Name: Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a isolar vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila e analisar seu potencial pró-inflamatório em macrófagos humanos e murinos. Este método padronizado melhora a compreensão da patogenicidade bacteriana.

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Agradecemos Prof. Dr. Markus Schnare por nos fornecer as TLR2 - / - e TLR2 / 4 - / - ratos e Prof. Dr. Carsten Kirschning para TRIF / MyD88 - / - ratos. Partes deste trabalho foi financiado pelo Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: miRSys bio - FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) e Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE médicos RNomics - FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), toda a BS.

1. Prepare médio e placas de ágar <ol><li> Prepare 1 L de meio de caldo (YEB). Dissolve-se 10 g de ases e 10 g de extracto de levedura em 900 ml de água destilada. Ajustar o pH para 6,9 com KOH (5 N). Adiciona-se 10 ml de L-cisteína (0,4 g em 10 ml de água destilada) e 10 mL de Fe (NO3) 3 x9H 2 O (0,25 g em 10 mL de água destilada). Encha até 1 L com água destilada e filtra-se esterilizar o (tamanho de poro: 0,22 pm) solução. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare carvão tamponado extrato de levedura (BCYE) placas de ágar. Dissolve-se 10 g de ases e 10 g de extracto de levedura em 900 ml de água destilada. Ajustar o pH para 6,9 com KOH (5 N). Adiciona-se 15 g de ágar e 2,5 g de carvão activado. Encha até 1 L com água destilada e autoclave. <ol><li> Adiciona-se 10 ml de L-cisteína (0,4 g em 10 ml de água destilada) e 10 mL de Fe (NO3) 3 x9H 2 O (0,25 g em 10 ml de água destilada, ambos esterilizada por filtração através de 0,22 mícronsporos) para BCYE arrefecida (aproximadamente 50 ° C). Despeje placas e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Cultivar L. pneumophila <ol><li> Espalhe estirpe de L. pneumophila Corby (tipo selvagem, WT) em placas de agar e incubam BCYE-los a 37 ° C durante 3 dias. Inocular 10 ml de YEB a uma DO 600 de 0,3 com L. pneumophila da placa pré-cultura; incubar as bactérias a 37 ° C num agitador rotativo (150 rpm) durante 6 h. </li><li> Verifique a pureza da cultura líquida por espalhando 100 jil de suspensão em uma placa de agar de sangue. Incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Adicionar a cultura líquido remanescente para 90 ml de meio fresco YEB e incubar num agitador rotativo (37 ° C e 150 rpm) para atingir uma DO 600 de 3,0-3,5, o que leva aproximadamente 16-20 horas. </li></ol> 3. Prepare-se e quantificar L. pneumophila OMVs NOTA: Realizar todos os seguintes etapa de centrifugaçãos em condições estéreis e a 4 ° C. <ol><li> Centrifuga-se o líquido de cultura a 4.000 xg durante 20 minutos para sedimentar as bactérias. Transferir o sobrenadante para tubos de centrífuga, descarta o sedimento bacteriano, e repetir a centrifugação (4000 xg durante 20 min). Repita este passo uma vez. </li><li> Esterilizada por filtro o restante sobrenadante duas vezes (tamanho de poro: 0,22 pm). Transferir o sobrenadante livre de bactérias para tubos de ultracentrífuga e ultracentrifugação a 100000 xg durante 3 h. </li><li> Decantar o sobrenadante e descartá-lo. Ressuspender o pellet em solução salina estéril OMV tamponada com fosfato (PBS) e ultracentrifugação (100.000 x g, durante 3 h) para remover proteínas contaminantes e LPS. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em OMV 500 ul de PBS estéril. Streak 20 ul numa placa de agar de sangue e numa placa de agar BCYE para excluir contaminação bacteriana das vesículas preparadas. Incubar a placa de agar de sangue durante a noite e a placa de ágar BCYE durante 3 dias a 37 (ambas6; C). </li><li> Quantificar a quantidade de proteína obtida a partir da preparação OMV utilizando um ensaio de ácido bicinconínico de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: A concentração de 100 mL de cultura de L. pneumophila é geralmente de 1 ug / uL. Armazenar os OMVs preparadas e quantificados a -20 ° C. </li></ol> Os macrófagos 4. Pré-tratamento <ol><li> Preparar células THP-1. NOTA: células THP-1 é uma linha celular monocítica derivado de um paciente com leucemia. <ol><li> Adicionar 2x10 5 células THP-1 por 24 poços e diferenciá-los por adição de 20 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) em células tipo macrófagos. Incubar durante 24 h a 37 ° C. </li><li> Substituir o meio com 500 mL de meio fresco e incuba-se durante mais 24 h; a forma ideal para células THP-1 é composto por meio RPMI 1640 alto teor de glucose suplementado com 10% de soro fetal de vitelo. </li></ol></li><li> Isolar os macrófagos derivados da medula óssea de murinos (mBMDM), tal como descrito em referemrência 20. </li><li> Tratar macrófagos THP-1 derivadas ou mBMDM com OMVs. <ol><li> Descongelar as OMVs preparada no Passo 3 e adicioná-los de acordo com a quantidade de proteína (a 0,1, 1, e 10 ug / mL) para a macrófagos de murídeo ou humano. Incubar os macrófagos com as OMVs a 37 ° C durante pelo menos 20 h. Use o sobrenadante para ELISA ou seguir em frente com a etapa 5. </li></ol></li></ol> 5. infectam os macrófagos, Avaliar replicação bacteriana com um (CFU) Ensaio Unidade Formadora de Colônia <ol><li> Use L. pneumophila do passo 2.1, pré-trataram células THP-1 ou mBMDM do passo 4.3, e não tratada pré-macrófagos como controlos (2x10 5/24 poços). Não troque o meio. </li><li> Infectar as células THP-1 com a L. pneumophila Corby WT e mBMDM com um mutante falta-flagelina de L. pneumophila Corby (ambos com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,5; 1x10 5 L. pneumophila / 24 poços) e incubar por 24 e 48 h, respectivamente. Prepare both L. pneumophila Corby (WT ou mutante falta-flagelina) tal como descrito na etapa 2.1. </li><li> Lisar as células no seu meio pela adição de saponina (concentração final: 0,1%) e incuba-se a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Ressuspender as bactérias por pipetagem e transferir a suspensão para um recipiente de reacção. Preparar diluições em série da L. pneumophila molecular contendo meios de comunicação em PBS estéril. </li><li> Streak 50 uL das diluições necessárias em placas de agar BCYE e incubar durante 3 dias a 37 ° C. </li><li> Visualmente contar as colónias formadas. Calcula-se a CFU <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146eq1.jpg" /> Normalizar o resultado da contagem CFU para não pré-tratados, mas os macrófagos, que são fixadas a 100% infectado. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As OMVs de patógenos bacterianos e o impacto destas vesículas de membrana de suas células-alvo estão sendo intensamente estudados. Por exemplo, Clostridium perfringens -derived OMVs induzir a secreção de citocinas em macrófagos, linfócitos B podem ser activados por as OMVs a partir de Borrelia burgdorferi, Helicobacter pylori e -released vesículas de membrana pode actuar em células epiteliais gástricas 21, 22, 23. L. pneumophila, um patogénio intracelular, que pode induzir uma forma grave de pneumonia atípica, também liberta OMVs que são capazes de activar as células epiteliais do pulmão e macrófagos 16, 19. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento em pequena escala de L. pneumophila OMVs da cultura líquida para estudar o papel potencial da OMV em pneumonia. É crítico para trabalhar sob Condit estériliões e para impedir a contaminação de outras bactérias, a fim de obter um L. pneumophila puro -derived preparação OMV. O isolamento de OMVs inclui um passo de filtração através de poros de 0,22 mícrons, a fim de evitar a contaminação do sedimento obtido com OMV L. pneumophila, mesmo que isso reduz o rendimento de OMV, uma vez que as maiores OMVs são perdidas por este passo de filtração. Além disso, testou-se a resposta de macrófagos humanos e de murino para aquelas vesículas isoladas e células infectadas com L. pneumophila para aproximar mais estreitamente a situação em Legionella pneumonia, onde são libertadas OMVs dentro da LCV por bactérias extracelulares 15. As doses empregadas OMV foram estimados de acordo com a quantidade OMV livre em uma infecção in vitro de macrófagos humanos após 24 h de incubação (descrito na referência 20). Para a estimulação de outros receptores ou células em experiências in vivo,outras doses de OMV pode ser necessária e deve ser estabelecida. A análise do efeito de L. pneumophila OMVs representa um avanço com o protocolo descrito por Jager e 24 de Steinert. Aqui, diferenciadas com PMA células THP-1 servir como um modelo para os macrófagos alveolares, devido à disponibilidade limitada de material humano primário. A adição de PMA diferencia as células monocíticas THP-1 em células macrófagos do tipo 25. Além disso, eles são uma linha celular modelo bem conhecido por L. pneumophila estuda 26. Além desta linha celular monocítica humana, são utilizadas células mBMDM. mBMDM são amplamente aceite para o estudo dos efeitos de L. pneumophila 27, 28, 29. A possibilidade de utilização de orifícios genéticos para diferentes TLRs ou outras proteínas torná-los uma ferramenta valiosa para estudar os efeitos de OMV. em order para diminuir a quantidade de murganhos por experiência, mBMDM são usados ​​em vez dos macrófagos alveolares, devido às limitações dos macrófagos. experimentos-chave pode exigir macrófagos alveolares para validação. Além disso o protocolo aqui descrito da ultracentrifugação para purificar as OMVs, é possível efectuar uma centrifugação em gradiente de densidade, que está incluído no protocolo por Chutkan et ai. 30. Isto pode melhorar a pureza da preparação obtida OMV e reduzir a quantidade de agregados de proteína co-purificado, flagelina, e LPS. A pureza da preparação de OMV obtida pode ser analisada por microscopia electrónica de transmissão, ou por análise de rastreamento de nanopartículas como um passo suplementar no controle de qualidade. Isto pode proporcionar um meio adicional de quantificação, para além do processo de medição de proteína aqui apresentada. Opcionalmente, a concentração de LPS pode ser analisada por um teste de lisado de amebócitos de Limulus. Se o rendimento de OMV é baixo, umapasso de concentração adicional por meio de filtros centrífugos pode ser realizada, o que não foi feito aqui. Se o rendimento foi mais baixo do que o esperado, as OMVs foram descartados. Como parte do esforço contínuo para elucidar os mecanismos biológicos e funções por trás OMV, a influência de diferentes condições de estresse sobre a produção OMV poderia ser testada. A perda de nutrientes, as mudanças na temperatura de incubação, ou exposição a agentes nocivos podem ter um impacto sobre a secreção de OMV 31. Condições de estresse possíveis são discutidos no protocolo por Klimentova e Stulik 32. Além disso, hiper ou hypovesiculating mutantes L. pneumophila poderia ser gerado. As preparações de OMV diferentes poderiam, então, ser analisados em experiências de infecção com macrófagos, explantes de tecido de pulmão humano (descritos na Referência 17), ou mesmo em modelos in vivo. Além do papel de OMV na sinalização imune inata, sua influência na comunicação bacterianapodem ser tratadas experimentalmente. Além disso, o impacto de várias cascatas de sinalização imune inata pode ser analisada através da utilização de células de murino ou knockout a geração de CRISPR / Cas9 knockouts em linhas celulares humanas. Esta pesquisa básica em OMVs irá contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de vacina, que já existem para a meningite B transmitida por Neisseria meningitidis 33. A partir do protocolo sobre o isolamento e caracterização OMV, pode-se aplicar isso a outras bactérias Gram-negativas e outras células hospedeiras; ela só precisa de ser ajustada para o crescimento das bactérias em cultura líquida. O protocolo publicado por Chutkan et ai. fornece informações detalhadas sobre a geração de OMVs a partir de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa 30. A cultura não deve atingir a fase estacionária tardia, a fim de evitar aumentos de bactérias lisadas e as proteínas contaminantes e MEMbranas. Além disso, a dose OMV usado para a estimulação das células hospedeiras deve ser determinado de acordo com a quantidade de OMVs presente durante as infecções in vivo, e ainda garantir uma baixa taxa de citotoxicidade. Desta forma, o papel patológico das OMVs, o seu impacto na comunicação inter-espécies, e interacções hospedeiro-patogénio poderia ser examinada. Para estudar melhor o papel da L. pneumophila OMVs em pneumonia, são necessárias preparações OMV padronizados com rendimentos suficientes e experiências de infecção comparáveis. Este protocolo vai ajudar a padronizar os procedimentos de isolamento e estender estudos OMV a outras bactérias Gram-negativas e outras células hospedeiras. Além disso, a pesquisa irá beneficiar da detalhada no conhecimento vitro, que pode ser usado para estender experiências nas configurações in vivo. No futuro, este protocolo pode ser estendido para o isolamento de OMVs de material biológico primário, tais como soro ou lav broncoalveolarfluido de idade, para obter insights sobre a composição da OMV libertada em condições fisiológicas. Isso ajudará a determinar os parâmetros-chave da composição OMV e compreender as propriedades de in vitro OMVs -generated.

<html> As bactérias podem secretar factores de virulência através de diferentes mecanismos 1. Além dos sistemas de secreção bem conhecidas, bactérias Gram-negativas podem trocar informações e fornecer factores de virulência por meio de vesículas da membrana externa (OMVs), que são pequenas, vesículas esferóides 10-300 nm de diâmetro e com uma estrutura de membrana de camada dupla. Eles são segregadas numa variedade de ambientes de crescimento (cultura líquida, sólida, cultura e biofilmes) e em todas as fases de crescimento 2, 3. As OMVs são um importante meio de transporte (por exemplo, para proteínas, toxinas, adesinas, e enzimas, bem como por LPS, que se encontram na superfície do OMV) 4. A carga intraluminal é protegido contra a degradação proteolítica, de modo que é capaz de actuar ao longo de grandes distâncias, e as vesículas podem ser encontrados nos fluidos corporais e órgãos distantes 5, 6,&quot;xref&quot;&gt; 7, 8. Eles não só pode ser reconhecido e absorvidos pelas células eucarióticas 9, 10, mas, além disso, eles são capazes de facilitar a ligação de bactérias e a sua invasão em células hospedeiras 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) é uma bactéria Gram-negativa que pode libertar OMVs. No pulmão humano, que infecta primariamente os macrófagos alveolares, apesar de seu hospedeiro natural são de água doce amebas 11. Uma infecção L. pneumophila pode causar doença do legionário, uma forma grave de pneumonia 12. Ela bloqueia a fusão do fagossoma-lisossoma na célula hospedeira. Ele também recruta organelas de acolhimento, em que um nicho de replicação, a Legionella -Contendo vacúolo (LCV), é formado 13, 14. a degradação lisossómica é inibido não só por tra proteínas efetorasnslocation através do sistema de secreção de tipo IV, mas também pela libertação de OMVs 15. A purificação de OMVs a partir de culturas bacterianas é necessário para analisar o seu efeito em células receptoras. Estudos anteriores voltadas para o teor de proteína L. pneumophila OMV e sobre a influência das vesículas em células epiteliais alveolares 16, mas estudos posteriores com transplantes de tecidos do pulmão humano demonstraram que L. pneumophila OMVs são ocupados por macrófagos alveolares 17. Como apresentam padrões OMVs associado de agentes patogénicos moleculares (PAMPs) e outros antigénios bacterianos, que pode ter um impacto sobre a infecção de células eucarióticas e modular a resposta imune do hospedeiro 18. L. pneumophila OMVs fundir rapidamente com membranas de células hospedeiras e, por outro lado, eles activar o TLR2 19 membranoso. Como é sabido que o L. pneumophila OMVs estimular macrófagos e células epiteliais de uma forma pró-inflamatória 16, 17, analisou-se o impacto das OMVs no processo de infecção em macrófagos humanos e de murídeo. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a cultura de L. pneumophila em cultura líquida para isolar as OMVs secretadas por ultracentrifugação diferencial e para avaliar o impacto das vesículas em células hospedeiras eucarióticas, quer directamente ou depois de uma infecção.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemanha)</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>rotor de 70 Ti</td><td>Beckman Coulter Incorporation (Califórnia, EUA)</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)</td> <td>9138.2</td><td></td></tr><tr><td>carvão ativado</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>X865.2</td><td></td></tr><tr><td>ágar-ágar, Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>5210.2</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Columbia com 5% de sangue de ovelha</td><td>Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemanha)</td><td>254005</td><td></td></tr><tr><td>cubetas</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemanha)</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (humano)</td><td>BD OptEIA&trade;; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemanha)</td><td>IL-8: 555244 IL-6: 550799</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (murina)</td><td>DuoSet, R& D (Minneapolis, EUA)</td><td>CXCL1: DY453-05</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3x9H2O</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemanha)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha)</td><td>40830469</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha)</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Circuito de inoculação&nbsp;</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemanha)</td><td>86.1567.010</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>6751.1</td><td></td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby</td><td>---</td><td>---</td><td>gentilmente cedido pela Profª Dra. Antje Flieger (RKI, Berlim, Alemanha)</td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby &Delta; flaA</td><td>---</td><td>---</td><td>gentilmente cedido pelo Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlim, Alemanha)</td></tr><tr><td>L-cystein</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mBMDM</td><td>---</td><td>---</td><td>gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Alemanha) e Prof Dr. Carsten Kirschning (Universidade Duisburg Essen, Essen, Alemanha)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom GmbH (Berlim, Alemanha)</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemanha)</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr><tr><td>agitador rotativo (MaxQ 6000)</td><td>Thermo Fisher Scientific Alemanha BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha)</td><td>SHKE6000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 glicose alta</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemanha)</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>saponina</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>9622.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 10</td><td>Biochrom Ltd (Cambridge, Inglaterra)</td><td>80-2116-30</td><td></td></tr><tr><td>filtro estéril (tamanho do poro: 0.22 &micro; m)</td> <td>Corning Incorporated (Nova York, EUA)</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemanha)</td><td>88081201-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Discovery 100 SE</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>extrato de levedura</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)</td> <td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha)</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

legionella pneumophila outer membrane vesículas: isolamento e análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

As bactérias são capazes de secretar uma variedade de moléculas por meio de vários sistemas secretores. Além da secreção de moléculas no espaço extracelular ou diretamente em outra célula, as bactérias Gram-negativas também podem formar vesículas de membrana externa (OMVs). Essas vesículas de membrana podem entregar sua carga a longas distâncias, e a carga é protegida da degradação por proteases e nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) é um patógeno Gram-negativo intracelular que causa uma forma grave de pneumonia. Em humanos, infecta macrófagos alveolares, onde bloqueia a degradação lisossômica e forma um vacúolo de replicação especializado. Além disso, L. pneumophila produz OMVs sob várias condições de crescimento. Para entender o papel dos OMVs no processo de infecção de macrófagos humanos, estabelecemos um protocolo para purificar vesículas de membrana bacteriana de cultura líquida. O método é baseado na ultracentrifugação diferencial. Os OMVs enriquecidos foram posteriormente analisados em relação à sua quantidade de proteína e lipopolissacarídeo (LPS) e foram então usados para o tratamento de uma linha de células monocíticas humanas ou macrófagos derivados da medula óssea murina. As respostas pró-inflamatórias dessas células foram analisadas por ensaio imunoenzimático. Além disso, foram analisadas alterações em uma infecção subsequente. Para tanto, a replicação bacteriana de L. pneumophila em macrófagos foi estudada por ensaios de unidades formadoras de colônias. 
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a purificação de OMVs de L. pneumophila de cultura líquida por ultracentrifugação e para a análise a jusante de seu potencial pró-inflamatório em macrófagos.

A montagem experimental para preparar a L. pneumophila OMVs e para analisar a sua influência na resposta pró-inflamatória de macrófagos após infecção está representado na Figura 1. O potencial pro-inflamatória das OMVs preparados podem ser analisados em células THP-1 diferenciadas com PMA, que é mostrado na Figura 2. As células THP-1 respondem com um aumento de tempo e dependente da dose de IL-8 e IL-6 secreção. Além disso, a influência de diferentes TLRs no reconhecimento de L. pneumophila OMV podem ser analisados usando mBMDM de diferentes origens genéticas, tal como apresentado pelo ELISA CXCL1 na Figura 3. mBMDM de ratinhos WT CXCL1 segregadas, após estimulação OMV, enquanto mBMDM TLR2 / 4 - / - segregado significativamente menos. Para estudar o impacto de L. pneumophila OMVs na replicação bacteriana em THP-1 macrófagos, as células foram pré-incubadas com as OMVs e, em seguida, adicionalmente infectadoscom L. pneumophila (Figura 4 A). A pré-estimulação de macrófagos de THP-1 derivadas de primeira reduz a replicação bacteriana após 24 horas de infecção, mas leva a uma duplicação em CFU contar no ponto de tempo posterior (48 h pi). O impacto do receptor de tipo Toll (TLR) de sinalização sobre o reconhecimento OMV após a infecção dos macrófagos pode ser avaliada por mBMDM, como apresentado na Figura 4 B. Aumenta bacterianas de replicação por dez vezes em mBMDM de animais WT após a OMV pré-incubação, enquanto TLR2 - / - e TRIF / MyD88 - / - células não apresentam este aumento na replicação pneumophila L.. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig1.jpg" /> Figura 1: Procedimento experimental. (A) L. pneumophila Corby WT a partir de 10-cm BCYE placas de agar são utilizadas para inocular um pequeno cultura líquida (10 ml), que é transferido para 90 ml de YEB frescomeio após 6 h. Um pequeno volume também é revestida sobre uma placa de agar de sangue para verificar a pureza. As bactérias são incubadas a 37 ° C até que a fase estacionária precoce (DO 600 = 3,0-3,5). (B) O líquido de cultura é centrifugado e esterilizado por filtração para remover as bactérias. O sobrenadante livre de Legionella é em seguida ultracentrifugado a obter um sedimento OMV, que é ressuspenso em PBS e ultracentrifugado novamente. As vesículas isoladas são suspensas, verificada a pureza, e quantificadas para a quantidade de proteína. A barra de escala representa 2,5 cm. (C) macrófagos humanos ou murinos são estimuladas com as OMVs quantificados. O sobrenadante de cultura de células pode ser utilizado para o ELISA, ou macrófagos pode ser infectado com L. pneumophila para determinar a replicação bacteriana por ensaio de CFU em 10 cm BCYE placas de agar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </a&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig2.jpg" /> Figura 2: A activação pró-inflamatórias de células THP-1 de L. pneumophila OMVs. (A) Aqui, a linha de células monocíticas THP-1 é usado como um modelo para os macrófagos alveolares. Células diferenciadas com PMA-THP-1 foram tratadas com doses crescentes de L. pneumophila OMVs (0,01-25 ug / mL), durante 24 e 48 h, respectivamente. O sobrenadante isento de células foi utilizado para ELISA de IL-8. Os valores médios de três experiências independentes ± SEM são mostrados. As células THP-1 respondeu a tão pouco como 0,01 ng / mL L. pneumophila OMVs com significativa da secreção de IL-8, o que foi tempo e dose-dependente. (B) L. pneumophila OMVs (0,1-10 ug / mL) foram utilizadas para estimular as células THP-1 diferenciadas com PMA-. O sobrenadante foi recolhido depois de 24 e 48 h de incubação, e a IL-6 libertada foi medida no sobrenadante através de ELISA. Os valores médios de três experiências independentes ± SEM são mostrados. As células THP-1 segregadas quantidades significativas de IL-6, mesmo com a dose mais baixa de OMVs (0,1 ug / mL). A secreção de IL-6 aumentou com o aumento das doses de OMV e com tempos de incubação prolongados. Estatísticas: teste de Mann-Whitney; * P &lt;0,05 e ** p &lt;0,01 em comparação com o correspondente 0 ug / mL de OMV. Reproduzido com permissão de Referência 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig3.jpg" /> Figura 3: A activação de pró-inflamatória de macrófagos depende de TLR2 / 4. mBMDM de WT e TLR2 / 4 - / - ratos foram incubadas com L. pneumophila OMVs (0,1 ou 1 ug / mL). secreção CXCL1 foi analisada por ELISA após 24 e 48 h, respectivamente. ovalores médios ± SEM de três experiências independentes são apresentados. mBMDM de ratinhos WT respondeu com uma secreção CXCL1 dependente da dose após incubação a L. pneumophila OMV. TLR2 / 4 - / - mBMDM segregado significativamente menos CXCL1 em comparação com WT mBMDM, e esta secreção não aumentou dependentemente da dose. Estatísticas: teste de Mann-Whitney; * P &lt;0,05 em comparação com o correspondente 0 ug / mL OMV; #p &lt;0,05 em comparação com uma amostra de WT igualmente tratada. Reproduzido com permissão de Referência 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig4.jpg" /> Figura 4: replicação L. pneumophila OMV pré-incubação aumenta bacteriana em macrófagos. (A) Diferenciadas As células THP-1 foram pré-incubadas com as OMVs (0,1, 1, ou 10 μ; G / ml) ou LPS / IFN-γ (200 ng / mL de cada vez) ou foram deixados sem tratamento para controlo. Após a pré-incubação (20 horas), as células THP-1 foram infectadas com L. pneumophila Corby WT (MOI de 0,5) durante 2, 24, e 48 h, respectivamente. As células THP-1 foram lisadas pela adição de saponina, e as bactérias foram semeadas em placas de agar BCYE. CFUs foram calculadas em relação a 0 ug / mL OMV após cada ponto de tempo. As barras representam os valores médios ± SEM de três experiências independentes, cada uma realizada em duplicado técnicas. Não houve diferença na captação bacteriana (2 h após a infecção (pi)) em comparação com células não pré-tratados. Alterações na replicação bacteriana foram determinadas após 24 e 48 h, respectivamente. LPS / células THP-1 pré-tratados IFN-γ mostraram uma redução na carga bacteriana 24 h pi Isto também foi observado dependente da dose, para células pré-tratadas L. pneumophila OMV. No ponto de tempo posterior (48 h pi), as células THP-1 pré-OMV tratados mostraram uma duplicação em L. pneumophila replicação, enquanto que o LPS / IFN-y macrófagos pré-tratados mostraram uma redução da carga bacteriana. Estatísticas: teste de Mann-Whitney; * P &lt;0,05 e ** p &lt;0,01 em comparação com o correspondente 0 ug / mL de OMV. (B) mBMDM a partir de ratinhos com diferentes antecedentes genéticos (WT, TLR2 - / -, e TRIF / MyD88 - / -) foram pré-incubadas com 0,1 ug / mL L. pneumophila OMVs durante 20 h e foram depois infectadas com um flagellin- mutante deficiente de L. pneumophila Corby (MOI de 0,5) durante 48 h. mBMDM foram lisadas pela adição de saponina, e a Legionella foram plaqueadas em placas de agar BCYE. O CFU foram calculadas em relação a 0 ug / mL de OMV, indicado pela linha a cheio. As barras representam os valores médios ±± SEM de três experiências independentes, cada uma realizada em duplicado. mBMDM de ratinhos WT mostrou um aumento na replicação da L. pneumophila OMV após pré-tratamento. TLR2 - / - mostraram significativamente reduzida macrófagos <em&gt; Replicação Legionella, que foi comparável ao TRIF / MyD88 - / - mBMDM. Estatísticas: teste de Mann-Whitney; P &lt;0,05 em comparação com a amostra de WT. Reproduzido com permissão de Referência 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, nós descrevemos a purificação de Legionella pneumophila (L. pneumophila) vesículas de membrana externa (OMVs) a partir de culturas líquidas. Estas vesículas purificados são então usados ​​para o tratamento de macrófagos para analisar o seu potencial pro-inflamatória.

Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

O objetivo geral deste estudo é purificar Vesículas da Membrana Externa ou OMVs de Legionella pneumophila de maneira padronizada e analisar sua influência na replicação bacteriana em macrófagos humanos e murinos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa de vesículas da membrana externa. Por exemplo, o procedimento padronizado para preparação de OMVs pode auxiliar no estudo de seu impacto na interação hospedeiro-patógeno.A principal vantagem desta técnica é que ela fornecerá um protocolo padronizado para estudar o impacto das VMOs de Legionella pneumophila sobre macrófagos humanos ou murinos, o que aprimorará nossa compreensão da patogenicidade de Legionella pneumophila. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao refletirmos sobre o possível potencial pró-inflamatório das VMOs e sobre como isso poderia influenciar o curso da infecção, já que as VMOs são liberadas pela Legionella tanto no interior da célula hospedeira quanto extracelularmente. O procedimento será demonstrado por Kerstin Hoffmann, técnica do meu laboratório, e Analina Young, pesquisadora pós-doutora.Para começar, enquanto trabalha em condições estéreis, espalhe a cepa core B de L.pneumophila em placas de ágar BCYE e incube a 37 graus Celsius por três dias. Use a L.pneumophila de uma placa de pré-cultura para inocular 10 mililitros de meio YEB com uma OD600 de 0,3 e incube as bactérias a 37 graus Celsius em agitador rotativo durante seis horas. Verifique a pureza da cultura líquida espalhando 100 microlitros da suspensão em uma placa de ágar sangue.Incube a placa de ágar sangue durante a noite a 37 graus Celsius. Adicione o cultivo líquido restante a 90 mililitros de meio YEB fresco e incube o cultivo em agitador rotativo até atingir uma OD600 entre 3,0 e 3,5. Centrifugue o cultivo líquido a 4.000 g por 20 minutos para obter o pellet bacteriano.Em seguida, transfira o sobrenatante para tubos c&ocirc;nicos novos. Descarte os pellets bacterianos e centrifugue as amostras novamente antes de repetir a etapa de centrifuga&ccedil;&atilde;o mais uma vez. A seguir, filtre o sobrenatante restante duas vezes para esteriliza&ccedil;&atilde;o por filtra&ccedil;&atilde;o.Em seguida, transfira o sobrenadante livre de bactérias para tubos de ultracentrifugação e centrifugue as amostras a 100.000 g a quatro graus Celsius por três horas. Decante o sobrenadante e descarte-o. Em seguida, use PBS estéril para ressuspender os pellets de OMV e reúna-os.Repita a etapa de ultracentrifugação para remover proteínas contaminantes e LPS livre. Agora, descarte o sobrenadante e seque o tubo de ultracentrifugação com um cotonete estéril. Re-suspenda o pellet de OMV com 500 microlitros de PBS estéril.Em seguida, alique 20 microlitros em cada placa de ágar sangue e ágar BCYE para excluir contaminação bacteriana da vesícula preparada. Incube a placa de ágar sangue durante a noite e a placa de ágar BCYE por três dias. Utilize o ensaio BCYE de acordo com as instruções do fabricante para quantificar a quantidade de proteína da preparação obtida de OMV.Após diferenciar as células THP-1 em macrófagos de acordo com o protocolo descrito no texto, utilize 500 microlitros de meio fresco para substituir o meio de diferenciação e incube as células por mais 24 horas a 37 graus Celsius. Para tratar as células THP-1 ou BMDM murinos com OMVs, descongele as OMVs previamente preparadas e adicione a quantidade apropriada às células. Incube os macrófagos com OMVs a 37 graus Celsius por pelo menos 20 horas para infectar células THP-1 pré-tratadas ou não tratadas com a linhagem selvagem de L.pneumophila cepa core B ou células BMDM murinas com um mutante deficiente em flagela dessa linhagem, sem trocar o meio das células.Adicione bactérias em uma MOI de 0,5, o que equivale a um vezes 10 à quinta L. pneumophila por poço. Incube as culturas por 24 e 48 horas, respectivamente. Para lisar as células, adicione saponina em uma concentração final de 0,1% e incube as células por cinco minutos.Em seguida, re-suspenda os macrófagos lisados por pipetagem e transfira a suspensão para um recipiente de reação. Use PBS estéril para preparar diluições seriadas da suspensão de L.pneumophila. Em seguida, plaque 50 microlitros das diluições necessárias em placas de ágar BCYE e incube as placas por três dias.Conte visualmente as colônias formadas a olho nu e realize os cálculos de acordo com o protocolo descrito no texto. Neste experimento, ao examinar o potencial pró-inflamatório de OMVs de L. pneumophila, células THP-1 diferenciadas com PMA respondem com um aumento dependente do tempo e da dose na secreção de IL-8 e IL-6. Aqui, a influência de diferentes receptores tipo toll na reconhecimento de OMVs de L. pneumophila foi analisada em BMDMs murinos com diferentes origens genéticas, utilizando um ensaio de ELISA para CXCL-1.Mádulas ósseas derivadas de camundongos selvagens secretaram CXCL-1 após a estimulação com OMVs, enquanto mádulas ósseas derivadas de camundongos com duplo knockout de TLR2/4 secretaram significativamente menos. Para estudar o impacto das OMVs de L. pneumophila na replicação bacteriana em macrófagos THP-1, as células foram pré-incubadas com OMVs por 20 horas e posteriormente infectadas com L. pneumophila. A pré-estimulação de macrófagos derivados de THP-1 reduz primeiramente a replicação bacteriana de forma dependente da dose após 24 horas de infecção, enquanto resulta em uma duplicação na contagem de UFC no ponto temporal posterior.Como mostrado neste experimento, a pré-estimulação de BMDMs murinos com OMVs resulta em um aumento de dez vezes na contagem de UFC em BMDMs murinos de animais selvagens, enquanto macrófagos TLR2 knockout e TRIF/MyD88 não apresentam esse aumento na replicação de L. pneumophila após a pré-incubação com OMVs. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em condições estéreis e verificar a contaminação bacteriana das OMVs purificadas. Caso contrário, as análises subsequentes não fornecem resultados conclusivos.Após este procedimento, outros métodos, como a análise de rastreamento de nanopartículas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como qual mutante de Legionella produz mais ou menos OMVs, ou para investigar o impacto de diferentes condições de estresse na secreção de OMVs. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa de OMVs explorarem o impacto das OMVs nas interações entre hospedeiro e patógeno in vitro e, posteriormente, in vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar OMVs e de como começar a analisar seu efeito na infecção subsequente de macrófagos.Este protocolo pode então ser aplicado a diferentes bactérias gram-negativas e suas respectivas células hospedeiras, adaptando-se os tempos de incubação e crescimento. Não se esqueça de que o trabalho com Legionella pneumophila pode ser extremamente infeccioso para os seres humanos, portanto, o trabalho sempre deve ser realizado sob uma bancada estéril ao manipular Legionella e ao executar este procedimento.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo descreve um método para o isolamento e purificação de...

Purificação de vacúolos patógeno de<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados Fagócitos

Fonte: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o pré-tratamento de macrófagos com vesículas de membrana externa (OMVs) de Legionella pneumophila para examinar seu efeito na replicação bacteriana. Ao alterar a sinalização imunológica do hospedeiro, os OMVs tornam os macrófagos mais permissivos à infecção. Contagens de colônias mais altas nas células...

Ensaio da replicação de Legionella pneumophila em macrófagos pré-tratados com vesículas de membrana externa

Fonte: Jung, A. L., et al. Vesículas da membrana externa da Legionella pneumophila : Isolamento e análise de seu potencial pró-inflamatório em macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o isolamento das vesículas de membrana externa (OMVs) da Legionella pneumophila usando centrifugação sequencial, filtração estéril e ultracentrifugação. Os OMVs purificados, enriquecidos em proteínas de membrana e lipopolissacarídeos, são adequados para estudos de interação hospedeiro-patógeno.

Isolamento baseado em ultracentrifugação das vesículas externas da membrana Legionella pneumophila

Neste vídeo, quantificamos Listeria monocytogenes intracelulares e extracelulares, uma bactéria patogênica intracelular, após a infecção de macrófagos cultivados in vitro usando citometria de fluxo.

Análise de citometria de fluxo de Listeria monocytogenes intracelular e extracelular emergente in vitro

Esta técnica proporciona um método para colher, normalizar e quantificar o crescimento intracelular das bactérias, que são pré-cultivadas em células hospedeiras naturais protozoários antes da infecção de células de mamíferos. Este método pode ser modificado para acomodar uma grande variedade de células hospedeiras para a fase de escorvamento, bem como tipos de células-alvo.

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

A larva da cera traça Galleria mellonella foi recentemente estabelecido como um modelo in vivo para estudar a infecção Legionella pneumophila. Aqui, nós demonstramos técnicas fundamentais para caracterizar a patogênese da Legionella nas larvas, incluindo a inoculação, a medida da virulência bacteriana e replicação, bem como extração e análise de hemócitos infectados.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Descrevemos dois ensaios in vitro e in vivo de infecção que podem ser usados para analisar as atividades dos fatores do hospedeiro-codificação.

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.

Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

O protocolo proposto inclui diretrizes sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente.

Isolamento de Vesículas Extracelulares de Baixo Conteúdo de Endotoxinas Derivadas de Linhagens Celulares Cancerígenas

Aprenda a isolar vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila e analisar seu potencial pró-inflamatório em macrófagos humanos e murinos. Este método padronizado melhora a compreensão da patogenicidade bacteriana.

Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

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