Intravital Microscopia e trombo Indução no lóbulo da orelha de um rato calvo
2 de abril de 2017
O modelo orelha do rato SKH1-hr hr sem pêlos permite a microscopia de fluorescência intravital da microcirculação e indução trombo fototóxico sem preparação cirúrgica prévia no leito microvascular examinado. Portanto, a orelha do rato sem pêlo é um excelente modelo in vivo para estudar as interacções complexas durante a formação do trombo microvascular, evolução de trombos, e trombólise.
O objetivo geral deste experimento é estudar a influência de potenciais fármacos vasoativos na formação de trombos microvasculares in vivo. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a formação de trombos, como a identificação de novas substâncias antitrombóticas que poderiam prevenir a formação de trombos microvasculares, uma das principais complicações na sepse e durante o transplante de tecidos. A principal vantagem desta técnica é que o modelo da orelha do camundongo sem pelos permite a microscopia de fluorescência intravital e a indução fototóxica de trombos sem necessidade de preparo cirúrgico prévio na área microvascular examinada.
Inicie pesando e registrando o peso do camundongo. Em seguida, carregue o volume apropriado da substância-teste em uma seringa de insulina. Administre a droga 30 minutos antes da indução do trombo.
Após anestesiar o camundongo 15 minutos antes da indução do trombo, coloque o camundongo de volta na gaiola até o início da anestesia. Para verificar uma anestesia suficiente, pinça a cauda com uma pinça e observe a ausência de reação. Em seguida, coloque 0,05 ml de dextrana 50 descongelada em uma seringa de insulina.
Após encher a seringa, certifique-se de que não permaneçam bolhas de ar, pois mesmo pequenas bolhas de ar administradas intravenosamente podem ser letais para o animal. Coloque o camundongo anestesiado sobre uma placa de acroglass com placa aquecida integrada na posição ventral para baixo. Ajuste a placa aquecida para 37 degress Celsius.
Cubra as córneas dos olhos do camundongo com pomada oftálmica. Em seguida, faça dois pontos de polipropileno 7,0 nas bordas cranial e caudal da orelha direita. Posicione os pontos o mais próximo possível da borda e o mais próximo possível da base.
Posicione o mouse em posição dorsal. Fixe todas as patas à plataforma utilizando atadura adesiva. Passe uma sutura sob os dentes da frente e posicione a cabeça em dorsiflexão fixando a sutura à plataforma com atadura adesiva.
Coloque o animal sobre a plataforma sob o microscópio estereoscópico. Utilize uma ampliação de 10X. Para a microscopia da orelha direita, prepare a veia jugular esquerda criando primeiro uma incisão de 5 mm na pele do pescoço em direção cranio-caudal.
Em seguida, utilize pinças microcirúrgicas e tesouras microcirúrgicas para dissecar o tecido subcutâneo. Depois, libere a veia de sua adventícia sem tocar o vaso. Agora, use a seringa de insulina previamente preparada para a injeção do corante fluorescente.
Segure cuidadosamente a parede do vaso com a pinça microcirúrgica sem perfurar a veia. Penetre a parede do vaso distendido com a agulha da seringa e injete 50 Dextran por via intravenosa. Retire a agulha e estanque o sangramento utilizando cotonetes.
Evite a contaminação do ouvido com sangue e corante. Transfira o animal para a placa aquecida em uma estrutura de vidro acro com uma fenda para a placa auditiva e uma superfície plana de 0,5 cm de altura para posicionar o ouvido. Fixe o animal em posição prona sobre a placa aquecida utilizando um curativo adesivo.
Coloque a cartilagem convexa na base da orelha ao lado do plano da orelha, de modo que a parte apical da orelha possa ser posicionada plana sobre o plano. Adicione uma gota de água à temperatura ambiente à placa de vidro acro. Usando cotonetes, absorva a gota de água e deixe as forças capilares fixarem o plano da orelha à placa de vidro acro.
O pavilhão auricular deve ser posicionado o mais plano possível, embora a cartilagem confira ao pavilhão uma forma convexa. Assim, apenas a parte distal mais flexível do pavilhão auricular deve ser posicionada sobre a placa de vidro acrílico. Para evitar danos ao tecido e extravasamento de fluidos e corante, toque a orelha o mínimo possível com a pinça.
Em seguida, adicione uma gota de aqua à face dorsal convexa da orelha. Coloque cuidadosamente uma lamínula sobre a orelha sem comprimir os vasos basais que entram na orelha. Utilize cotonetes para remover o máximo possível de aqua de sob a lamínula, a fim de minimizar a distância entre a lamínula e os vasos-alvo da orelha.
Inicie ajustando o microscópio de fluorescência intravital para a visualização da Dextrana 50. Transfira o animal preparado para a platina do microscópio de fluorescência intravital. Usando aumentos de 5X, 10X e 20X, e intensidade de luz de 20%, procure um vaso venoso com diâmetro entre 50 e 60 micrômetros e com fluxo sanguíneo anterógrado.
Adicione uma gota de água à temperatura ambiente sobre a lamínula para imersão em água do objetivo de 63X de aumento. Imediatamente após a aplicação da gota de água, comece a gravar o vaso por 20 segundos para a avaliação basal do diâmetro e do fluxo sanguíneo. Inicie a indução de trombo cinco minutos após a injeção de 50 Dextran.
Para esse fim, aumente a intensidade da luz para 100%. Durante a indução fototóxica de trombo, feche a abertura do microscópio por dois segundos dentro de um período de 30 segundos para verificar a oclusão do fluxo sanguíneo. Se o fluxo sanguíneo persistir, abra novamente a abertura. O vaso é classificado como ocluído se o fluxo permanecer parado por 30 segundos ou mais, ou se o fluxo sanguíneo for retrógrado.
Selecione e oclua cinco vasos por orelha dentro de um período de uma hora após a injeção de 50 Dextran. Aqui, os animais foram tratados com veículo ou com canabinoides, anandamida, WIN 155,212-2 ou canabidiol antes da injeção de 50 Dextran, previamente à indução de trombo. A anandamida, mas não o CBD, e o WIN 155,212-2 aceleraram significativamente o crescimento do trombo após tratamento único em comparação com o controle com veículo.
Em outra configuração, a anandamida foi combinada com indometacina para avaliar o impacto dos produtos dependentes da ciclo-oxigenase na formação de trombos por meio da anandamida. A coadministração com indometacina neutralizou o efeito pró-trombótico da anandamida. Portanto, a exposição aguda à anandamida provoca um efeito pró-trombótico dependente da ciclo-oxigenase in vivo.
Uma vez dominada, a indução de trombo em vasos estreitos pode ser realizada em 90 minutos, incluindo a preparação. Ao tentar este procedimento, é importante manipular o átrio com muita cautela toda vez que for tocado, para evitar a extravasação de fluidos e corante. Embora este método possa fornecer informações sobre a formação de trombos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como cicatrização de feridas, falha de retalhos e angiogênese.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da aplicação intravenosa de corante fluorescente, da posição da aurícula e da iluminação de vasos específicos para realizar a indução fototóxica intravital de trombo.
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Visão Geral
Este estudo utiliza o modelo de orelha do camundongo sem pelos SKH1-Hrhr para microscopia de fluorescência intravital a fim de investigar a formação de trombos microvasculares. O modelo permite a indução fototóxica de trombos sem preparo cirúrgico prévio, tornando-o ideal para o estudo da evolução do trombo e da trombólise.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia microvascular
- Formação de trombos
Contexto
- A formação de trombos microvasculares é uma complicação significativa na sepse e no transplante de tecidos.
- O modelo da orelha fornece um ambiente in vivo único para o estudo da dinâmica dos trombos.
- A microscopia de fluorescência intravital permite a observação em tempo real da microcirculação.
- Fármacos vasoativos potenciais podem ser testados quanto aos seus efeitos na formação de trombos.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a influência de fármacos vasoativos na formação de trombos microvasculares in vivo.
- Identificar novas substâncias antitrombóticas que possam prevenir a formação de trombos.
- Explorar os mecanismos da evolução do trombo e da trombólise.
Métodos Utilizados
- Administração de substâncias-teste por meio de seringa de insulina antes da indução do trombo.
- Uso de anestésicos e técnicas cirúrgicas para preparar o modelo de camundongo.
- Microscopia de fluorescência intravital para visualizar a formação de trombos.
- Indução fototóxica de trombo e avaliação da oclusão do fluxo sanguíneo.
Resultados Principais
- A anandamida acelerou o crescimento do trombo em comparação com o controle veicular.
- A coadministração de indometacina neutralizou o efeito pró-trombótico da anandamida.
- A indução de trombo pode ser realizada de forma eficiente em até 90 minutos.
- A técnica permite a observação detalhada da dinâmica do trombo in vivo.
Conclusões
- O modelo da orelha é eficaz para estudar a formação de trombos microvasculares.
- Fármacos vasoativos podem influenciar significativamente a dinâmica dos trombos.
- São necessárias mais pesquisas para explorar os mecanismos por trás desses efeitos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de microscopia intravital permite a avaliação em tempo real da formação de trombos microvasculares em um ambiente in vivo fisiologicamente relevante, apoiando a avaliação precoce de compostos vasoativos quanto ao seu potencial antitrombótico. Ao eliminar a necessidade de preparo cirúrgico, o modelo da orelha de camundongo sem pelos aumenta a produtividade e a reprodutibilidade na pesquisa pré-clínica de tromboses. O sistema fornece insights mecanicistas sobre a dinâmica do trombo, auxiliando na validação de alvos e na identificação de compostos promissores para distúrbios trombóticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar hipóteses terapêuticas relativas aos efeitos de fármacos vasoativos nas vias de formação de trombos.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos mediante observação direta do crescimento do trombo e da oclusão na microvasculatura intacta.
- Valor Preditivo: Gera dados quantitativos com resolução temporal sobre a evolução do trombo, aumentando a confiança nos resultados da modulação de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Produz leitos microvasculares padronizados e reprodutíveis para triagem consistente de compostos entre laboratórios.
- Saída quantitativa: Fornece pontos finais mensuráveis, como tempo até oclusão e tamanho do trombo, para análise de resposta à dose.
- Escalabilidade: Permite a avaliação de múltiplos vasos por animal dentro de um período definido, apoiando triagem de média produtividade.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para Doenças: Modela a trombose microvascular relevante para sepse e complicações do transplante de tecidos.
- Continuidade Tradutiva: Conecta achados in vitro com a fisiopatologia in vivo por meio da visualização direta da formação de trombos.
- Mitigação de Riscos: Permite a redução precoce de riscos de compostos ao identificar desvios pró-trombóticos antes de testes pré-clínicos avançados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder, fornecendo leituras funcionais que orientam decisões de prosseguir ou não em programas focados em trombose.
- Biologia da Descoberta: Facilita testes de hipóteses sobre vias moleculares que regulam a formação de trombos utilizando intervenções farmacológicas ou genéticas.
- Triagem: Permite avaliação quantitativa e reprodutível dos efeitos de compostos sobre a cinética do trombo na microcirculação intacta.
- Análise: Gera dados temporais e morfológicos sobre o desenvolvimento do trombo para apoiar análises comparativas entre grupos de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados mecanicistas a modelos clínicos de trombose por meio de fisiopatologias microvasculares conservadas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação de diversos agentes vasoativos em múltiplos projetos pré-clínicos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece clareza mecanicista sobre as vias de formação de trombos, reduzindo a ambiguidade na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza os procedimentos de indução e imagem de trombo, aprimorando a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao identificar riscos pró-trombóticos precocemente na fase de descoberta.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos com base em perfis de risco trombótico in vivo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microscopia intravital, cânulação microcirúrgica de vasos e manipulação de corantes fluorescentes.
- Depende de equipamentos especializados, incluindo estágio aquecido, estereomicroscópio e sistema de imagem de fluorescência com intensidade de luz ajustável.
- Necessita de protocolos padronizados de anestesia e manejo de animais para minimizar a variabilidade na formação de trombos.
- Envolve habilidade técnica na imobilização da orelha e no foco óptico para manter a visualização constante dos vasos.
- Limita-se a leitos microvasculares superficiais, restringindo a aplicação a modelos vasculares cutâneos ou acessíveis.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Administration of Test Substance and Preparation of FITC-Dextran
2:42
Preparation of the Left Jugular Vein and Injection of FITC-Dextran
3:51
Positioning the Right Ear for Intravital Fluorescence Microscopy
5:24
Intravital Fluorescence Microscopy and Thrombus Induction of the Right Ear
7:01
Venular Thrombus Formation after Single Cannabinoid Treatment and Cyclooxygenase Inhibition
8:03
Conclusion
