Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

O objetivo geral deste estudo é purificar as vesículas da membrana externa ou OMVs de Legionella pneumophila de forma padronizada e analisar sua influência na replicação bacteriana em macrófagos humanos e murinos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa de vesículas de membrana externa. Por exemplo, o procedimento padronizado para a preparação do OMV pode ajudar a estudar seu impacto na interação patógeno-hospedeiro.

A principal vantagem desta técnica é que ela fornecerá um protocolo padronizado para estudar o impacto dos OMVs de Legionella pneumophila em macrófagos humanos ou murinos e isso melhorará nossa compreensão da patogenicidade de Legionella pneumophila. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando pensamos sobre o possível potencial pró-inflamatório dos OMVs e como isso pode influenciar o curso da infecção, pois os OMVs são liberados pela Legionella tanto dentro da célula hospedeira quanto extracelularmente. O procedimento será demonstrado por Kerstin Hoffmann, técnica do meu laboratório e Analina Young, pesquisadora de pós-doutorado.

Para começar, enquanto trabalha em condições estéreis, espalhe o núcleo B da cepa de L. pneumophila em placas de ágar BCYE e incube a 37 graus Celsius por três dias. Use a L.pneumophila de uma placa de pré-cultura para inocular 10 mililitros de meio YEB a um OD600 de 0,3 e incube a bactéria a 37 graus Celsius em um agitador rotativo por seis horas. Verifique a pureza da cultura líquida espalhando 100 microlitros da suspensão em uma placa de ágar sangue.

Incube a placa de ágar sangue durante a noite a 37 graus Celsius. Adicione a cultura líquida restante a 90 mililitros de meio YEB fresco e incube a cultura em um agitador rotativo até atingir OD600 de 3,0 a 3,5. Centrifugar a cultura líquida a 4 000 g durante 20 minutos para peletar as bactérias.

Em seguida, transferir o sobrenadante para tubos de centrifugação frescos. Rejeitar os grânulos bacterianos e centrifugar novamente as amostras antes de repetir mais uma vez o passo de centrifugação. Em seguida, filtre e esterilize o sobrenadante restante duas vezes.

Em seguida, transfira o sobrenadante livre de bactérias para tubos de ultracentrífuga e gire as amostras a 100.000 g em quatro graus Celsius por três horas. Transvase o sobrenadante e deite-o fora. Em seguida, use PBS estéril para ressuspender os pellets OMV e agrupá-los.

Repita a etapa de ultracentrifugação para remover proteínas contaminantes e LPS livre. Agora, descarte o sobrenadante e seque o tubo de ultracentrífuga com um cotonete estéril. Ressuspenda o pellet OMV com 500 microlitros de PBS estéril.

Em seguida, coloque 20 microlitros cada em placas de ágar sangue e ágar BCYE para excluir a contaminação bacteriana da vesícula preparada. Incubar a placa de ágar sangue durante a noite e a placa de ágar BCYE por três dias. Use o ensaio BCYE de acordo com as instruções do fabricante para quantificar a quantidade de proteína para a preparação OMV obtida.

Depois de diferenciar as células THP-1 em macrófagos de acordo com o protocolo de texto, use 500 microlitros de meio fresco para substituir o meio de diferenciação e incube as células por mais 24 horas a 37 graus Celsius. Para tratar células THP-1 ou BMDM murinas com OMVs, descongele OMVs previamente preparadas e adicione a quantidade apropriada às células. Incubar os macrófagos com OMVs a 37 graus Celsius por pelo menos 20 horas para infectar células THP-1 pré-tratadas ou não tratadas com L. pneumophila do tipo selvagem cepa core B ou células murinas BMDM com um mutante sem flagelos desta cepa sem alterar o meio das células.

Adicione bactérias a um MOI de 0,5, o que equivale a uma vezes 10 elevado ao quinto L. pneumophila por poço. Incubar as culturas por 24 e 48 horas, respectivamente. Para lisar as células, adicione saponina a uma concentração final de 0,1% e incube as células por cinco minutos.

Em seguida, ressuspender os macrófagos lisados pipetando e transferir a suspensão para um recipiente de reacção. Use PBS estéril para preparar diluições seriadas da suspensão de L. pneumophila. Em seguida, listre 50 microlitros das diluições necessárias em placas de ágar BCYE e incube as placas por três dias.

Conte visualmente as colônias formadas a olho nu e faça cálculos de acordo com o protocolo de texto. Neste experimento, examinando o potencial pró-inflamatório dos OMVs de L. pneumophila, as células THP-1 diferenciadas em PMA respondem com um aumento dependente do tempo e da dose na secreção de IL-8 e IL-6. Aqui, a influência de diferentes receptores toll-like no reconhecimento de L. pneumophila OMV foi analisada em BMDMs murinos com diferentes origens genéticas usando um ensaio CXCL-1 ELISA.

BMDMs murinos de camundongos selvagens secretaram CXCL-1 após estimulação OMV, enquanto BMDMs murinos de TLR2 / 4 nocaute duplo secretaram significativamente menos. Para estudar o impacto dos OMVs de L. pneumophila na replicação bacteriana em macrófagos THP-1, as células foram pré-incubadas com OMVs por 20 horas e, em seguida, infectadas adicionalmente com L. pneumophila. A pré-estimulação de macrófagos derivados de THP-1 primeiro reduz a dose de replicação bacteriana de forma dependente após 24 horas de infecção, enquanto leva a uma duplicação na contagem de UFC no momento posterior.

Como mostrado neste experimento, a pré-estimulação de BMDMs murinos com OMVs resulta em um aumento de dez vezes na contagem de UFC em BMDM murinos de animais selvagens, enquanto o nocaute para TLR2 e macrófagos TRIF / MyD88 não mostram esse aumento na replicação de L. pneumophila após a pré-incubação de OMV. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em condições estéreis e verificar se há contaminação bacteriana dos OMVs purificados. Caso contrário, a análise downstream não fornece resultados conclusivos.

Após este procedimento, outros métodos, como a análise de rastreamento de nanopartículas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual mutante de Legionella está produzindo mais ou menos OMVs ou para investigar o impacto de diferentes condições de estresse na secreção de OMVs. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa de OMV explorarem o impacto dos OMVs nas interações patógeno-hospedeiro in vitro e depois in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar OMVs e como começar a analisar seu efeito na infecção subsequente de macrófagos.

Este protocolo pode então ser aplicado para diferentes bactérias gram-negativas e suas respectivas células hospedeiras após a adaptação dos tempos de incubação e crescimento. Não se esqueça de que trabalhar com Legionella pneumophila pode ser extremamente infeccioso para os seres humanos, portanto, o trabalho deve sempre ser realizado sob uma bancada estéril durante o manuseio da Legionella e a realização deste procedimento.