Analisando Synaptic Modulação da Drosophila melanogaster Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

O objetivo geral deste procedimento experimental é entender a dinâmica sináptica em um único neurônio sob diferentes condições de ativação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da plasticidade sináptica, como revelar mudanças na composição molecular das sinapses após a maturação da atividade do neurônio. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a análise semiautomatizada de vários aspectos das sinapses, incluindo seu número, distribuição e nível de enriquecimento dos componentes moleculares após as sinapses.

Para este experimento, colete as moscas em frascos normais dentro de seis horas após a eclosão. Coloque os frascos de coleta em um rack de acrílico transparente. Em uma pequena incubadora ajustada para 25 graus Celsius, posicione o rack a uma distância precisa de um painel de LED onde a exposição à luz esteja em média 1000 lux.

Em seguida, a traseira voa por um a três dias usando uma das seguintes condições, escuridão constante, 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão ou luz constante. Mais tarde, dissecar e manchar os cérebros usando técnicas padrão. Para montar os cérebros das moscas, carregue uma micropipeta com meio de montagem e deposite duas gotas de 2 microlitros no centro de uma lâmina de microscópio a cerca de 2 cm de distância.

Coloque uma lamínula em cada gota e a abertura entre cerca de 0,2 mm. Em seguida, deposite 15 microlitros de meio de montagem sobre as lamínulas e na lacuna. Sob um microscópio de dissecação, deposite o cérebro na lacuna da micropipeta.

E então posicione os cérebros, com o lado ventral para cima. Por fim, coloque uma lamínula e sele-a ao longo das bordas com esmalte transparente. Os cérebros podem então ser fotografados usando técnicas padrão para reconstituir imagens 3D.

Nesse caso, a luminescência GFP é documentada em células com expressão ativa de Brp usando o método estrela. Também neste exemplo, os axônios fotorreceptores R7 e R8 foram imunolabizados com anticiaoptina, que foi visualizada usando anticorpos secundários marcados com RFP. Para quantificar o número, distribuição e nível de deslocalização do Brp GFP, o primeiro carregamento de imagens 3D reconstituídas do cérebro feitas a partir de pilhas de imagens.

Os pontos Brp são exibidos em branco. Agora, encontre a região de interesse. Nesse caso, os terminais do axônio R8 estão localizados seguindo o afinamento dos axônios positivos para anticiaoptina no ponto de entrada na camada da medula M3.

Em cada terminal do axônio R8, identifique o ponto Brp GFP usando o módulo de detecção de pontos. Selecione adicionar novos pontos e, em seguida, selecione segmentar apenas a região de interesse nas configurações do algoritmo. Depois que a região de análise for definida, defina o canal de origem como Brp GFP e, em seguida, defina o diâmetro XY estimado para 0,35 mícrons.

Em seguida, marque a subtração de fundo na detecção de pontos. Em seguida, selecione a qualidade como o tipo de filtro e os pontos são filtrados automaticamente. Conclua esta etapa clicando em concluir.

Repita o método de detecção de manchas para todos os axônios R8 no conjunto de dados. A próxima região a ser identificada é o citoplasma do axônio. Primeiro, gere objetos de superfície com a função de superfície.

Em seguida, selecione adicionar novas superfícies e, nas configurações do algoritmo, alterne a região de interesse somente segmentar. Agora, selecione manualmente a região de interesse. Em seguida, defina os perímetros de cálculo.

Para encontrar o canal fotorreceptor como fonte, selecione a opção suave. Para o limite, selecione intensidade absoluta. Ative a opção de dividir objetos em contato.

Defina o diâmetro dos pontos do assento para 0,5 mícrons e use as configurações de filtro padrão para qualidade e número de voxels. O filtro é então aplicado automaticamente. Agora, vá para editar e excluir as peças de superfície geradas fora da região de interesse.

Neste caso, os outros axônios. Depois de repetir a detecção da região do axônio para todos os axônios R8 no conjunto de dados, todos os axônios Brp puncta e R8 são identificados como um conjunto de objetos pontuais. E as regiões citoplasmáticas correspondentes são identificadas como objetos de superfície.

Agora, prossiga definindo manualmente a orientação e o espaço de cada axônio. Isso é importante para a quantificação posterior da densidade de Brp GFP ao longo de cada neurônio no neurópilo da medula. Para fazer isso, primeiro defina seus pontos iniciais e finais.

Selecione adicionar novos pontos de medição e, em seguida, selecione editar seguido de selecionar a superfície do objeto para trabalhar com a parte superior dos objetos de superfície. Para definir os pontos iniciais, coloque pontos de medição em todos os objetos de superfície dos axônios R na camada M1. Coloque esses pontos em uma ordem reprodutível sistemática.

Em seguida, defina os pontos finais. Selecione adicionar novos pontos de medição, editar e superfície do objeto novamente. Em seguida, repetindo a mesma ordem sistemática, coloque os pontos de medição na parte inferior dos axônios R na camada M3.

Para quantificar a intensidade de fundo do Brp, analise as regiões citoplasmáticas de dois axônios R7. Selecione adicionar novas superfícies e defina manualmente a região de um axônio R7 como foi feito para os axônios R8. Use configurações idênticas, exceto que não ative a opção ativar objetos de toque divididos.

Deixe isso de fora. Em seguida, adicione um objeto de manchas fictícias dentro de uma região de axônio R7 definida. Selecione adicionar novos pontos e selecione ignorar a criação automática e edite manualmente.

Em seguida, selecione o centro do objeto e clique no objeto de superfície para colocar o objeto de manchas fictícias dentro do axônio R7. Agora, repita as etapas de detecção de superfície e ponto para um segundo axônio R7. Em seguida, defina os pontos terminais inicial e final dos axônios R7 como feito com os axônios R8.

Para esta análise, certifique-se de ter o software correto instalado. Abra o conjunto de dados que contém os dados de ponto, dados de superfícies e dois objetos de ponto de medição, cada um contendo o mesmo número de pontos de medição. Inspecione os dados.

Ambos os objetos de ponto de medição devem ter o mesmo número de pontos de medição para que os cálculos funcionem. Depois que os pontos, regiões de axônio e pontos inicial e final forem definidos, inicie o plug-in. Primeiro, verifique os metadados, em particular, o tamanho do voxel.

Abra as propriedades da imagem na edição e verifique as 3 dimensões do voxel e dos mícrons em coordenadas na geometria. Em seguida, selecione um canal para a análise de intensidade. Nesse caso, o canal que mostra Brp GFP é selecionado.

Em seguida, defina o nome do arquivo para os resultados. Em seguida, defina o número de caixas como 10 e defina o comprimento do axônio para 100%Em seguida, defina as regiões do ponto definindo o raio do ponto para 0,35 mícrons e a região citoplasmática circundante para 50 mícrons. Por fim, execute o comando de detecção de sinapse e, posteriormente, analise estatisticamente a saída.

Seguindo os protocolos descritos, os pontos Brp GFP foram analisados nas sinapses R8 de moscas expostas à escuridão constante, luz constante ou a um ciclo normal de luz / escuridão. O número de pontos de Brp foi significativamente reduzido em fotorreceptores R8 de moscas mantidas em luz constante. A distribuição do ponto foi calculada usando um plug-in personalizado.

As sinapses R8 foram distribuídas ao longo da diáfise axonal da camada M1 à M3, mas sua densidade foi maior nas camadas M1 e M3. Da mesma forma, foram calculados os níveis de deslocalização dos pontos. Eles permaneceram inalterados em todas as condições, no entanto, os níveis de deslocalização do Brp GFP diferiram de outros repórteres, como o Brp-short-cherry, que se torna claramente desativado sob luz constante.

É possível que haja processamento inadequado do fragmento curto do Brp após a desmontagem do AZ. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar as propriedades plásticas sinápticas em um único neurônio. Tais propriedades plásticas incluem o número de sinapses, sua distribuição e o rótulo de enriquecimento de um componente molecular específico após as sinapses.