Name: Isolamento de rato Endometrial epiteliais e estromais para células In Vitro decidualization (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a isolar células epiteliais e estromais do endométrio de rato para cocultura e estudo da descidualização in vitro. Este método padronizado permite investigar sinalização parácrina em medicina reprodutiva.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação de Pesquisa-Flanders (FWO G.0856.13N) eo Conselho de Pesquisa da KU Leuven (OT / 13/113). KDC é financiado pelo FWO Bélgica. AH é financiado pelo OT / 13/113. Nós gostaríamos de agradecer ao celular instalação de imagem Núcleo da KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) para o uso do microscópio confocal.

AlexaFluor Todos os experimentos com animais para este estudo foram aprovados pelo comitê de ética da KU Leuven (Bélgica) (Projeto P174 / 2013). Os ratinhos foram alojados sob condições padrão, com acesso ad libitum a peletes de alimento e água da torneira, e mantidos em condições controladas (23 ± 1,5 ° C, humidade relativa é de 40 - 60%, 12/12 ciclo de luz / escuro). 1. Ratos <ol><li> Use comercialmente disponível estirpe de ratinhos (ou seja, C57BL / 6, do sexo feminino 8 - 12 semanas de idade). Tipicamente, 4 - 5 ratinhos irá produzir uma quantidade adequada de células para experiências adicionais. </li><li> Injectar ratos intactos por via subcutânea com 100 uL do 17β-estradiol (E2) solução (100 ng / 100 mL) durante 3 consecutivo d antes do isolamento, a fim de padronizar a fase do ciclo de estro dos animais e para induzir a proliferação de cancro do endométrio células. A necessidade de verificar a fase do ciclo dos ratinhos antes de iniciar o protocolo é ser evitáveiscausa do 3 d &#39;tratamento com estradiol. </li></ol> 2. Preparações <ol><li> Adicione uma solução de 100 ng / 100 ul E2 no óleo de amendoim. Para as injecções de cinco ratinhos (como descrito em 1.2), é necessário uma quantidade de 1,5 mL. <ol><li> Dissolve-se 1 mg de E2 em 1 ml de etanol para se ter uma solução stock de 1 mg / mL. </li><li> Diluir esta solução estoque 1: 1.000 em óleo de amendoim. </li></ol></li><li> Adicione 500 mL de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBBS) 1x complementado com 100 U / mL de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina (adiante referida como HBSS +). </li><li> Adicione 500 mL de filtrado celular rato Estroma Endometrial (MESC) forma a MESC cultura: de Dulbecco Modified Eagle Médium / Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12) com vermelho de fenol, L-glutamina e cloreto de 4- (2-Hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico ácido, N - (2-Hidroxietil) piperazina-N &#39;- (ácido 2-etanossulfónico) (HEPES) contendo FBS a 10%, 0,5 ug / mL de anfotericina B, e 100 ug / mL de gentamicina (Further referido como meio MESC). </li><li> Adicione 500 mL de filtrado meio MESC 2% a cultura durante MESC decidualização: DMEM / F12 com vermelho de fenol, L-glutamina e HEPES contendo 2% de FBS, 0,5 ug / mL de anfotericina B, e 100 ug / ml de gentamicina. </li><li> Preparar 500 mL de filtrado celular rato Endometrial epitelial (MEEC) meio: DMEM contendo FBS a 10%, 0,5 ug / mL de anfotericina B, 100 ug / ml de gentamicina, 25% MCDB 105-forma, e 5 ug / ml de insulina (adiante referida como meio MEEC). </li><li> Prepare lamelas de poli-L-lisina (PLL) revestidos para a cultura MESC. <ol><li> Dissolve-se 25 mg de PLL em 250 ml de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um. </li><li> Adicionar lamelas estéreis numa placa de 12 poços. Adicionar 300 uL de PLL dissolvido em as lamelas. </li><li> Remover a solução após 30 minutos de incubação. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C até à sua utilização (até 1 - 2 meses). </li></ol></li><li> Prepare a 10 mg / mL solução estoque of colagenase tipo IA e armazenar alíquotas de 300 mL a -20 ° C. Filtrar antes do uso. </li></ol> 3. preparativos necessários 24 h antes do isolamento <ol><li> Prepare lamelas revestidas de colágeno para a cultura MEEC. <ol><li> Prepara-se uma solução de ácido acético 0,02 M em água destilada (1 mL por lamela). </li><li> Adicionar 150 uL colágeno em 12 mL de ácido acético 0,02 M para obter uma concentração final de 50 ug / mL. </li><li> Adicionar lamelas estéreis numa placa de 12 poços. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de colagénio (ver 3.1.2). </li><li> Incubar S / N (mínimo 12 horas) a 37 ° C. Durante o isolamento: </li><li> Remover a solução de colagénio fora as lamelas por sucção e deixá-la secar ao ar num ambiente estéril (na câmara de fluxo laminar). </li><li> Lavam-se as lamelas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li></ol></li><li> Prepara-se uma solução de pancreatina a 2,5% por adição de 0,25 g de pancreatina num tubo canónica de 15 mL contendo 10 mL deHBSS +. Agitar (200 rpm) à solução a 37 ° C durante 1 h para aumentar a solubilidade. Armazenar a 4 ° C. </li></ol> 4. isolamento e cultura de células de camundongo endometrial epiteliais (MEEC) e do rato endométrio do estroma Cells (MESC) <ol><li> Adicionar 25 mg de tripsina em um tubo de 15 ml contendo solução de pancreatina 2,5% (ver 3.2) para acabar com uma solução final contendo 0,25% de tripsina (mais conhecido como MESC mistura de digestão). </li><li> O isolamento de úteros <ol><li> Verifique a fase do ciclo dos animais com um exame de esfregaço vaginal. <ol><li> Conter o animal e lave a vagina suavemente com 50 mL PBS 3 - 5 vezes. </li><li> Recolha o flush final sobre uma lâmina de vidro. </li><li> Examine o material sob um microscópio de campo claro usando uma objetiva de 10X ou 20X. </li><li> Utilize apenas os ratos que estão em fase de estro. Esta fase caracteriza-se pela presença de células epiteliais cornificadas na lavagem vaginal (Figura 1 </strong&gt;). </li></ol></li><li> Eutanásia dos animais utilizando um método apropriado, como deslocamento cervical ou CO 2 narcose induzida. </li><li> Pulverizar as carcaças com 70% de etanol, a fim de gerar um ambiente estéril. </li><li> Usando instrumentos cirúrgicos estéreis, abrir o abdômen e empurrar os intestinos de lado para visualizar ambos os cornos uterinos. </li><li> Agarre o corno uterino no final mais distal sob a trompa de Falópio. Dissecar os cornos uterinos da trompa de falópio e remover os tecidos adiposo e conjuntivo. Recorte o chifre na extremidade distal acima do corpo uterino e colocá-lo em um prato de 35 milímetros Petri com 3 mL de HBSS +. <ol><li> Repita este passo para o outro chifre e para os outros animais até que todos os cornos uterinos são coletados. </li></ol></li><li> Limpe o corno uterino (em HBSS +) mais sob um estereoscópio e remover todo o tecido adiposo residual ou de tecido conjuntivo. </li><li> Cortar os cornos uterinos abertas longitudinalmente para expor o lúmen uterino e substituí-the chifre em uma nova placa de Petri com frescos HBSS +. </li><li> Transferir todos os cornos uterinos para o tubo de 15 mL contendo pancreatina e tripsina. </li><li> Incubar horizontalmente durante 60 minutos a 4 ° C num agitador orbital (50 rpm). </li><li> Incubar horizontalmente durante 45 minutos a 23 ° C (TA), sem agitação. </li><li> Incubar horizontalmente durante 15 minutos a 37 ° C (banho de água), sem agitação. </li><li> Enquanto isso fazer a mistura de digestão MESC por dissolução de 300 uL de 1 mg da colagenase / mL em 2,7 mL de solução de 0,05% de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). NOTA: A partir de agora, mais passos de isolamento são realizadas num ambiente estéril sob uma câmara de fluxo laminar. </li></ol></li><li> Rato endometrial células epiteliais (MEEC) Cultura <ol><li> Após 2 h de incubação, deitar fora cuidadosamente a solução sobrenadante. </li><li> Transferir os úteros em uma placa de Petri contendo meio de MEEC frio e incubar durante 5 min a fim de inactivar a tripsinaatividade. </li><li> Transferir os úteros para um tubo de 15 mL contendo 3 mL de HBSS frio +. </li><li> Vortex durante 10 segundos para libertar as folhas epiteliais. </li><li> Lavar os úteros em uma placa de Petri limpa com 3 mL de HBSS +. </li><li> Repetir o passo 4.3.2 - 4.3.4 para se obter um total de três suspensões contendo camadas epiteliais. </li><li> Transferir os úteros para a mistura de digestão MESC e incubar durante 30 min a 37 ° C, com agitação (200 rpm) (ir para o passo 4.4 para um maior isolamento de MESC). </li><li> Recuperar as folhas epiteliais pipetando as três suspensões de células suavemente sobre uma malha de nylon de 100 um, a fim de remover os detritos de tecido. </li><li> Centrifugar a suspensão de células recolhidas a 500 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em 12 mL de meio MEEC e misturar bem. </li><li> Estabelecer-se a solução durante 5 minutos a fim de separar MESC restantes usando a gravidade de sedimentação. </li><li> Remova cuidadosamente os superiores 2 mL usando uma pipeta de 5 mL. </li><li> Centrifugar a suspensio celularN a 500 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender em meio MEEC cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Placa as células em lamelas revestidas com colagénio na densidade desejada para outras experiências (Figura 2A). </li><li> Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5% por um período mínimo de 12 h. NOTA: Para imunocoloração ou experiências funcionais como imagem de cálcio fluorescente, é aconselhável a placa as células diretamente sobre as lamelas, enquanto a semeadura em uma placa de 6 poços é recomendado quando RNA ou proteína isolada é desejada. Isolamento de células estromais do endométrio de rato é dividido em duas fases, como a pureza das células depois de apenas uma digestão pode ser insuficiente. Os úteros são digerido duas vezes para uma recuperação óptima de células e a pureza. Em ambos os rounds as intervenções técnicas são idênticos. Células coletadas de ambos os turnos podem ser mantidos por novas experiências, como desejado pelo pesquisador. </li></ol></li><li> Rato endometrial Strcelular omal (MESC) Cultura: 1ª Rodada <ol><li> Antes do início da primeira digestão rodada, preparar uma segunda mistura de digestão por dissolução de 300 uL de 1 mg da colagenase / mL em 2,7 mL de solução de tripsina-EDTA a 0,05%. Esta mistura é necessária na etapa 4.4.8. </li><li> Prepare três pequenas placas de Petri com o frio (4 ° C) HBSS + e 3 x 15 tubos mL com 3 mL de meio MESC (tubo de X1, X2 e X3). </li><li> Após 30 min de incubação, agitar a solução de tripsina contendo úteros suavemente durante 10 s. células Mesc irá separar a partir do tecido uterino e vai permanecer na solução de tripsina. </li><li> Transferir os úteros para a primeira placa de Petri contendo 3 mL de frio (4 ° C) HBSS + e lavar bem. </li><li> Adicionar 3 ml de meio MESC ao tubo contendo originalmente as trompas uterinas (tubo no passo 4.4.3) para inibir a actividade da tripsina. </li><li> Transferir os úteros de placa de Petri com o frio (4 ° C) HBSS + para X1 tubo contendo 3 mL de meio MESC e agitar suavemente durante 10 s. </li&gt; <li> Repita os passos 4.4.4 (transferência para uma placa de Petri com o frio (4 ° C) HBSS +) e 4.4.6 (transferência para X2 tubo e X3) duas vezes. NOTA: Finalmente, este protocolo irá resultar em suspensões de células de 4: um tubo que contém a solução de tripsina e 3 tubos com meio contendo MESC MESC (tubos de X1, X2 e X3). </li><li> Transferir úteros na nova digestão MESC, conforme descrito no passo 4.4.1 e incubar durante 30 min a 37 ° C, na vertical. </li><li> Recolher as células do estroma, passando as quatro suspensões de células através de uma malha de nylon de 40? M. Lavar a malha com um adicional de 5 mL de MESC. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 500 xg durante 7 minutos. </li><li> Ressuspender o sedimento em MESC e placa em lamelas revestidas com PLL para mais experiências com a densidade desejada. </li><li> Incuba-se durante um período mínimo de 4-6 horas ou O / N a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li></ol></li><li> Rato do Estroma Endometrial celular (MESC) Cultura: 2ª Rodada &lt;ol&gt; <li> Prepare três pequenas placas de Petri com o frio (4 ° C) HBSS + e 3 x 15 tubos mL com 3 mL de meio MESC (Tubes Y1, Y2 e Y3). </li><li> Repita os passos 4.4.3 - 4.4.7. </li><li> Transferir a última suspensão de células em conjunto com o útero para uma malha de nylon de 40? M. </li><li> Recolha das células do estroma, passando o conteúdo do tubo de Y1, Y2 e Y3 através da malha de nylon. Lavar a malha com um adicional de 5 mL de MESC. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 500 xg durante 7 minutos. </li><li> Ressuspender o sedimento em MESC médio e placa em lamelas revestidas com PLL para outras experiências (Figura 2B). </li><li> Incuba-se durante um período mínimo de 4-6 horas a 37 ° C com 5% de CO 2. NOTA: Para imunocoloração ou experiências funcionais como imagem de cálcio fluorescente, é aconselhável a placa as células em lamelas, enquanto a semeadura em uma placa de 6 poços é recomendado quando RNA ou proteína isolada é desejada. </li></ol></li></ol> 5. Vimentin/ Cytokeratin dupla marcação de Validação de MEEC Pura e culturas Mesc <ol><li> Semear as células em lamelas. </li><li> Lavar 3 x 5 min com PBS contendo cálcio e magnésio num agitador orbital (50 rpm). </li><li> Fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) (CUIDADO!) Durante 10 min, e não no agitador. </li><li> Lavar 3x com PBS sem cálcio e magnésio em shaker (50 rpm). </li><li> Permeabilizar as células com 0,2% de Triton X-100 durante 10 min num agitador (50 rpm). </li><li> Lavar 3x com PBS num agitador. </li><li> Bloco com 5% de soro de cabra (GS) em PBS durante 2 h num agitador (50 rpm) </li><li> Incubar as células com anticorpo monoclonal de coelho anti-vimentina humana (1: 500) e pancitoqueratina monoclonal de ratinho anti-humano (1: 1000) a 4 ° C num agitador (50 rpm). Os anticorpos são diluídos em PBS com 0,5% GS. </li><li> Lavar 3x com PBS num agitador (50 rpm). </li><li> Incubar as células com os anticorpos secundários (1: 1000 em 0,5% GS) de IgG anti-coelho conjugado 488-Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor-conjuIgG anti-rato fechado num agitador. </li><li> Lavar 3x com PBS num agitador. </li><li> Mount slides com meio de montagem aquoso contendo DAPI e O seco / N. </li><li> Selar as lâminas com unha polonês e manter a 4 ° C para utilização posterior (Figura 2a, b). </li></ol> 6. In Vitro decidualização num sistema Coculture NOTA: Quatro a cinco animais são obrigados a estabelecer um sistema de co-cultura em uma placa de 24 poços. Continue com o seguinte protocolo em um ambiente estéril, de preferência sob uma câmara de fluxo laminar. <ol><li> Preparar as inserções de cultura de células durante os passos de centrifugação e / ou incubação do isolamento de células epiteliais (tal como descrito em 4.3) em uma placa de 24 poços adicional. <ol><li> Adicionar 200 - 400 ul de meio MESC para a quantidade desejada de poços na placa de 24 poços. </li><li> Coloque as inserções nas pré-cheias de 24 poços usando uma pinça estéril. </li></ol></li><li> Ressuspender o sedimento MEEC(Volume de trabalho: 150 - 300 mL por inserção) (passo 4.3.14) em meio MEEC e dividir ao longo dos inserções. Cultura das células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5%. </li><li> Semear as células estromais em outra placa de 24 poços (compatível com as inserções de cultura de células) após a segunda rodada de isolamento de células do estroma (passo 4.5.6). Utilizar um volume de trabalho de 400 uL de suspensão de células por poço. </li><li> Permitir que as células estromais a aderir durante mínimo 4-6 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> Transferir as inserções de cultura de células cobertos com células epiteliais da primeira placa de 24 cavidades para a segunda placa de 24 poços revestidos por células do estroma. Use uma pinça esterilizados ou tocar as inserções apenas com seu pé de suspensão. </li><li> Cultura das células a 37 ° C em 5% de CO2 durante um período de 3 - 5 d até as células epiteliais formar uma monocamada, e as células do estroma atingir 80-90% de confluência. Além disso, use a resistência elétrica transepitelial (TEER)para monitorar a monocamada epitelial, pela utilização de um medidor epitelial Volt / Ohm como descritos por Grant et ai. 7. Os valores de 800-1.000 / poço foram suficientes para considerar o confluente em monocamada epitelial. </li><li> Se necessário, substituir o meio cada 2-3 d usando pipetas de vidro ou pontas de pipetas finas. Comece com a substituição do meio das células do estroma (semeados na parte inferior), antes de substituir o meio nas inserções. Recomenda-se a utilização de meio de cultura de células pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Preparar o meio decidualization para induzir em decidualization vitro antes de iniciar o experimento. Utilizar um volume de trabalho de 400 uL por poço de células do estroma. <ol><li> Preparar as seguintes soluções de reserva e alíquotas armazenar a -20 ° C. <ol><li> Preparar 250 uM de medroxiprogesterona 17-acetato (MPA) em etanol. </li><li> Preparar a solução estoque 100 mM de 8 Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-cAMP em água ultrapura. </li></ol></li><li> Tornar o meio decidual contendo MPA 1 PM e cAMP 0,5 mM em meio MESC contendo 2% de FBS. </li></ol></li><li> Remova cuidadosamente o meio dos poços e adicionar o meio decidual sobre as células do estroma. Se uma condição de controle é necessário, usar a forma MESC contendo 2% de FBS. </li><li> Remover o meio das inserções de cultura de células e adicionar 300 uL de meio sobre as células MEEC. </li><li> Incubam-se as células durante 5 d, numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> A partir do quinto dia, avaliar a extensão da decidualização em células do estroma por meio de RT-qPCR (ver abaixo). </li><li> Validar a viabilidade das células epiteliais utilizando o reagente de viabilidade baseados em Resazurina. <ol><li> Prepara-se uma solução 01:10 de reagente de viabilidade em meio MEEC. </li><li> Transferir as inserções de cultura de células para uma nova placa de 24 poços. </li><li> Adicionar 150 - 300 uL do reagente de viabilidade - MEEC solução para as células. </li><li> Incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante pelomenos 4 - 5 h ou durante a noite e avaliar a viabilidade celular, observando uma mudança de cor (azul ao roxo / rosa). NOTA: decidualização também pode ser avaliada usando um ELISA específico da prolactina de camundongo, como preferido pelo pesquisador. </li></ol></li></ol> 7.Validation de decidualização por qRT-PCR NOTA: Para a validação do decidualização por qRT-PCR, recomenda-se realizar todos os testes em duplicado-condições, a fim de receber uma quantidade suficiente de células para análise de ARN. RT-PCR quantitativo é realizado tal como descrito anteriormente em De Clercq et ai. 8. Em resumo: <ol><li> Isolar o ARN total utilizando um kit de isolamento de ARN comerciais. <ol><li> Avaliar a quantidade e qualidade do ARN utilizando métodos comerciais de acordo com o protocolo do fabricante, respectivamente. </li></ol></li><li> Sintetizar ADNc, de acordo com o protocolo do fabricante a partir de 1 ug de ARN total. </li><li> Usar um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante para levar a cabo a reacção de qRT-PCR. <ol><li> Executar todas as amostras em triplicado. </li><li> Fazer uso do TaqMan Master Mix comercial e sondas TaqMan específicas para os genes de manutenção desejada e prolactina (prl8a2) para efectuar a reacção. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Decidualization é a diferenciação dependentes de progesterona de células estromais endometriais em células deciduais rodada secretoras. No ser humano, este processo ocorre espontaneamente durante a fase lútea do ciclo menstrual e é iniciada nas células do estroma que rodeiam as células vasculares para formar o predecidua. No entanto, em roedores, a presença de um blastocisto é imperativo para induzir decidualização. O facto de decidualização ocorre apenas após o contacto com as células epiteliais do endométrio implica que os factores importantes são segregadas pelas células epiteliais para induzir decidualização no estroma subjacente. Embora esta diferença na iniciação do processo decidualização deve ser reconhecido, o facto de decidualização humano torna-se mais robusta sobre a implantação do embrião sugere que mecanismos semelhantes poderiam estar envolvidos. Culturas celulares in vitro são muitas vezes utilizados para estudar o efeito de moléculas específicas durante o processo de decidualização.No entanto, a disponibilidade e quantidade de tecido humano que pode ser coletado é muitas vezes limitado e acompanhados por variações, por exemplo, a fase do ciclo, número de gestações e presença de doenças ginecológicas como a endometriose ou adenomiose. Muitos destes problemas podem ser evitados pelo uso de tecido murino, que é facilmente acessível e fase do ciclo independente. Outra grande vantagem do uso de tecido murino, é a possibilidade de utilizar roedores geneticamente modificadas e a possibilidade de instalação de um grande número de experiências. No momento, muitos protocolos de isolamento diferentes foram descritos na literatura com elevada variabilidade na idade dos animais e o período na fase do estro no momento da utilização. Este estudo apresenta um novo método para a co-culturas primárias de endométrio do estroma e as células epiteliais em que tirou-se vantagem de um ciclo estral padronizado por uma injecção diária de estrogénio antes do isolamento. Além disso, o estrogénio é kNown de induzir proliferação em células epiteliais e do estroma, o que aumenta ainda mais o rendimento por isolamento. O protocolo de isolamento descrito neste trabalho foi baseado em Grant et al. 7, no entanto, foram incluídos outros passos de optimização para aumentar o rendimento, pureza e viabilidade das culturas de células diferentes. Em primeiro lugar, foi sempre HBSS suplementado com antibióticos para evitar a contaminação da cultura primária. Durante o isolamento de MEEC, uma adaptação de temperatura foi feita (15 min a 37 ° C) para aumentar a colheita das células epiteliais durante a primeira digestão. Em seguida, uma etapa adicional foi incluído para temperar a actividade enzimática após tratamento com tripsina-digestão através da adição de meio contendo FBS para inibir a sua actividade. Além disso, MEECs foram passados ​​através de um filtro de malha que foi maior do que aquilo que é vulgarmente descrito (100 pm) como vêm frequentemente em aglomerados e folhas de células. Além disso, a contaminação por células do estroma foi reduzida através da realização de um suplementoitional passo em que MEECs MESCs e foram separadas com base na sedimentação por gravidade. Finalmente, MEECs foram semeadas em lamelas revestidas com colagénio para aumentar a fixação das células para lamelas de vidro, uma vez que se tornou claro que a fixação lamelas de vidro não revestidas ou revestidas com PLL foi insuficiente. Durante o isolamento dos MESCs, colagenase (1 mg / mL) foi suplementado para melhorar a digestão. Além disso, esta etapa de digestão foi realizada em duplicado para evitar a contaminação dos restantes MEECs. Todos estes passos adicionais resultaram em culturas puras e viáveis ​​de populações de células homogéneas. A pureza da população celular foi avaliada com e imunocoloração de qRT-PCR utilizando vimentina como marcador citoqueratina estromal e epitelial como um marcador. Claramente, foi observado um padrão de expressão oposto da vimentina e citoqueratina em MEEC e MESC. No entanto, pode-se notar que a expressão de ARNm relativa de vimentina e citoqueratina é semelhante nas culturas MEEC. similresultados Ar são publicados por outros grupos de pesquisa, em que as células epiteliais na cultura adquirem expressão de vimentina 9. Mais importante é a diferença na expressão da proteína entre vimentina e citoqueratina como foi observado nas colorações imuno-histológicos das diferentes populações de células. imunomarcação dupla mostrou que EECS foram positivas para citoqueratina e ESC foram positivas para vimentina. A utilização destes marcadores na imunomarcação é um método estabelecido e standardly usado para indicar os tipos de células 10. Embora uma grande quantidade de investigação tem sido efectuada no decidualização de MESC, continua a ser possível que a presença de células epiteliais neste modelo possam alterar os resultados do decidualização. Em primeiro lugar, foi demonstrado que se MEEC crescer a uma monocamada na presença de meio condicionado por MESC ou numa configuração de co-cultura, a monocamada tem uma melhor resistência transepitelial célula epitelial eléctrica (TEER), resultante de fatores secretados pelo MESC 7. Além disso, Pierro et ai. 11 forneceram provas de que a proliferação epitelial, influenciado por 17β-estradiol, pode ser mediada por factores segregados a partir das células do estroma, e em alternativa, as células epiteliais podem libertar factores que modulam estromal decidualização 12, 13. Em geral, é evidente que o meio de co-cultura do epitélio-estromal proporciona uma situação mais fisiológica que permite a interacção e comunicação parácrina. O método de cultura de dois tipos de células diferentes, utilizando um sistema de co-cultura foi descrita anteriormente inserção 14, 15 e foi adaptado para a utilização de células primárias de murídeo. Pela detecção dos níveis de mRNA da prolactina como um read-out para decidualização, a técnica descrita tem uma muito reprodutível read-out para decidualização disponíveis e permitemé, assim, o estudo da relação epitélio-estromal durante decidualização. sinais parácrinos mediados de MEEC pode alterar a extensão da decidualization nas células estromais. Além disso, o modelo permite a modulação específica do lado epitelial, sem afectar directamente as células do estroma. Por conseguinte, esta co-cultura de MEEC e MESC oferece uma ferramenta perfeita para avaliar o efeito de hormonas, citocinas, etc., em células epiteliais com uma leitura em decidualização do estroma. Outra vantagem deste sistema de co-cultura é que ele permite que os investigadores para investigar o envolvimento de uma proteína específica no processo decidualização quer no compartimento epitelial e estromal, utilizando células isoladas a partir de animais transgénicos. Além disso, esta técnica vai ser muito útil para investigar blastocisto adesão para avaliar se os factores parácrinos secretados por células epiteliais, na presença de um blastocisto são suficientes para induzir a decidualização do estroma subjacentecélulas. Um passo importante na invasão de trofoblastos correlacionada com a degradação da matriz extracelular, que é mediada pela acção de enzimas proteolíticas. A técnica proposta pode ser aplicada como um modelo in vitro para investigar a conversa cruzada entre o blastocisto, as células epiteliais e do estroma de suporte. No entanto, no momento em que pouco é conhecido sobre a origem das células epiteliais que podem ser bem luminal como glandular. Portanto, é necessária caracterização adicional do perfil de genética e molecular das células epiteliais. Além disso, o método descrito é limitado no conhecimento disponível sobre a polarização das células epiteliais. No momento, a polarização de células epiteliais não foi tomada em conta. No entanto, as diferenças na expressão de proteínas de membrana são descritas nas membranas apicais e basais. polarização inadequado da camada epitelial poderia ter um impacto sobre a interação parácrina entre epitheliai e células estromais. No entanto, os métodos para a obtenção de células epiteliais polarizadas foram descritos e podem ser incluídos na técnica descrita 15, 16. No total, o protocolo descrito propõe uma técnica para estabelecer com sucesso culturas de células primárias de rato epiteliais do endométrio e células estromais. Esta técnica resulta em culturas de células puras, como confirmado por qRT-PCR e imunocoloração de vimentina e citoqueratina. Em última análise, uma co-cultura de células epiteliais e do estroma foi introduzida que permite a investigação de sinais parácrinos mediada quer por MEEC e / ou MESC no processo decidualização.

O endométrio humano é o revestimento interno do útero e passa por ciclos mensais de discriminação e de reparação como uma preparação para possíveis gravidezes. É constituída por uma única camada de células epiteliais que revestem o lúmen uterino e o estroma subjacente, que varia em espessura de acordo com flutuações de hormonas do ovário de estrogénio e progesterona. Durante a fase lútea, pós-ovulatória do aumento de progesterona irá induzir a diferenciação de células estromais do endométrio em células deciduais maiores, redondos, um processo chamado decidualização 1, 2. Em humanos, este fenómeno ocorre espontaneamente para formar a predecidua, mas torna-se mais pronunciada sobre a implantação do embrião. Uma consequência funcional da decidualização é que o útero se torna transitoriamente receptivo à implantação do embrião. Esse intervalo é rotulado como a &quot;janela de implantação&quot;. Durante o período inicial de implantação do embrião, o decidualizado eAs células do estroma que rodeiam o embrião ndometrial implantação irá proporcionar uma barreira para impedir a passagem de substâncias nocivas para o embrião 3. Durante a gravidez, este decídua irá fornecer nutrientes para o feto em desenvolvimento antes placentation teve lugar, e mais tarde irá formar a parte materna da placenta 4. considerações éticas e práticas limitar a concepção de estudos humanos para investigar o processo de decidualization e levaram o uso de modelos animais. Ser um membro do grupo placentation hemocorial, o endométrio de roedores também irá sofrer decidualization antes placentation 5. Em roedores, no entanto, a iniciação do processo de decidualização depende da presença de blastocistos no lúmen uterino, que indica que um estímulo extra é necessário para desencadear as respostas deciduais 6. Isto implica uma comunicação complexa entre the células endometriais epiteliais que têm contato direto com o blastocisto, e as células do estroma subjacentes. No entanto, decidualization pode ser induzido artificialmente utilizando estímulos como coçar mecânica ou a instilação de petróleo em um útero hormonalmente preparada. Embora os estudos in vivo utilizando modelos decidualization artificiais nos permitiram melhorar os nossos conhecimentos no complexo processo de sinalização de decidualization, mecanicistas estudos aprofundados, por exemplo, a investigação da comunicação indispensável entre células epiteliais e estromais, são limitados. Por isso, os estudos in vitro decidualização pode ser usado para manipular vias importantes e estudar processos fundamentais. Para este fim, as culturas de células do estroma endometrial primárias pode ser configurado a partir de endométrio humano ou roedor. Empregando roedores consente a utilização de animais geneticamente modificados para investigar o papel de uma proteína específica de interesse durante o processo de decidualização. No entanto, imaturo, prepuberTy ratinhos são muitas vezes utilizados de modo a evitar complicações do ciclo estral, enquanto que em outros casos úteros são recolhidos a partir de todas as fases do ciclo estral, o que resulta em uma heterogeneidade nas culturas. Além disso, o processo de decidualização tem sido estudado em diferentes protocolos, por exemplo, por (i) hormonas completar (estrogénio, progesterona ou monofosfato de adenosina cíclico (cAMP)) para o meio de cultura, ou por (ii) isolamento de células deciduais de ratinhos em dia 4.5 de (pseudo) gravidez, o que demanda necessidade adicional de verificação de plug and machos vasectomizados. Estas limitações demonstram a necessidade de um método normalizado para estudar em decidualização vitro. Neste estudo, um modelo fisiológico para examinar decidualization in vitro a partir de adulto, será apresentado (pseudo) ratas grávidas não. Neste método, a injecção diária de 17β-estradiol (E2) vai induzir a proliferação de células do endométrio, resultando num aumento do rendimento de homogéneo e ppopulações de células ure. Além disso, a utilização de um sistema de coculturing permite o estudo da diafonia epitélio-estromal e a capacidade de manipular o processo de decidualização em diferentes níveis.

<table><tbody><tr><td>ThinCert Inserto de cultura de tecidos para placas de 24 poços; 1 &micro; tamanho dos poros m; transparente</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662610</td><td>As inserções também são fornecidas para outras placas multipoços e/ou outros tamanhos de poros. Outros fornecedores: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Cultura de células tratadas com placas de 24 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475</td></tr><tr><td>8-Bromoadenosina 3&prime;,5&prime;-sal de sódio monofosfato cíclico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7880</td><td>Prepare uma solução estoque de 100 mM em água Milli Q. Armazene as alíquotas em -20 &deg;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>Medroxiprogesterona 17-acetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1629</td><td>Prepare uma solução estoque de 250 &micro; M em etanol. Armazene as alíquotas em -20 &deg;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>Óleo de arachis</td><td>Supermercado</td><td></td><td>Cozimento padrão O óleo de arachis que pode ser encontrado em todos os supermercados é usado</td></tr><tr><td>Reagente de viabilidade celular PrestoBlue</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13261</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1</td></tr><tr><td>HBSS 1x, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>14175-046</td><td>Guarde na geladeira o maior tempo possível. Use HBSS+ frio durante o protocolo. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&nbsp; </td></tr><tr><td>17-&beta; Estradiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875</td><td>Prepare uma solução estoque de 1 mg / mL em EtOH antes de diluir em óleo de arachis (1: 1.000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&amp; region=BE</td></tr><tr><td>Filtro de meio celular Stericup, 0.22 &micro; m, polietersulfona, 500 mL, esterilizado por rádio</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (5.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063</td></tr><tr><td>DMEM/F12, vermelho de fenol, L-glutamina, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado por calor, aprovado pela UE, Origem da América do Sul</td><td>Gibco</td><td>10500-056</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018</td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg / mL)</td> <td>Gibco</td><td>15750-037</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037</td></tr><tr><td>DMEM, baixa glicose, piruvato, sem glutamina, sem vermelho de fenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5921</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>MCDB-105</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6395</td><td>Diluir em água Milli Q, ajustar o pH para 7 com NaOH e filtrar antes de usar. Armazene no escuro. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>Insulina do pâncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1882</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Lamínulas, vidro, 18 mm e Oslash;</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td><td>1001/18</td><td>http://www.hecht-assistant.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 & tx_rmproducts_pi1[p]=3504 & tx_rmproducts_pi1[v]=20088 & cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>colagenase tipo IA de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2674</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094</td></tr><tr><td>Tripsina do pâncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7409</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Aqueça à temperatura ambiente antes de usar. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&nbsp; </td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 &micro; m mesh, descartável</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>Cell strainer, 100 &micro; m mesh, descartável</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>Millex-GP Unidade de Filtro de Seringa, 0.22&nbsp; &micro; M, Polietersulfona, 33&nbsp; mm, SLGP033RS de</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1 esterilizado gama Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr> ácido <tr><td>acético (glacial) 100%</td> <td>Merck Millipore</td><td>1.00063</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063</td></tr><tr><td>colágeno I</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354236</td><td>De cauda de rato. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&amp; productid=354236%28 Lifesciences%29#&nbsp; </td></tr><tr><td>Pancreatina de pâncreas suíno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3292</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>35 mm Placas de cultura de tecidos, poliestireno, estéril</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630</td></tr><tr><td>Etanol absoluto AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. reagente analítico</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821296</td><td>https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP</td></tr><tr><td>vimentina monoclonal de coelho anti-humana (D21H3)&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>#5741</td><td>Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 </td></tr><tr><td>Camundongo monoclonal anti-citoqueratina PAN humana&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2562</td><td>Uso 1/1.000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&amp; região =</td></tr><tr><td>solução de paraformaldeído BE, 4% em PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ</td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11034</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&amp; resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;; genérico6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;; conjugados:^\%22Alexa%20Fluor& reg;%20488\%22$;;</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11032</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&amp; resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2: \%22Capra%20hircus\%22;; genérico6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;</td></tr><tr><td>Meio de montagem VECTASHIELD com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html</td></tr><tr><td>DPBS, com cálcio e magnésio</td><td>Gibco</td><td>14040174</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133</td></tr></tbody></table>

isolamento de rato endometrial epiteliais e estromais para células<em&gt; in vitro</em&gt; decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization é um processo de diferenciação dependentes de progesterona de células estromais endometriais e é um pré-requisito para a implantação do embrião bem sucedido. Apesar de muitos esforços têm sido feitos para desvendar os mecanismos subjacentes a decidualização, a sinalização exacta entre as células epiteliais que estão em contacto com o embrião e as células do estroma subjacente permanece pouco compreendido. Portanto, estudar decidualization de uma forma que leva tanto a células epiteliais e do estroma em consideração poderia melhorar nosso conhecimento sobre os detalhes moleculares da decidualization. Para este efeito, em modelos in vivo de decidualização artificial são fisiologicamente mais relevante; No entanto, a manipulação de comunicação intercelular é limitada. Actualmente, em culturas in vitro de células do estroma do endométrio, estão a ser utilizados para investigar a modulação de decidualização por várias moléculas de sinalização. Convencionalmente, as células estromais humanas ou mouse endometriais sãousava. No entanto, a disponibilidade de amostras humanas é muitas vezes limitada. Além disso, a utilização de tecidos de murídeo é acompanhada com a variedade no método de cultivo. Este estudo apresenta um método validado e padronizado para obter pura celular endometrial epitelial (CEE) e as culturas do estroma celular (ESC) usando ratos intactos adultos tratados com estrógeno durante três dias consecutivos. O protocolo foi optimizado para melhorar o rendimento, viabilidade, e a pureza das células e foi ainda alargada, a fim de estudar decidualização numa co-cultura de CEE e ESC. Este modelo pode ser adequado para explorar a importância de ambos os tipos de células em decidualização e para avaliar a contribuição das moléculas de sinalização segregadas por significativas CEE ou ESC durante a comunicação intercelular.

Visão Geral do Protocolo Figura 1A ilustra uma visão geral do protocolo. Uma injecção diária de E2 (100 ng) durante três dias consecutivos foi usada para sincronizar os animais e padronizar a fase do ciclo estral. O ciclo estral podem ser avaliadas por lavagens vaginais e é dividido em proestro, estro, diestro, e fase metaestro. A fase do ciclo podem ser designados de acordo com a proporção de células descamadas no lavado, que são submetidas a alterações hormonais. Aumento dos níveis de estrogênio fará com que os animais evoluem para a fase de estro. Esta fase pode ser facilmente detectada pela presença de células epiteliais exclusivamente cornified e a ausência de leucócitos (Figura 1B). No dia 4, úteros dos animais que estão em fase de estro são recolhidos e MEEC e MESC são isolados (Figura 1C). decidualization cum ser induzida pela adição de 0,5 mM de cAMP e 1 uM MPA para o meio com FBS a 2% durante um período de incubação de 5 d. Controle de Qualidade de MEEC e Mesc culturas A pureza das culturas de células primárias pode ser avaliado pela diferença de vimentina e expressão de citoqueratina. Vimentina é um filamento intermediário que é expressa em células mesenquimatosas, por conseguinte, nas células do estroma endometrial. Citoqueratina é um filamento intermediário encontrado no citoesqueleto de tecido epitelial. A Figura 2A mostra o nível de expressão de ARNm de vimentina e citoqueratina em MEEC e MESC avaliada utilizando qRT-PCR. níveis vimentina são ricos em MESC e pobre em MEEC (2,2x superior, p &lt;0,001), enquanto os níveis de citoqueratina são ricos em MEEC e pobre em MESC (36x superior, p &lt;0,001). A vimentina / citoqueratina coloração dupla foi realizada e indicou que as células do estroma expressam vimentina enquanto epitcélulas helial expressar citoqueratina (Figura 2B, C). A ausência de anticorpo primário foi usado como um controlo negativo para a imunocoloração (Figura 2D, E). Estas colorações imuno-histológicos mostram que ambas as culturas de células do endométrio (MEEC e Mesc) tem uma pureza de até 90%. Decidualization em MEEC / Mesc Co-culturas Após o isolamento, as células endometriais e estroma rato foram semeadas num sistema de co-cultura para mimetizar o ambiente do endométrio. As células foram cultivadas até as células epiteliais formado uma monocamada na lâmina de cultura celular (valores de TEER 800 - 1000 / poço), e as células do estroma atingido um estado de sub-confluência. Decidualização foi induzida em células do estroma com o pedido de cAMP 0,5 mM e 1 uM MPA. Após cinco dias de incubação, os níveis de ARNm de prolactina foram avaliados nas células estromais por qRT-PCR como uma indicação para decidualization (Figura 3A). Os níveis de prolactina foram altamente expresso em células sujeitas às hormonas e não detectáveis ​​em células incubadas com o meio de controlo (p &lt;0,01). Uma vez que as células epiteliais são difíceis de visualizar o interior das inserções de cultura de células, um ensaio de viabilidade foi realizada imediatamente após o período de incubação de cinco dias (Figura 3B). Uma mistura de meio de crescimento normal e um reagente de viabilidade foi adicionado aos poços e incubou-se durante um período mínimo de 8 - 12 h. A mudança de cor de azul para rosa brilhante indicou a presença de células epiteliais viáveis. Note-se que a mudança de cor só ocorrerá quando as células viáveis ​​estão presentes. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> Figura 1: Visão Geral do Protocolo. (A) Esquema de o protocolo de isolamento inicial com trêsdias consecutivos de injeções de estrogênio. No dia 3, os preparativos necessários devem estar preparados. No dia 4, a fase estro é avaliada (indicado por asterisco), efectuando uma lavagem vaginal. MESC e MEEC são isoladas usando diferentes fases de digestão. No dia 6, ou quando as células estão confluentes, decidualização podem ser induzidas no sistema de co-cultura por adição de cAMP e MPA para o meio e um período de incubação de cinco dias (dias 6-11). (B) imagem representativa da fase estro caracterizado pela presença de células epiteliais cornificadas na lavagem vaginal (ampliação de 10X). (C) imagem Representante do MESC e MEEC (ampliação de 20X, barra de escala: 100 mm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2: A imunocoloração e RT-PCR quantitativo para vimentina e Cytokeratin em MEEC e MESC. (A) os níveis de RNA mensageiro de vimentina e expressão de citoqueratina para indicar a pureza das culturas. Os níveis de ARN foram quantificados relativamente à média geométrica dos genes housekeeping ACTB e TBP. Os dados foram apresentados como média ± SEM. Vimentina / coloração dupla citoqueratina em culturas Mesc (B) e culturas MEEC (C). Insira na esquerda mostra uma vista de ampliação 63X. O controlo negativo com anticorpo primário omitido para MESC (D) e MEEC (E) (Barra de escala: 50 mm). ***: P &lt;0,001 com Two-way ANOVA com correção de Bonferroni para testes múltiplos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 3: Validação da decidualização através de RT-PCR. Níveis (A) de ARNm de expressão em células do estroma da prolactina para avaliar decidualização. Os níveis de ARN foram quantificados relativamente à média geométrica dos genes housekeeping PGK1 e TBP. A mudança vezes em células cultivadas em meio controlo ou decidual é mostrado como média ± SEM. (B) imagens ilustrativas de células estromais antes (superior) e depois (inferior) estímulo decidualization. A inserção à direita ilustra uma ampliação de uma célula estromal decidualizado. Decidualização é caracterizado pela presença de células multinucleadas, indicado por setas negras. (C) Imagens representativas da avaliação da viabilidade das células epiteliais na inserção após o ensaio. Fotos foram tiradas imediatamente após a administração do reagente de viabilidade (Prestoblue) (0 h) e a fmanhã epois (ON). **: P &lt;0,01 pelo teste de Mann-Whitney. ON: durante a noite. Barra de escala: 100? m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este estudo apresenta um método padronizado e validado para o isolamento e cultura de rato primária do estroma do endométrio e pelas células epiteliais, o que pode ser utilizado num sistema de co-cultura para estudo em decidualização vitro.

Isolamento de rato Endometrial epiteliais e estromais para células<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Os objetivos gerais deste procedimento são isolar e cultivar células primárias murinas endometriais, estromais e epiteliais para seu co-cultivo com o estudo da desidualização in vitro. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da medicina reprodutiva, como quais são os sinais parácrinos entre células epiteliais e estromais durante processos importantes como a desidualização e a invasão de trofoblastos, e como essa via de sinalização é regulada. Essas técnicas podem ser utilizadas para estudar o processo de desidualização em um sistema de co-cultivo epitelial e estromal.Ao usar este sistema, é possível avaliar se moléculas sinalizadoras secretadas por uma das duas células podem influenciar esse processo. Antes de coletar o útero, realize um exame de esfregaço vaginal para verificar as fases do ciclo dos animais. Para selecionar apenas camundongos na fase de estro.Caracterizado pela presença de células epiteliais da córnea na lavagem vaginal. Em seguida, utilize pinças e tesoura para abrir o abdômen do primeiro animal em estro e afaste os intestinos para o lado para visualizar ambos os cornos uterinos. Segurando um corno na extremidade mais distal, sob a tuba uterina, dissecar o tecido uterino da tuba uterina utilizando pinças de dissecação e pinças Dumont número cinco para remover os tecidos adiposo e conjuntivo.Em seguida, remova o corneto na extremidade distal, acima do corpo uterino. Após a remoção dos cornetes uterinos, coloque-os em uma placa de Petri de 35 milímetros com três mililitros de HBSS. Quando todos os cornetes uterinos tiverem sido coletados, transfira a placa para sob um microscópio estereoscópico e utilize pinças para remover quaisquer tecidos adiposos e conjuntivos residuais.Em seguida, utilizando pin&ccedil;as Dumont n&uacute;mero cinco, pin&ccedil;as de disseca&ccedil;&atilde;o e tesoura pequena de mola, abra longitudinalmente os cornos uterinos para expor seus l&uacute;mens e lave os tecidos em uma nova placa de Petri contendo HBSS fresco. Agora, transfira todos os cornos para um tubo de 15 mililitros contendo pancreatina e tripsina. E incube os tecidos horizontalmente por 60 minutos a quatro graus Celsius e 50 rpm em um agitador orbital.Após o término da hora, transfira o tubo para a bancada e realize uma incubação horizontal de 45 minutos sem agitação, seguida por uma incubação horizontal de 15 minutos sem agitação em banho-maria a 37 graus Celsius. Ao final da incubação no banho-maria, decante cuidadosamente o sobrenadante e transfira os úteros para uma placa de Petri contendo meio para células epiteliais endometriais de camundongo frio por cinco minutos, a fim de inativar a atividade da tripsina. Em seguida, transfira os tecidos para um tubo de 15 mililitros contendo três mililitros de HBSS frio e vortexie os tecidos por 10 segundos para liberar as lâminas epiteliais.Em seguida, lave os úteros em uma nova placa de Petri contendo três mililitros de HBSS fresco e colete mais duas suspensões de folhas epiteliais em dois novos tubos de 15 mililitros, conforme acabou de ser demonstrado. Após o terceiro vortex do tecido, transfira os úteros para um tubo cônico de 15 mililitros contendo a mistura de digestão de células estromais endometriais de camundongo para uma incubação de 30 minutos a 37 graus celsius e 200 rpm. Recupere as folhas epiteliais pipetando suavemente as três suspensões celulares através de uma peneira de nylon de 100 mícrons para remover os detritos teciduais, seguido pela centrifugação da suspensão celular resultante.Re-suspenda o pellet em 12 mililitros de meio para células epiteliais endometriais de camundongo com mistura completa, e deixe a solução decantar por cinco minutos para separar as células estromais endometriais remanescentes de camundongo por gravidade. Ao final da sedimentação, utilize uma pipeta de cinco mililitros para remover cuidadosamente os dois mililitros superiores do sobrenadante e centrifugue as células coletadas. Em seguida, re-suspenda o pellet de células epiteliais de camundongo no meio epitelial com pipetagem suave.E plaque as células em lamínulas revestidas com colágeno na densidade apropriada para a análise planejada a jusante. Após o isolamento das células epiteliais, prossiga com as células estromais e remova o tubo de digestão das células estromais de camundongo com os úteros do incubador. Após a incubação de 30 minutos, conforme acabou de ser demonstrado, agite suavemente o tubo manualmente por 10 segundos e transfira os úteros para uma placa de Petri contendo três mililitros de HBSS a quatro graus Celsius.Lave bem os tecidos, depois adicione três mililitros de meio para células estromais ao tubo de digestão para inativar a atividade da tripsina e transfira o útero para um tubo cônico de 15 mililitros contendo três mililitros de meio fresco para células estromais endometriais de camundongo. Agite suavemente o tubo com tecido por 10 segundos. Em seguida, transfira o útero para uma placa com HBSS frio, seguido pela sua transferência para um novo tubo de 15 mililitros contendo meio para células estromais.Após uma terceira lavagem do tecido e transferência, incubar os tecidos uterinos em uma nova mistura de digestão de células estromais endometriais de camundongo por 30 minutos a 37 graus Celsius. Ao final da digestão, passar as suspensões celulares do tubo um para o três e do tubo de tripsina através de uma peneira de náilon de 40 mícrons e lavar a peneira com cinco mililitros adicionais de meio para células estromais endometriais de camundongo. Em seguida, coletar as células por centrifugação.E ressuspenda o pellet em meio fresco para células estromais endometriais de camundongo para semeadura em lamínulas revestidas com polilisina na densidade apropriada para a análise posterior planejada. A pureza das culturas primárias de células pode ser avaliada pelas diferenças na expressão de vimentina e citoceratina, uma vez que os níveis de vimentina são elevados nas células estromais endometriais de camundongo e baixos nas células epiteliais endometriais de camundongo, enquanto os níveis de citoceratina são elevados nas células epiteliais endometriais de camundongo e baixos nas células estromais endometriais de camundongo.A dupla coloração mentina/citoceratina ilustra ainda mais a expressão da mentina por células estromais, bem como a expressão exclusiva de citoceratina pelas células epiteliais. A indução da decidualização em culturas de células estromais pela aplicação de monofosfato de adenosina cíclico e MPA revela que os níveis de mRNA de prolactina aumentam drasticamente após cinco dias de tratamento em comparação com culturas de células estromais controle. Como as células epiteliais são difíceis de visualizar em inserções laterais de cultura celular, um ensaio de viabilidade pode ser realizado imediatamente após uma simulação de decidualização de cinco dias, com uma mudança de cor de azul para rosa brilhante indicando a presença de células epiteliais viáveis.Após esta técnica, outros métodos, como ensaios de adesão de blastocisto, podem ser realizados para avaliar se fatores secretados pelas células epiteliais na presença de um blastocisto podem induzir a decidualização de células estromais.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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