Isolamento de rato Endometrial epiteliais e estromais para células
2 de março de 2017
Este estudo apresenta um método padronizado e validado para o isolamento e cultura de rato primária do estroma do endométrio e pelas células epiteliais, o que pode ser utilizado num sistema de co-cultura para estudo em decidualização vitro.
Os objetivos gerais deste procedimento são isolar e cultivar células primárias murinas endometriais, estromais e epiteliais para seu co-cultivo com o estudo da desidualização in vitro. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da medicina reprodutiva, como quais são os sinais parácrinos entre células epiteliais e estromais durante processos importantes como a desidualização e a invasão de trofoblastos, e como essa via de sinalização é regulada. Essas técnicas podem ser utilizadas para estudar o processo de desidualização em um sistema de co-cultivo epitelial e estromal.
Ao usar este sistema, é possível avaliar se moléculas sinalizadoras secretadas por uma das duas células podem influenciar esse processo. Antes de coletar o útero, realize um exame de esfregaço vaginal para verificar as fases do ciclo dos animais. Para selecionar apenas camundongos na fase de estro.
Caracterizado pela presença de células epiteliais da córnea na lavagem vaginal. Em seguida, utilize pinças e tesoura para abrir o abdômen do primeiro animal em estro e afaste os intestinos para o lado para visualizar ambos os cornos uterinos. Segurando um corno na extremidade mais distal, sob a tuba uterina, dissecar o tecido uterino da tuba uterina utilizando pinças de dissecação e pinças Dumont número cinco para remover os tecidos adiposo e conjuntivo.
Em seguida, remova o corneto na extremidade distal, acima do corpo uterino. Após a remoção dos cornetes uterinos, coloque-os em uma placa de Petri de 35 milímetros com três mililitros de HBSS. Quando todos os cornetes uterinos tiverem sido coletados, transfira a placa para sob um microscópio estereoscópico e utilize pinças para remover quaisquer tecidos adiposos e conjuntivos residuais.
Em seguida, utilizando pinças Dumont número cinco, pinças de dissecação e tesoura pequena de mola, abra longitudinalmente os cornos uterinos para expor seus lúmens e lave os tecidos em uma nova placa de Petri contendo HBSS fresco. Agora, transfira todos os cornos para um tubo de 15 mililitros contendo pancreatina e tripsina. E incube os tecidos horizontalmente por 60 minutos a quatro graus Celsius e 50 rpm em um agitador orbital.
Após o término da hora, transfira o tubo para a bancada e realize uma incubação horizontal de 45 minutos sem agitação, seguida por uma incubação horizontal de 15 minutos sem agitação em banho-maria a 37 graus Celsius. Ao final da incubação no banho-maria, decante cuidadosamente o sobrenadante e transfira os úteros para uma placa de Petri contendo meio para células epiteliais endometriais de camundongo frio por cinco minutos, a fim de inativar a atividade da tripsina. Em seguida, transfira os tecidos para um tubo de 15 mililitros contendo três mililitros de HBSS frio e vortexie os tecidos por 10 segundos para liberar as lâminas epiteliais.
Em seguida, lave os úteros em uma nova placa de Petri contendo três mililitros de HBSS fresco e colete mais duas suspensões de folhas epiteliais em dois novos tubos de 15 mililitros, conforme acabou de ser demonstrado. Após o terceiro vortex do tecido, transfira os úteros para um tubo cônico de 15 mililitros contendo a mistura de digestão de células estromais endometriais de camundongo para uma incubação de 30 minutos a 37 graus celsius e 200 rpm. Recupere as folhas epiteliais pipetando suavemente as três suspensões celulares através de uma peneira de nylon de 100 mícrons para remover os detritos teciduais, seguido pela centrifugação da suspensão celular resultante.
Re-suspenda o pellet em 12 mililitros de meio para células epiteliais endometriais de camundongo com mistura completa, e deixe a solução decantar por cinco minutos para separar as células estromais endometriais remanescentes de camundongo por gravidade. Ao final da sedimentação, utilize uma pipeta de cinco mililitros para remover cuidadosamente os dois mililitros superiores do sobrenadante e centrifugue as células coletadas. Em seguida, re-suspenda o pellet de células epiteliais de camundongo no meio epitelial com pipetagem suave.
E plaque as células em lamínulas revestidas com colágeno na densidade apropriada para a análise planejada a jusante. Após o isolamento das células epiteliais, prossiga com as células estromais e remova o tubo de digestão das células estromais de camundongo com os úteros do incubador. Após a incubação de 30 minutos, conforme acabou de ser demonstrado, agite suavemente o tubo manualmente por 10 segundos e transfira os úteros para uma placa de Petri contendo três mililitros de HBSS a quatro graus Celsius.
Lave bem os tecidos, depois adicione três mililitros de meio para células estromais ao tubo de digestão para inativar a atividade da tripsina e transfira o útero para um tubo cônico de 15 mililitros contendo três mililitros de meio fresco para células estromais endometriais de camundongo. Agite suavemente o tubo com tecido por 10 segundos. Em seguida, transfira o útero para uma placa com HBSS frio, seguido pela sua transferência para um novo tubo de 15 mililitros contendo meio para células estromais.
Após uma terceira lavagem do tecido e transferência, incubar os tecidos uterinos em uma nova mistura de digestão de células estromais endometriais de camundongo por 30 minutos a 37 graus Celsius. Ao final da digestão, passar as suspensões celulares do tubo um para o três e do tubo de tripsina através de uma peneira de náilon de 40 mícrons e lavar a peneira com cinco mililitros adicionais de meio para células estromais endometriais de camundongo. Em seguida, coletar as células por centrifugação.
E ressuspenda o pellet em meio fresco para células estromais endometriais de camundongo para semeadura em lamínulas revestidas com polilisina na densidade apropriada para a análise posterior planejada. A pureza das culturas primárias de células pode ser avaliada pelas diferenças na expressão de vimentina e citoceratina, uma vez que os níveis de vimentina são elevados nas células estromais endometriais de camundongo e baixos nas células epiteliais endometriais de camundongo, enquanto os níveis de citoceratina são elevados nas células epiteliais endometriais de camundongo e baixos nas células estromais endometriais de camundongo.
A dupla coloração mentina/citoceratina ilustra ainda mais a expressão da mentina por células estromais, bem como a expressão exclusiva de citoceratina pelas células epiteliais. A indução da decidualização em culturas de células estromais pela aplicação de monofosfato de adenosina cíclico e MPA revela que os níveis de mRNA de prolactina aumentam drasticamente após cinco dias de tratamento em comparação com culturas de células estromais controle. Como as células epiteliais são difíceis de visualizar em inserções laterais de cultura celular, um ensaio de viabilidade pode ser realizado imediatamente após uma simulação de decidualização de cinco dias, com uma mudança de cor de azul para rosa brilhante indicando a presença de células epiteliais viáveis.
Após esta técnica, outros métodos, como ensaios de adesão de blastocisto, podem ser realizados para avaliar se fatores secretados pelas células epiteliais na presença de um blastocisto podem induzir a decidualização de células estromais.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método padronizado e validado para o isolamento e cultivo de células estromais e epiteliais endometriais primárias de camundongo, que podem ser utilizadas em um sistema de cocultivo para estudar a decidualização in vitro.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Medicina Reprodutiva
- Técnicas de Cultura Celular
- Biologia Endometrial
Contexto
- Compreender a decidualização é essencial para a saúde reprodutiva.
- A sinalização parácrina entre células epiteliais e estromais desempenha um papel fundamental nesse processo.
- Culturas primárias de células podem fornecer informações sobre essas vias de sinalização.
- Métodos padronizados são necessários para a reprodutibilidade na pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Isolar e cultivar células endometriais primárias de camundongo.
- Estabelecer um sistema de cocultura para estudar a decidualização.
- Investigar os mecanismos de sinalização envolvidos na decidualização.
Métodos Utilizados
- Exame de esfregaço vaginal para selecionar camundongos na fase de estro.
- Dissecação e coleta de cornos uterinos em condições estéreis.
- Incubação com pancreatina e tripsina para dissociação celular.
- Cultivo celular e purificação utilizando malha de náilon e centrifugação.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de células epiteliais e estromais do endométrio de camundongo.
- Demonstração da capacidade do sistema de cocultura em estudar a decidualização.
- Avaliação da pureza celular por meio da expressão de vimentina e citoceratina.
- Indução da decidualização observada com tratamentos específicos.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para o estudo das interações entre células endometriais.
- Os conhecimentos obtidos podem aprofundar a compreensão dos processos reprodutivos.
- Estudos futuros podem se basear nesse arcabouço para explorar vias de sinalização adicionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a desmistificação mecanicista da comunicação estromal-epitelial endometrial na medicina reprodutiva, fornecendo um sistema padronizado e reprodutível para estudar a sinalização parácrina durante a decidualização. Ele apoia a validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios para vias relacionadas à implantação, oferecendo valor preditivo em modelos pré-clínicos de fertilidade e comunicação embrião-endométrio. A abordagem de cocultivo aumenta a continuidade translacional ao capturar dinâmicas intercelulares não observadas em sistemas de monocultivo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a sinalização parácrina epitélio-estromal na decidualização, esclarecendo os mecanismos moleculares da implantação embrionária.
- Valor Operacional: Fornece populações puras e viáveis de células primárias com pureza avaliável por meio dos marcadores vimentina e citoceratina, reduzindo o ruído biológico na triagem de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Apoia o desenvolvimento de ensaios baseados em cocultura para avaliar fatores secretados (por exemplo, de células epiteliais) que modulam a decidualização estromal, permitindo a desconvolução de ligante-receptor.
- Valor Operacional: O protocolo padronizado de isolamento melhora o rendimento e a viabilidade, aumentando a reprodutibilidade e escalabilidade do ensaio para triagem de compostos ou siRNA.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a comunicação estromal-epitelial relevante para doenças em um sistema previamente sensibilizado hormonalmente, alinhando-se à avaliação pré-clínica das etiologias da falha de implantação.
- Valor Operacional: Facilita a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, permitindo leituras funcionais posteriores, como a indução de mRNA de prolactina e ensaios de viabilidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre biologia da descoberta e identificação de compostos líderes, especialmente para alvos que medeiam interações estromais-epiteliais na receptividade uterina e na manutenção da gestação inicial.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre os estímulos da decidualização estromal e moléculas sinalizadoras derivadas do epitélio em um sistema de co-cultura controlado.
- Triagem: Permite a avaliação quantitativa de respostas da decidualização (por exemplo, expressão de prolactina, alterações morfológicas) em resposta a meios condicionados pelo epitélio ou moduladores candidatos.
- Análises: Gera variáveis dependentes mensuráveis, como alterações na expressão gênica e na viabilidade, permitindo comparações estatísticas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas à relevância pré-clínica ao modelar respostas estromais sensibilizadas por hormônios em uma co-cultura com contexto fisiológico.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de isolamento de células primárias para testes iterativos de vias de sinalização, reduzindo a dependência de modelos in vivo variáveis.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de implantação ao isolar variáveis na comunicação epitelial-estromal.
- Valor Operacional: Etapas padronizadas de dissociação enzimática e purificação melhoram a consistência entre lotes em diferentes laboratórios.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar em programas de alvos de fertilidade, fornecendo confiança preditiva precoce nos fenótipos de resposta estromal.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em sua capacidade de modular a decidualização em um sistema de co-cultura murino relevante para humanos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecido primário, digestão enzimática e técnicas estéreis de cultivo celular.
- Depende do acesso a HBSS, pancreatina, tripsina, superfícies revestidas com colágeno e polilisina, e microscopia de contraste de fase para monitoramento.
- Necessita da sincronização dos ciclos estrais de camundongos por meio de esfregaço vaginal para garantir a homogeneidade do tecido.
- A adaptação a outras espécies ou condições hormonais pode exigir a otimização das concentrações de enzimas e dos tempos de incubação.
- A avaliação da pureza por imunomarcação para vimentina e citoceratina acrescenta uma etapa de validação, mas é apoiada pela fonte como um método confiável.
