<li>Spin-down as células a 1.500 x g por 5 min utilizando uma centrífuga de bancada e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células em 300 µ l de HBSS com 1% de BSA e transfira a suspensão de células para um tubo de poliestireno de fundo redondo. Cobrir o tubo com papel alumínio para evitar a exposição à luz.</li>
		<li>Executar análise de citometria de fluxo em uma suspensão de célula única. Colete 50.000 eventos para cada amostra de compensação e 250.000 eventos para as outras amostras. Analisar os dados usando o software do equipamento.</li>
		<li>Eliminar os detritos e parelhas usando um portão de geometria de pulso (FSC-H x FSC-A e SSC-H x SSC-A). Portão apropriadamente o lote 7-AAD para excluir as células mortas.</li>
	</ol></li></ol> 2. Elevado-Throughput do mRNA-Seq h <ol><li>após 60 da cultura, extrair o RNA total de 2-4 × 10 6 células usando um kit de isolamento de RNA total que pode recuperar o pequeno RNA seguindo o fabricante &#39; instruções s. Incluem uma DNase eu passo tratamento.</li>
	<li>Verificar a integridade do RNA usando um bioanalyzer, seguindo o fabricante &#39; instruções de s.</li>
	<li>Usar 500-1.000 ng do RNA total de alta qualidade (número de integridade do RNA RIN &#62; 8.0) para o RNA-seq preparação de biblioteca com uma RNA comercial amostra pkit de rep seguindo o fabricante &#39; instruções de s.</li>
	<li>As bibliotecas de mRNA-seq individuais com base em suas parcelas respectivas 6-bp índice dos adaptadores do pool e as bibliotecas em 50 bp/sequência de sequências. Usar um sistema de DNA de alto rendimento de acordo com o fabricante &#39; protocolos de s.</li>
	<li>Após a execução de sequenciamento, demultiplex com CASAVA para gerar o arquivo fastq para cada amostra. Realizar leituras de mapeamento e análise de bioinformática, como anteriormente descrito 11.</li>
	<li>Alinhar todas as leituras de sequenciamento com seus genomas de referência (UCSC rato genoma compilação mm9) usando TopHat2 padrão configurações 14. Processar os arquivos de bam de alinhamento usando a contagem de HTSeq para obter as contagens por gene em todas as amostras.</li>
</ol> 3. Elevado-Throughput miRNA-Seq <ol><li>uso 100 ng-1 µ g de RNA total de alta qualidade, como preparado no passo 2.1, para a preparação de biblioteca de RNA-seq pequena usando um pequeno kit de RNA-seq comercial.</li>
	<li>Ligam a 3 degenerado &#39; adaptador sobre o 5 &#8242; extremidades das partida pequenas moléculas de RNA com um kit de ligadura comercial. Ligam o degenerado 5 &#39; adaptador sobre o 3 &#8242; extremidades das partida pequenas moléculas de RNA com um kit de ligadura comercial. Converter o RNA em cDNA por transcrição reversa e amplificar a pequena biblioteca de RNA-seq por amplificação por PCR com jogos comerciais.</li>
	<li>Usar um gel de PAGE 6% nativo TBE para isolar a final pequena biblioteca de RNA-seq. Funcione o gel com 1 buffer de X TBE a 200 V, até a banda de bromofenol tintura de controle se aproxima da parte inferior do gel (0,5 - 1 cm).</li>
	<li>Retire o gel as chapas de vidro e manchar com brometo de etídio (0,5 µ g/mL na água) em um recipiente limpo para 2-3 min.. Visualize o gel bandas em um transiluminador UV ou outro instrumento de documentação de gel de.</li>
	<li>Cortar fora a banda ~ 150-bp usando uma lâmina limpa e coloque-o em um tubo de 1,7 mL.</li>
	<li>Extrair o DNA usando um kit de extração do gel de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Verificar a distribuição de tamanho da biblioteca final com um teste de DNA de alta sensibilidade comercial e a concentração com um ensaio comercial dsDNA por fabricantes de &#39; instruções.</li>
	<li>As bibliotecas da piscina por amplificação e um posterior sequenciamento executados com um sistema de sequenciamento de DNA da elevado-produção comercial pelo fabricante &#39; protocolos de s.</li>
	<li>Demultiplex com CASAVA para gerar o arquivo fastq para cada amostra pelo fabricante &#39; protocolos de s.</li>
	<li>Para análise de RNA-seq pequena de cada amostra, use Flicker para alinhamento de RNA pequeno pelo fabricante &#39; protocolos s.
	<ol><li>Remover leituras que são alinhadas a contaminantes, tais como mitocôndrias, rRNA, cartilhas, etc.</li>
		<li>Alinhar os dados para amadurecer miRNA sequências.</li>
		<li>Alinhar os dados de sequências de laço do gancho de cabelo (precursor miRNA).</li>
		<li>Alinhar os dados a outros pequenos RNA sequências (usando banco de dados fRNA) 15.</li>
	</ol></li> <li>Depois que todas as amostras são quantificadas, definir os miRNAs expressados diferenciais entre diferentes grupos/amostras. Prever os miRNAs que destino selecionados mRNAs ou mRNAs que pode ser alvo de uma miRNA seletiva usando ferramentas de previsão de alvo de miRNA on-line, como TargetScan 16, microcosmo 17 e PicTar 18 .</li>
	<li>Se houver necessidade de análise funcional de anotação ou caminho, submeter os genes previstos para análise via engenho (IPA) ou DAVID.</li>
</ol> 4. RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) de mRNAs e miRNAs <ol><li>análise de qRT-PCR de RNAm <ol><li>extrair o RNA de 0,2-5 × 10 6 células usando um comercial total RNA isolamento kit que pode recuperar o pequeno RNA, seguindo o fabricante &#39; instruções s. Incluem uma DNase eu passo tratamento.</li>
		<li>Sintetizar o cDNA de RNA total com um sistema de síntese de primeiro-costa usando primer oligo-dT.</li>
		<li>Quantificar cDNA por qRT-PCR com primers adequados, usando 2 x mistura mestre de PCR em tempo real com o seguinte protocolo: 95 ° C por 15 s, 40 ciclos de 94 ° C por 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s.</li>
		<li>Realizar a aquisição de dados durante a etapa de extensão de 72 ° C e realizar análise de curva de fusão de 72 para 95 ° C.</li>
	</ol></li> <li>análise de qRT-PCR de miRNA <ol><li>alíquota RNA das amostras preparadas na etapa 4.1.1.</li>
		<li>Reversa-transcrever o RNA em cDNA. Usar um kit de transcrição reversa do microRNA comercial, seguindo o fabricante &#39; instruções de s.</li>
		<li>Realizar PCR em tempo real de microRNA utilizando uma mistura mestre SYBR Green em tempo real do PCR com 250 nM miRNA madura frente primers em conjunto com um primer universal reverso.
		Cartilha de <ol><li>degelo 2 x PCR Master Mix, miRNA específicos para a frente da primeira demão e universal reversa à temperatura ambiente. Misturar as soluções individuais.</li>
			<li>Preparar uma mistura de reação da seguinte maneira para um volume de 25 µ l-por-bem reação (usado em placas de PCR de 96 poços): 2 x PCR Master Mix 12,5 µ l miRNA encaminhar as primeiras demão (2,5 μM) 2,5 µ l Universal reversa de primer (2,5 μM) 2,5 µ l RN µ l ase-free water5</li> <li>Adicionar 22.5 μL da mistura de reação a uma placa PCR de 96 poços. Adicionar 2,5 μL de cDNA de modelo (50 pg-3 ng) nos poços de placa individual.</li>
			<li>Firmemente selar o filme de placa. A placa por 1 min em 1.000 x g e temperatura de centrifugação.</li>
			<li>Colocar a placa no cycler em tempo real e iniciar o seguinte programa de ciclismo: 95 ° C por 5 min, 40 ciclos de 94 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s.</li>
		</ol></li> <li>Usar o ΔΔCt método para análise de dados qRT-PCR com uma folha de cálculo. Normalizar a expressão dos miRNAs relevantes para a expressão de pequena nuclear/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 e Snord70/SNORD70.</li>
	</ol></li> <li>Análise estatística <ol><li>realizar análise estatística para determinar os valores de p por emparelhado e desirmanadam estudante &#39; s t - teste usando uma folha de cálculo e considerar os valores de p &#60; 0,05 como significativa.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Allis, C. D., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+hallmarks+of+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The molecular hallmarks of epigenetic control.</a> Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).</li>
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<li>Anders, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((doRiNA%3A+a+database+of+RNA+interactions+in+post-transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Este protocolo fornece abordagens globais para induzir a comutação de classe B célula e diferenciação de células plasmáticas; para analisar o seu impacto por moduladores epigenéticos, ou seja, IDH; e para detectar o efeito de IDH na expressão do mRNA e miRNA nestas células. A maioria dessas abordagens também pode ser usada para analisar o impacto do factor epigenética na expressão de função e mRNA/miRNA B-célula humana. O qRT-PCR e mRNA-seq/miRNA-seq abordagens também podem ser usadas para analisar as células B isoladas ...

Marcas epigenéticas ou fatores, como a metilação do DNA e RNA não-codificante (incluindo microRNAs), posttranslational modificações do histone modulam a função celular, alterando a expressão de gene1. Modificações epigenéticas regulam a função de linfócitos B, tais como recombinação de DNA de classe-interruptor de imunoglobulina (RSE), somática (SHM) e diferenciação de células B de memória ou pilhas de plasma, desse modo, modulando o anticorpo e auto-anticorpos respostas de2,3. RSE e SHM criticamente exigem deaminase citidina induzida por ativação (auxílio, codificado como Aicda), que é altamente induzida em células B em resposta ao T-dependentes e T-independentes antígenos4. As células B classe-comutado/hypermutated mais se diferenciar em plasmócitos, que secretam grandes quantidades de anticorpos de forma criticamente dependente da proteína de maturação de linfócitos B-induzido 1 (Blimp1, codificado como Prdm1)5. Mudanças epigenéticas anormais nas células B podem resultar em respostas de anticorpo/auto-anticorpos aberrante, que podem levar à resposta alérgica ou auto-imunidade1,4. Compreendendo fatores como epigenéticas, tais como os miRNAs, modulam célula B-intrínseca expressão gênica não é apenas importante para o desenvolvimento de vacina, mas também é essencial para revelar os mecanismos de respostas potenciais de anticorpo/auto-anticorpos anormais.
Deacetilação e acetilação da histona são modificações dos resíduos de lisina em proteínas histonas normalmente catalisadas por histona acetiltransferase (chapéu) e histona deacetilase (HDAC). Estas modificações levam à acessibilidade crescente ou decrescente da cromatina e, ainda mais, permitam ou impedem a ligação de fatores de transcrição ou proteínas ao DNA e a alteração do gene expressão5,6, 7 , 8. inibidores HDAC (IDH) são uma classe de compostos que interferem com a função das HDACs. Aqui, usamos HDI (VPA) para abordar o Regulamento de HDAC sobre o perfil de expressão de gene intrínseca das células B e seu mecanismo.
os miRNAs são pequenos, não-codificantes RNAs aproximadamente de 18 a 22 nucleotídeos de comprimento que são gerados por vários estágios. miRNA anfitrião genes são transcritos e formam o grampo principal microRNAs (miRNAs-pri). São exportados para o citoplasma, onde pri-miRNAs são subsequentemente transformados em miRNAs precursor (pre-miRNAs). Finalmente, formam-se através da segmentação dos pre-miRNAs miRNAs maduros. os miRNAs reconhecer as sequências complementares dentro da região 3' untranslated do seu alvo mRNAs6,7. Através do silenciamento pós-transcricional, miRNAs regular a atividade celular, tais como a proliferação, diferenciação e apoptose10,11. Já vários miRNAs podem direcionar o mesmo mRNA, e um único miRNA potencialmente pode direcionar vários mRNAs, é importante ter uma visão do contexto do perfil de expressão de miRNA para compreender o valor do indivíduo e o efeito conjugado dos miRNAs. os miRNAs foram mostrados para ser envolvido no desenvolvimento de células B e diferenciação periférica, bem como diferenciação de estágio específico de células B, resposta imunitária e auto-imunidade1,4,9. Na 3' UTR de Aicda e Prdm1, existem vários validados ou previsível evolutivamente conservadas sites que podem ser direcionados por miRNAs8.
Modulação epigenética, incluindo modificação pós-transcrição de histona e miRNAs, exibir um tipo de célula e célula padrão de regulamento de estágio específico do gene expressão9. Aqui, descrevemos os métodos para definir a modulação mediada por HDI de miRNA e expressão do mRNA, CSR e diferenciação de células plasmáticas. Estes incluem protocolos para indução de células B submeter-se a RSE e diferenciação de células plasmáticas; para tratar as células B com IDH; e para analisar a expressão miRNA e mRNA por qRT-PCR, miRNA-seq e mRNA-seq10,11,12,8,13.

<table><tbody><tr><td>Camundongos C57BL/6</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro RPMI 1640 Médio (Mod.) 1X com L-Glutamina (Tamanho: 6 x 500mL; Com L-Glutamina)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT 10-040-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH300</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Solução Antimistótica Antibiótica 100 mL</td><td>Fisher Scientific - Hyclone</td><td>SV3007901&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-420-3250ML</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Células Falcon Fisher</td><td>Scientific</td><td>21008-952&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mancha Azul Trypan 0.04%</td><td>GIBCO/Life Technologies/Inv</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW10-548E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Contagem Bright-Line da Hausser Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubos de Poliestireno de Fundo Redondo com Tampa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de Isolamento de Células B de Camundongo</td><td>Stem Cell Tech</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>Apenas Agulha BD 18 Gauge 1.5 polegada SHORT BEVEL 100/caixa&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td> </td><td></td>305199</tr><tr><td>PE/Cy7 anti-camundongo CD138 (Syndecan-1) Anticorpo</td><td>BioLegend&nbsp;</td><td>142513 (25 ug)</td><td></td></tr> <tr><td>PE-Cy7 B220 anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD (1 mg)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-camundongo / humano CD45R / B220 anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>103212</td><td></td></tr><tr><td>Mouse APC-IgG1 200 &micro; g</td><td>Biolegend</td><td>406610</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-camundongo IgM Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>406506</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-camundongo/humano CD45R/B220 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-humano/camundongo CD45R (B220) (RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-21-022-CM</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, fração V, Tratamento para Choque Térmico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>LPS 25mg (Lipopolissacarídeos de Escherichia coli 055:B5)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2880-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo recombinante IL-4 (sem transportador)</td><td>BioLegend</td><td>574302 (tamanho: 10 ug)</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio de ácido valpróico</td> Gabinete de Biossegurança <td>Sigma Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>SterilGARD e3 Classe II Tipo A2</td><td>The Baker Company</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 de Grande Capacidade de Alcance&nbsp;</td><td>Banhos</td> de Água de Controle Digital Thermo Scientific <td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp: Modelo 205</td> Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo <td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5Q</td><td></td></tr><tr><td>5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Corning CentriStar 15ml Tubos de Centrífuga&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-538-59A</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo de 1,7 mL, transparente</td><td>Genesee</td><td>22-282</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de Plástico de Leitura Fácil de Alta Velocidade 50ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>ELMI SkySpin CM-6MT</td><td>ELMI</td><td>CM-6MT</td><td></td></tr><tr><td>Rotor 6M</td><td>ELMI</td><td>6M Rotor 6M.06</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ELMI</td><td>6M.06</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Portátil Controlador de pipeta Pipet-Aid XP</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta sorológica de 25 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta sorológicas de 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta sorológica de 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>898130-896</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 48 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de Bancada Allegra 6, Rotor Beckman</td><td>Coulter</td><td>366802</td><td></td></tr><tr><td>GH-3.8A Não Refrigerado, Horizontal, ARIES Smart Balance</td><td>Centrífuga de Bancada Beckman Coulter</td><td>366650</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 25R, Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>TA-15-1.5 Refrigerado, Ângulo Fixo</td><td>Beckman Coulter</td><td>368298</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific AccuSpin Micro 17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Mixer de Vórtice Analógico Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio (Aprox. 0.75% Etanol como Conservante/Biologia Molecular)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Dnase Sem Rnase (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Espectrofotômetros</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Sistema de Síntese de Primeiro Filamento RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>175013897</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>172-5121</td><td></td></tr><tr><td>Placas PCR Semi-Skirted de 96 Poços Fisherbrand, caixa de 25</td> Selos Adesivos 'B' <td>Microseal Fisher</td><td>14-230-244</td><td></td></tr><tr><td>Módulo Óptico MyiQ</td><td>Bio-Rad</td> MSB-1001 <td></td> Bio-Rad 170-9744 <td></td></tr><tr><td>Chassi iCycler Bio-Rad</td><td></td><td>170-8701</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Kit Óptico Bio-Rad 170-9752 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analisador de Citometria de Fluxo BD LSR II BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalisador</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2943CA</td><td></td></tr><tr><td>S200 Ultrassônico Focalizado</td><td>Covaris</td><td>S200</td><td></td></tr><tr><td>SPRIworks Fragment Library System I para Illumina</td> Estação de Geração de Cluster <td>Beckman Coulter</td><td>A288267</td><td></td></tr><tr><td>cBot</td><td>illumina</td><td>SY-312-2001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 Sequenciador de Genoma</td><td>Illumina</td><td>SY-401-1001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Preparação de Biblioteca de RNA TruSeq v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Preparação de Biblioteca de RNA Pequena TruSeq</td><td>Illumina RS-200-0012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Pequena Kit de Sequenciamento de RNA v3</td><td>Bioo Scientific</td><td>5132-05</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td></td></tr></tbody></table>

genoma-largo mediada por análise de inibidor hdac modulação de micrornas e mrnas em b células induzidas a recombinação de dna de classe-interruptor sofrem e diferenciação de células plasmáticas

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Respostas de anticorpos são realizadas através de vários processos, células B crítico-intrínseca, incluindo somática (SHM), recombinação de DNA de classe-switch (RSE) e diferenciação de células plasmáticas. Nos últimos anos, modificações epigenéticas ou fatores, tais como deacetilação de histona e microRNAs (miRNAs), têm sido mostrados para interagir com os programas genéticos de células B a respostas de anticorpos de forma, enquanto a disfunção dos fatores epigenéticos foi encontrada para conduzir a respostas de auto-anticorpos. Analisando a expressão de miRNA e mRNA de todo o genoma em células B em resposta a epigenéticas moduladores é importante para compreender a regulação epigenética da célula B função e anticorpo resposta. Aqui, demonstramos um protocolo para indução de células B submeter-se a diferenciação de RSE e células plasmáticas, tratando estas células B com inibidores de histona deacetilase (HDAC) (IDHs) e analisando a expressão do mRNA e microRNA. Neste protocolo, analisamos diretamente complementares sequências de DNA (cDNA) usando sequenciamento de mRNA de próxima geração (seq-mRNA) e tecnologias de miRNA-seq, mapeamento do sequenciamento lê ao genoma e quantitativa (qRT) a transcrição reversa-PCR. Com estas abordagens, definimos que, em células B induzidas a se submeter a RSE e diferenciação de células plasmáticas, HDI, um regulador epigenético, seletivamente modula a expressão miRNA e mRNA e altera a diferenciação de RSE e células plasmáticas.

Usando nosso protocolo, purificado de células B colocadas com LPS (3 µ g/mL) e IL-4 (5 ng/mL) para 96 h pode induzir a 30-40% da RSE para IgG1 e ~ 10% de diferenciação de células plasmáticas. Após o tratamento com HDI (500µM VPA), a RSE para IgG1 diminuiu para 10-20%, enquanto a diferenciação de células plasmáticas diminuíram de ~ 2% (Figura 1). Inibição mediada por HDI de RSE foi confirmada por uma diminuição da quantidade de pós-recombinação Iμ-Cγ1 e madura VH</sub...

Fatores epigenéticos podem interagir com programas genéticos para modular a expressão gênica e regulam a função de células B. Combinando a estimulação de vitro em células B, qRT-PCR e elevado-throughput do microRNA-sequência e abordagens de RNAm-sequência, podemos analisar a epigenética modulação da expressão de gene e miRNA em células B.

Genoma-largo mediada por análise de inibidor HDAC modulação de microRNAs e mRNAs em B células induzidas a recombinação de DNA de classe-interruptor sofrem e diferenciação de células plasmáticas

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

O objetivo geral deste experimento é induzir linfócitos B a realizarem a troca de classe de anticorpos e diferenciação em células plasmáticas, e analisar a modulação, bem como a regulação epigenética, pela expressão de mRNA do inibidor de HDAC e microRNA em células B. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da resposta de anticorpos de células B, como a modulação epigenética da troca de classe de imunoglobulinas e da diferenciação em células plasmáticas. A principal vantagem desta técnica é fornecer um método simples para modular as funções das células B e definir as alterações em microRNAs e mRNAs mediadas por reguladores epigenéticos.Após eutanasiar um camundongo C57BL6J livre de patógenos específicos e esterilizar a pele de acordo com o protocolo descrito, utilize pinças e tesoura de dissecação autoclavadas para cortar a pele logo abaixo da caixa torácica, a fim de visualizar o baço no lado esquerdo do abdômen, logo abaixo do fígado. Prenda suavemente o baço e corte todos os tecidos conectivos antes de extrair o órgão. Em seguida, coloque o baço em um tubo de microcentrifugação de 1,5 mililitro contendo 1.000 microlitros de meio RPMI 1640 completo.Em seguida, insira um filtro celular de 70 micrômetros em um tubo cônico de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros e despeje o baço do tubo de microcentrífuga sobre o filtro celular. Utilize a ponta de um tubo cônico de centrífuga de polipropileno de 15 mililitros para macerar suavemente o baço através do filtro. Depois, com 15 a 20 mililitros de meio completo, enxágue o filtro.Centrifugue as células a 350 x G durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante. Use um mililitro de tampão de lise ACK para ressuspender o pellet celular e incube por um minuto.Em seguida, adicione quatro mililitros de ACK e incube a suspensão para remover os glóbulos vermelhos da suspensão de baço por mais quatro minutos à temperatura ambiente, com agitação ocasional. Em seguida, adicione 25 mililitros de meio completo para interromper a reação de lise. Centrifugue as células a 350 x G por cinco minutos.Descarte o sobrenatante e adicione um mililitro de meio completo para ressuspender o pellet celular. Em seguida, utilizando um hemocitômetro, conte as células viáveis. Em um tubo estéril de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros, prepare uma suspensão celular de 0,25 a dois mililitros contendo 1 x 10⁸ células por mililitro em meio completo.Adicione soro normal de rato à amostra. Em seguida, adicione 50 microlitros por mililitro do coquetel de isolamento ao tubo. Então, misture as células pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes e incube a amostra à temperatura ambiente por 10 minutos.Adicione 75 microlitros por mililitro de partículas magnéticas revestidas com estreptavidina ao tubo. Pipete suavemente de duas a três vezes para cima e para baixo e incube a amostra à temperatura ambiente por dois minutos e meio. Complete o volume até 2,5 mililitros usando meio RPMI 1640 completo e pipete suavemente de duas a três vezes para homogeneizar.Coloque o tubo aberto no ímã e incube-o em temperatura ambiente por dois minutos e meio. Em seguida, descarte o sobrenatante contendo as células B não tocadas em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Utilize azul de tripano e um hemocitômetro para contar as células.Re-suspenda os linfócitos B purificados em meio RPMI 1640 completo numa concentração final de 0,3 x 10⁶ células por mililitro. Em seguida, adicione aos poços de uma placa de 48 poços um mililitro de linfócitos B purificados a 0,3 x 10⁶ células por mililitro, três microgramas por mililitro de LPS de E. coli, cinco nanogramas por mililitro de IL-4 e, ou zero ou 500 micromolar de HDI. Incube as células a 37 °C e 5% de dióxido de carbono durante 60 horas para análise de QRT-PCR e sequenciamento de mRNA e miRNA de alto rendimento, ou durante 96 horas para análise de citometria de fluxo.Após 96 horas de cultivo, desprenda as células de cada poço pipetando-as para cima e para baixo várias vezes. Transfira a suspensão celular para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Em seguida, utilizando uma centrífuga de bancada, centrifugue as células a 350 x G durante cinco minutos.Em seguida, descarte o sobrenatante. Prepare um coquetel contendo tampão HBSS e os seguintes reagentes: BSA 1%, 0,5 nanogramas por mililitro de anticorpo conjugado de cabra anti-IgM de camundongo, 0,2 nanogramas por mililitro de anticorpo monoclonal conjugado de rato anti-IgG1 de camundongo, 0,2 nanogramas por mililitro de anticorpo monoclonal conjugado de rato anti-B220 de camundongo, 0,2 nanogramas por mililitro de anticorpo monoclonal conjugado com PE-Cy7 de rato anti-CD138 de camundongo e dois nanogramas por mililitro de 7-AAD. Incube as células no escuro, à temperatura ambiente, por 30 minutos.Em seguida, utilize um mililitro de HBSS com 1% de BSA para lavar as células. Use uma centrífuga de bancada para centrifugar as células a 1.500 × g durante cinco minutos. Após descartar o sobrenadante, utilize 300 microlitros de HBSS com 1% de BSA para ressuspender as células e transfira a suspensão celular para um tubo de poliestireno de fundo redondo.Cubra o tubo com papel alumínio para evitar exposição à luz. Para realizar a análise de QRT-PCR de mRNA, inclua o passo de tratamento com DNAse 1. Em seguida, utilize um kit comercial de isolamento de RNA total capaz de recuperar RNA pequeno para extrair RNA de 0,2 a 5 x 10⁶ células, seguindo as instruções do fabricante.Após a síntese de cDNA e a realização de PCR em tempo real quantitativo (QRT-PCR) no mRNA, realize a RT-PCR para microRNA utilizando uma mistura mestra de PCR em tempo real com cyber green, descongelada à temperatura ambiente, mistura mestra de PCR 2x, iniciador específico para miRNA na concentração de 250 nanomolar e um iniciador reverso universal. Após preparar uma mistura de reação de 25 microlitros de acordo com o protocolo descrito, adicione alíquotas de 22,5 microlitros por poço em uma placa de PCR de 96 poços. Em seguida, adicione 2,5 microlitros de cDNA molde aos poços individuais.Selar firmemente o filme da placa. Em seguida, centrifugar a placa a 1.000 x G em temperatura ambiente por um minuto. Colocar a placa no ciclador em tempo real e iniciar o programa de ciclagem descrito no protocolo.Utilizando o protocolo demonstrado neste vídeo, linfócitos B purificados incubados sem PS NIL4 durante 96 horas podem induzir 30 a 40% de CSR para IgG1 e aproximadamente 10% de diferenciação em células plasmáticas. Após o tratamento com HDI, o CSR para IgG1 diminuiu para 10 a 20%, enquanto a diferenciação em células plasmáticas diminuiu para aproximadamente 2%. A inibição do CSR mediada por HDI foi ainda confirmada pela redução no número de transcritos pós-recombinação I mu C gamma 1 e transcritos maduros VHDJH C gamma 1. Conforme medido por QRT-PCR, a expressão de Aicda, que é essencial para CSR e SHM, e de Prdm1 e Xbp1, que são importantes para a diferenciação em células plasmáticas, mostrou-se inibida pelo VPA.Conforme medido por sequenciamento de mRNA de linfócitos B estimulados sem PS Nil4, apenas 0,3% desses RNAs mensageiros altamente expressos foram regulados positivamente pelo HDI em mais de duas vezes, e apenas 0,36% dos RNAs mensageiros altamente expressos, incluindo Aicda, Prdm1 e Xbp1, foram reduzidos pelo HDI em mais de 50%. A análise de sequenciamento de microRNAs no perfil de microRNAs em linfócitos B tratados com HDI ou Nil mostrou que os HDIs regulam seletivamente para cima microRNAs que direcionam Aicda e Prdm1. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro horas e meia a cinco horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter um ambiente de trabalho estéril.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir linfócitos B a sofrerem troca de classe e diferenciação em células plasmáticas, bem como de como modular essas funções por meio de reguladores epigenéticos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo descreve como imunoprecipitação da cromatina (chip) é usado para estudar as alterações dinâmicas ao modelo de cromatina que regulam a transcrição induzida por uma via de transdução de sinal.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

Aqui estamos apresentando uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) procedimento para análise do genoma localização das isoformas de proteínas que diferem em um domínio de ligação de histonas. Estamos aplicando-a-CHIP Seq análise para identificar os alvos da demetilase KDM5A/JARID1A/RBP2 histonas.

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

Após a exposição de antígenos, subpopulações de células ativadas B passam por um processo conhecido como recombinação mudança de classe (CSR) para produzir isotipos de anticorpos com diferentes funções efetoras. O protocolo apresentado neste relatório explica como a RSE pode ser induzido e...

Indução e Avaliação de recombinação mudança de classe em purificada Células B murino

Neste protocolo, descrevemos uma nova técnica BrdU-ChIP-Slot-Western para examinar proteínas e modificações de histonas associadas a DNA recém-sintetizado ou nascente.

Exame de proteínas ligadas ao DNA em células de mamíferos Nascente usar a técnica de-BrdU-chip-Slot Ocidental

O presente método serve para identificar a isoforma específica inibidores da histona deacetilases (HDAC) em células HeLa pela análise de vários substratos UHPLC-MS. Este é um método livre de anticorpos desenvolvido para refletir a atividade HDAC1 e HDAC6 do vida ambiente celular, em contraste com o single-isoforma celular livre ensaios.

Medição simultânea de HDAC1 e atividade HDAC6 em HeLa células usando UHPLC-MS

Este trabalho descreve um protocolo para a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) usando uma linha de células T de mouse maduras. Este protocolo é adequado para investigar a distribuição de marcas de histonas específicas em locais promotores específicos ou em todo o genoma.

Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) em linhas de células T de mouse

Aqui, descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação da cromatina de histonas modificadas de brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA é usado posteriormente para PCR quantitativo para interrogar a abundância e a localização de modificações borne-translational do histone durante todo o genoma.

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, relatamos uma células B in vitro para o modelo de diferenciação de células plasmáticas.

No modelo de diferenciação Vitro de células de memória humana Normal B de plasmócitos de vida longa

Inibidores de acetiltransferases de histona (HATs, também conhecidos como acetiltransferases de lisina), como CBP/p300, são potenciais terapêuticos para o tratamento do câncer. No entanto, são necessários métodos rigorosos para validar esses inibidores. Três métodos in vitro para validação incluem ensaios HAT com acetiltransferases recombinantes, imunoblotting para acetilação de histona na cultura celular, e ChIP-qPCR.

Ensaios para validação de inibidores de acetiltransferase histone

Aqui fornecemos um protocolo para triagem de potenciais fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de células dendríticas (DC) usando transdução lentiviral de shRNA para obter linhas celulares de knockdown estáveis para diferenciação in vitro DC.

Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro

Aprenda a induzir linfócitos B de camundongos C57BL6J a sofrer troca de classe de anticorpos e diferenciação em células plasmáticas, analisando a regulação epigenética por inibidores de HDAC.

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Genoma-largo mediada por análise de inibidor HDAC modulação de microRNAs e mRNAs em B células induzidas a recombinação de DNA de classe-interruptor sofrem e diferenciação de células plasmáticas

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