Name: Método Ecotoxicológico com Bactérias Marinhas Vibrio anguillarum Avaliar a Toxicidade Aguda dos Contaminantes Ambientais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprenda um método ecotoxicológico para avaliar a toxicidade aguda de poluentes usando a bactéria marinha Vibrio anguillarum. Este protocolo determina a CL50 após exposição de seis horas.

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Este trabalho foi financiado pelo projecto de investigação &quot;NanoBioTech ambiente e salute, Progetto 2: Ambiente, Estudo e metodologia para o monitoramento ecotossicológico da Nanoparticela&quot; ( &quot;Nano-BioTechnology: ambiente e saúde. Monitorização de nanopartículas &quot; ) concedida à LM pela Regione Lazio-Consorzio Hypatia. AR foi financiado por uma bolsa de pós-doutorado da Universidade de Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia no âmbito do projecto anteriormente citado. Um acordo com a Universidade ISPRA-Tor Vergata (N. 2015/52857) permitiu o uso mútuo das instalações eo intercâmbio de investigadores. Os autores agradecem à Profa. Maria Cristina Thaller, anjo da guarda para todas as atividades microbianas, para despertar o interesse no mundo microbiano e por ajudar fortemente a melhorar nossa pesquisa sobre o assunto. Os autores agradecem a Andrea Tornambè e EriKa Magaletti pela colaboração preciosa com o laboratório de Phytoplankton da ecologia e do ecotoxicology de ISPRA.

1. Preparação de Reagentes / Materiais <ol><li> Preparar (cerca de 300) tubos estéreis de 1,5 mL para a diluição em série de suspensões bacterianas, bem como tubos estéril de 15 mL como recipientes de teste marcados com as concentrações de teste. </li><li> Preparar solução de NaCl a 2% como meio de exposição e esterilizar. Alternativamente, use água do mar sintética ou natural esterilizada, com salinidade variando de 5 a 40. </li><li> Preparar o meio de cultura de agar de soja tryptic (TSA) com NaCl a 2% de acordo com as direcções do rótulo e considerando a quantidade de NaCl já presente no meio. </li><li> Despeje o TSA (fresco, mas ainda líquido) nas placas de Petri de 90 mm previamente marcadas com a concentração do ensaio eo tempo de exposição, número de repetição e factor de diluição; 19 mL é um volume apropriado. </li><li> Preparar caldo de soja tryptic (TSB) meio de crescimento de acordo com as instruções do rótulo. Adicionar a quantidade adequada de NaCl para obter a mesma salinidade que o meio de exposição. </li><li> PrepararUma solução de reserva de CuSO4 com água duplamente destilada e esterilizar a alíquota (necessária) utilizando um filtro de seringa de 0,22 μm. No caso de amostras ambientais, preparar um intervalo adequado de diluições da amostra e esterilizá-las utilizando um filtro de seringa de 0,22 μm. </li><li> Preparar as soluções de teste nos tubos de 15 mL marcados com as concentrações de teste. Preencher o controlo negativo com 5 mL do meio de exposição (NaCl a 2%). Encher os outros tubos com a quantidade apropriada de meio de exposição e solução de reserva de CuSO4 para obter as concentrações de teste num volume final de 5 mL. </li></ol> 2. Preparação do Inoculo Bacteriano <ol><li> 12-18 h antes do teste, preparar uma cultura líquida fresca de Vibrio anguillarum . Utilizando um ciclo estéril, seleccione uma única colónia bem isolada de uma cultura durante a noite num meio sólido (TSA). Inocular um tubo cheio com 10 mL de TSB e incubar a cultura bacteriana a 25 ° C durante 12-18 h. </li&gt; <li> Após 12-18 h, estimar a concentração bacteriana do inóculo por espectrofotometria. Vortex o inóculo e medir a densidade óptica a 600 nm de comprimento de onda, usando TSB como branco. </li><li> Para se obter uma concentração bacteriana conhecida, diluir 2 mL do inoculo em vortex adicionando a quantidade de TSB calculada por esta fórmula: TSB mL = [(OD / 0,14) * 2] - 2. </li><li> Verificar se a densidade óptica do inóculo diluído é de 0,140 (± 0,005), o que corresponde ao ponto 0,5 do padrão nefelométrico de McFarland. </li><li> Centrifugar o inóculo diluído durante 10 min a 3.000 g . Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender a pastilha microbiana em 1 mL de solução de NaCl a 2% (meio de exposição). </li></ol> 3. Testando a Exposição <ol><li> Adicionar 150 μL do inóculo bacteriano ressuspenso a cada tubo, incluindo o controlo. Incubar as suspensões de V. anguillarum por 6 h a 25 ° C sob escuridão e em continuouAgitando para evitar a sedimentação. </li><li> No início (T 0 ) e no fim (T 6 ) do tempo de exposição, efectuar contagem bacteriana em todas as suspensões bacterianas expostas utilizando métodos de contagem de unidades formadoras de colónias (CFU). </li><li> Preparar diluições em série de cada suspensão bacteriana exposta em triplicado, aplicando um factor de diluição de dez vezes (até 10 -5 ). Adicionar 100 μL de cada suspensão bacteriana ao tubo correspondente já cheio com 900 μL de meio de exposição (NaCl a 2%). Proceder com a diluição em série, vortexing em cada etapa para voltar a suspender as bactérias. </li><li> Placa 10 μL das diluições 10 -4 e 10 -5 em placas de Petri TSA no segmento correspondente. Rapidamente deixe as gotas deslizarem em um pequeno círculo girando a placa. Incubar as placas a 25 ° C durante 48 h. </li></ol> 4. Contagem de CFU <ol><li> Após 48 h, contar as colónias cultivadas nas placas de Petri; Pratos abrigando bE entre 5 e 50 colónias são óptimas para contagem exacta. </li><li> Calcular o número de bactérias viáveis ​​por mL de cada suspensão bacteriana exposta aplicando as seguintes fórmulas: 10 -4 @ CFU / mL = n ° CFU x 100 x 10 000 10 -5 → CFU / mL = n ° CFU x 100 x 100 000 </li><li> Utilizar a média das contagens obtidas em repetições paralelas para avaliar a mortalidade em relação ao controlo. Calcular a mortalidade como uma percentagem com a seguinte fórmula: M% = 100 - [(N / C) * 100] NOTA: Onde N = número de CFU / mL crescido após a exposição ao tóxico; C = número de UFC cultivadas no meio de controlo. </li><li> Calcule a CL 50 ( ou seja, a concentração de tóxico que reduz o número de bactérias que se replicam ativamente em 50% por mL, CFU / mL) com análise de regressão não-linear usando um software estatístico apropriado (ver tabela de materiais). Executar uma análise unidirecional de variância (ANOVA) follDevido a testes pós-hoc pairwise para avaliar diferenças significativas entre os tratamentos. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este trabalho descreve um novo bioensaio com a bactéria marinha V. anguillarum que foi aplicada com sucesso para avaliar os efeitos tóxicos de CuSO 4 , um tóxico de referência, demonstrando uma clara relação dose-resposta. A bactéria marinha V. anguillarum foi escolhida como organismo modelo porque é halotolerante, ubíqua e representativa dos ecossistemas marinhos. O teste pode ser realizado com uma ampla gama de valores de salinidade (5-40) e pode usar soluções salinas e água do mar sintética ou natural como meio de exposição, desde que microorganismos possam sobreviver facilmente durante todo o teste. Isto permite a análise de diferentes tipos de amostras, incluindo ambientes salobre e marinho. Nenhum meio de crescimento é necessário durante a fase de exposição, evitando sua interferência com os contaminantes 8 e sua possível influência na resposta biológica. ºO protocolo é confiável, rápido, econômico e relativamente fácil. O procedimento das micro-contagens de líquido para placa 9 dá a vantagem de utilizar pequenos volumes (de amostra), embora isso implique um alto grau de precisão e robustez. Os resultados dos três ensaios independentes e repetições para cada tratamento mostram a elevada repetibilidade deste método. O uso da bactéria como modelo biológico, bem como a adaptabilidade da técnica, favorecem a relevância ambiental e ambiental deste procedimento. Outras questões técnicas críticas são a precisão na preparação do inóculo bacteriano ea esterilidade necessária em algumas etapas do procedimento. O teste proposto é mais rápido (6 h) do que outros ensaios ecotoxicológicos marinhos (24-96 h) e não levanta os problemas éticos resultantes da utilização de organismos superiores. Além disso, os dados sobre o tóxico de referência mostram valores de CL50 comparáveis ​​aos obtidos com<html> Outras espécies marinhas 10 , 11 , demonstrando uma boa sensibilidade. Entre os bioensaios bacterianos, o teste de inibição de luminescência por V. fischeri é o mais comum e bem padronizado 12 . Este bioensaio é muito rápido (15-30 min) e é válido para o teste de amostras em fase sólida, mas pode ser afetado por amostras coloridas e turvas, que interferem com as medições de luminescência. A salinidade é um fator limitante no uso do teste acima mencionado, sendo necessário 2% de NaCl 13 . Pelo contrário , o teste proposto aqui com V. anguillarum dá resultados acessíveis a uma ampla gama de valores de salinidade, não tem limitações em relação a amostras turvas ou coloridas e requer equipamento menos dispendioso em comparação com os analisadores de luminescência. Uma comparação entre os resultados de nosso estudo e os disponíveis na literatura para V. fisheri 14 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 15 , 16 mostra valores CE 50 comparáveis, suportando ainda a eficácia deste bioensaio. Este bioensaio avalia a redução da culturabilidade bacteriana, geralmente referida como mortalidade, em vez de taxa de crescimento populacional ou inibição da atividade enzimática, que são utilizados nos testes atualmente disponíveis para microorganismos. O cálculo LC 50 permite a comparação com outros bioensaios comumente aplicados à avaliação ecotoxicológica de ambientes marinhos, que muitas vezes têm a sobrevida / mortalidade como ponto final. Um exercício de intercalibração é urgentemente necessário para avaliar / confirmar a confiabilidade e reprodutibilidade deste teste e para apoiar sua padronização e uso em protocolos regulatórios. A utilização crescente de nanomateriais e a sua libertação potencial no ambiente implicam a necessidade de uma avaliação dos riscos 17 . No entanto,(Eco) toxicológicas para estes contaminantes emergentes parecem não dar resultados acessíveis e podem exigir algumas adaptações 18 . As características deste novo bioensaio permitem sua aplicação fácil e útil para a avaliação da toxicidade de nanopartículas. De facto, a possibilidade de realizar o ensaio em diferentes salinidades dará contas do comportamento das nanopartículas sob diferentes forças iónicas, uma variável de parâmetro ambiental que pode afectar significativamente a toxicidade 19 . Além disso, o uso de meio de crescimento e nutrientes é particularmente recomendado nas avaliações de ecotoxicidade das nanopartículas, porque as substâncias orgânicas podem facilitar sua absorção aumentando os efeitos tóxicos 20 ou podem causar agregação, reduzindo a fração biodisponível e, portanto, sua toxicidade 21 . Em conclusão, o bioensaio sobre Vibrio anguillarum éRomanização para a avaliação de riscos de contaminantes clássicos e emergentes, bem como para a avaliação do estado dos ambientes marinhos e salobra.

Os bioensaios ecotoxicológicos avaliam a toxicidade de produtos químicos ou amostras ambientais com modelos biológicos padrão, integrando os efeitos dos estressores físicos, químicos e biológicos nos ecossistemas. Devido à complexidade dos ecossistemas, as avaliações de risco ecotoxicológico devem considerar uma bateria de bioensaios que envolvem organismos de diferentes níveis tróficos. Os ensaios de toxicidade em animais de laboratório podem ser dispendiosos, morosos e éticamente duvidosos. O desafio de limitar os ensaios em animais e de desenvolver abordagens alternativas ( por exemplo, sobre bactérias e animais não vertebrados) é actualmente uma questão central, tal como referido no quadro da actual legislação europeia, incluindo a Directiva da UE relativa à protecção dos animais, UE, e REACH. Crustáceos, peixes e algas são amplamente utilizados para medições de toxicidade no ambiente marinho 1 . As bactérias são um componente importanteT do ecossistema e as alterações nas comunidades microbianas podem ter efeitos significativos sobre o ciclo biogeoquímico e outros serviços críticos do ecossistema. Testes de toxicidade baseados em microorganismos estão ganhando popularidade porque são relativamente rápidos, reprodutíveis e baratos e não levantam questões éticas 2 . O objetivo deste trabalho é descrever um protocolo ecotoxicológico para avaliar a resposta da bactéria marinha Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) quando exposta a contaminantes ambientais. V. anguillarum é uma bactéria Gram-negativa, curta, em forma de curva (0,5 x 1,5 μm) com flagelo polar. Tipicamente encontrado em água salobra ou salgada, é halotolerante, com uma salinidade ideal de cerca de 20 e uma temperatura ideal entre 25 e 30 ° C 3 . Ele foi escolhido como um modelo de organismo devido à sua ubiqüidade e seus importantes papéis ecológicos em oceEm todo o mundo 4 . Alguns serótipos de V. anguillarum são conhecidos por causar vibriose em uma variedade de espécies de peixes marinhos ou salobres 5 , 6 . Para isso, algumas etapas do experimento requerem práticas microbiológicas padrão, mas não são necessários equipamentos especiais de segurança ou precauções. O protocolo de teste de toxicidade proposto utiliza a culturabilidade bacteriana ( isto é, a capacidade de replicar e formar colónias) como ponto final e permite a determinação da CL 50 , a concentração que causa uma redução de 50% de bactérias activamente replicando e formando colónias, após Uma exposição de 6 h. Em Vibrio , como em outros micróbios, esta redução, que geralmente indicamos como mortalidade, pode ser parcialmente devida a indivíduos na fase viável mas não cultivável (VBNC) 7 . Neste estudo, aplicamos este método para medir os efeitos tóxicos do sulfato de cobre (CuSO 4), Um tóxico de referência. Este método foi desenvolvido para fornecer um teste adequado baseado em microrganismos para a avaliação ecotóxica de poluentes / compostos químicos, incluindo contaminantes emergentes como nanomateriais. A novidade deste protocolo em comparação com os métodos existentes utilizados para microorganismos está principalmente relacionada com o meio de exposição eo ponto final. De fato, a exposição é realizada em solução salina, evitando qualquer possível interferência do meio de crescimento com os contaminantes investigados, o que pode influenciar a resposta biológica 8 . O ponto final é a redução da culturabilidade bacteriana, que pode ser facilmente comparada com outros parâmetros de avaliação aguda utilizados para o rastreio ecotoxicológico em ambientes marinhos / salubres, com base na sobrevivência / mortalidade. Além disso, o protocolo utiliza a técnica de micro-contagem de líquido para placa, já utilizada em E. coli 9 , reduzindo volumes e, portanto, o ef experimental(Consulte os passos 3.3 e 3.4 do protocolo para mais detalhes).

<table><tbody><tr><td>Vibrio anguillarum (estirpe AL 102, serotipo O1)</td><td></td><td></td><td>Obtido da colecção laboratorial de NOIFMA (Noruega)</td></tr><tr><td>Tríptico de Soja</td><td>Liofilchem</td><td>610052</td><td>Meio de Cultura Desidratado</td></tr><tr><td>Caldo de Soja Tríptico Meio de Crescimento</td><td>Liofilchem</td><td>610053</td><td>Meio de Cultura Desidratado</td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Nome do Equipamento</td><td>Empresa</td><td>Número do Catálogo</td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>Biossegurança Capuz de Fluxo Laminar&nbsp;</td>Incubadora <td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fratelli Galli</td><td>Mod. 2100</td><td></td></tr><tr><td>Nome do Software</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>Benchmark Dose Software&nbsp;</td>Dose de referência <td>da EPA dos EUA</td><td>2.4.0&nbsp;</td><td>2012</td></tr></tbody></table>

método ecotoxicológico com bactérias marinhas<em&gt; vibrio anguillarum</em&gt; avaliar a toxicidade aguda dos contaminantes ambientais

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

As bactérias são um componente importante do ecossistema, e as alterações da comunidade microbiana podem ter um efeito significativo sobre o ciclo biogeoquímico e as redes alimentares. Os testes de toxicidade baseados em microorganismos são amplamente utilizados porque são relativamente rápidos, reprodutíveis, baratos e não estão associados a questões éticas. Aqui, descrevemos um método ecotoxicológico para avaliar a resposta biológica da bactéria marinha Vibrio anguillarum. Este método avalia a toxicidade aguda de compostos químicos, incluindo novos contaminantes, tais como nanopartículas, bem como amostras ambientais. O ponto final é a redução da culturabilidade bacteriana ( ou seja, a capacidade de replicar e formar colónias) devido à exposição a um tóxico. Esta redução pode ser geralmente referida como mortalidade. O teste permite a determinação da LC 50 , a concentração que provoca uma diminuição de 50% das bactérias activamente replicando e formando colónias, apósUma exposição de 6 h. As bactérias cultiváveis ​​são contadas em termos de unidades formadoras de colónias (CFU), e a &quot;mortalidade&quot; é avaliada e comparada com o controlo. Neste trabalho, avaliou-se a toxicidade do sulfato de cobre (CuSO 4 ). Observou-se uma clara relação dose-resposta, com CL 50 média de 1,13 mg / L, após três testes independentes. Este protocolo, comparado com os métodos existentes com microrganismos, é aplicável numa gama mais alargada de salinidade e não tem limitações para amostras coloridas / turvas. Utiliza solução salina como meio de exposição, evitando possíveis interferências do meio de crescimento com os contaminantes investigados. O cálculo LC 50 facilita comparações com outros bioensaios comumente aplicados a avaliações ecotoxicológicas do ambiente marinho.

Os resultados de três ensaios independentes de exposição de V. anguillarum a quatro concentrações de CuSO4 mostram uma relação dose-resposta clara e uma diminuição significativa de bactérias activamente replicando e formando colónias com uma concentração crescente do tóxico de referência ( Figura 1 ; ANOVA, F = 20,28, p @ 0,001). O número de CFU / mL é significativamente reduzido a 1,25 mg / L (teste de Tukey pós-hoc, p &lt;0,05) em comparação com o controlo (CNTR). Todas as bactérias cultiváveis ​​foram detectadas na concentração mais alta testada. Não foram encontradas diferenças na toxicidade de CuSO 4 ao longo da vasta gama de salinidade do meio de exposição ( isto é, NaCl 5, 20 ou 35 g / L, dados não apresentados). Uma saída representativa da análise estatística mostrando a regressão não linear é relatada na Figura 1 Suplementar . Os valores de CL50 calculados para os três ensaios independentes (&lt;Forte&gt; Tabela 1) destacam a viabilidade e reprodutibilidade deste método. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55211/55211fig1.jpg" /> Figura 1: Vibrio anguillarum exposto a CuSO 4. O número médio de CFU / mL (CFU = unidade formadora de colónia) exposto a diferentes concentrações de CuSO 4 durante 6 h. Os valores representam a média (± DP) de três ensaios independentes. As reduções de bactérias activamente replicando e formando colónias em relação ao controlo (CNTR) são reportadas nas caixas amarelas (como percentagens). Diferenças significativas com o controle, com base em um teste de Tukey pós-hoc, são indicadas com asteriscos (* = p &lt;0,05; ** = p &lt;0,01). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55211/55211fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Tabela 1: Valores de concentração letal (LC50) para Vibrio anguillarum exposto a CuSO 4 . Os resultados de três ensaios independentes e médias (± DP) são relatados. Figura 1: Análise de regressão não-linear. Resultado representativo de uma análise de regressão não linear (modelo Logit-Hill) realizada sobre os resultados do teste. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55211/suppl_fig_1.tif" target="_blank">Clique aqui para fazer o download desta figura.</a>

Este trabalho descreve um novo protocolo para avaliar a ecotoxicidade de poluentes, incluindo contaminantes emergentes como nanomateriais, utilizando a bactéria marinha Vibrio anguillarum . Este método permite a determinação da CL 50 , ou mortalidade, da concentração que provoca uma diminuição de 50% na cultura das bactérias, após uma exposição de 6 horas.

Método Ecotoxicológico com Bactérias Marinhas<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Avaliar a Toxicidade Aguda dos Contaminantes Ambientais

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Somos pesquisadores da Universidade Tor Vergata no Instituto Italiano para a Proteção e Pesquisa Ambiental em Roma. Desenvolvemos ferramentas para avaliar o impacto de poluentes no meio ambiente e identificamos organismos modelo como bioindicadores. Estamos no laboratório de ecotoxicologia do Departamento de Biologia da Universidade Tor Vergata.Neste vídeo, descrevemos um método ecotoxicológico para avaliar a resposta biológica da bactéria marinha Vibrio anguillarum. Este vídeo abrange todos os passos de preparação e execução do teste de toxicidade. Além do equipamento laboratorial habitual, prepare os seguintes materiais.Tubos de 1,5 mililitro para diluição seriada de suspensões bacterianas. Placas de Petri com diâmetro de 90 milímetros para semeadura bacteriana. São necessárias no mínimo duas placas para cada concentração-teste, incluindo o controle.Rotule o lado das placas de Petri com a concentração do teste e o tempo de exposição. Divida o fundo das placas de Petri em seis seções e rotule-as com o número da replicata e o fator de diluição. Use tubos estéreis de 15 mililitros como recipientes para o teste, rotulados com as concentrações do teste.Neste ensaio, utilizamos solução estéril de cloreto de sódio a 2% como meio de exposição. Água do mar sintética ou natural esterilizada também pode ser usada na concentração inicial variando de cinco a 40 gramas por litro. Prepare uma quantidade suficiente de meio de crescimento de ágar tripticaseína-soja com cloreto de sódio a 2%.Adicione o cloreto de sódio considerando a quantidade já presente no meio para atingir a concentração final de 2%. Esterilize-o e, quando estiver frio, mas ainda líquido, preencha as placas de Petri previamente rotuladas. Prepare o caldo tripticaseína-soja como meio de crescimento com cloreto de sódio.Adicione o cloreto de sódio para obter a mesma salinidade do meio de exposição. Considere sempre a quantidade de cloreto de sódio já presente no meio. Neste ensaio, utilizamos caldo tripticaseína de soja com 2% de cloreto de sódio.Sterilize-o e deixe esfriar antes de usar. Neste ensaio, utilizamos o sulfato de cobre como um tóxico de referência. Prepare uma solução estoque com água bidestilada e armazene-a a quatro graus centígrados.Esterilize a alíquota necessária utilizando um filtro de seringa de 0,22 mícrons. No caso de amostras ambientais, prepare uma série apropriada de diluições da amostra. Utilize tubos de 15 mililitros como recipientes de teste.Encha os tubos de exposição com o meio de exposição. Prepare cinco mililitros do controle negativo. Prepare os tubos de exposição com a quantidade apropriada de meio de exposição e solução estoque de sulfato de cobre para obter a concentração de teste em um volume final de cinco mililitros.Este teste exige uma cultura fresca de Vibrio anguillarum. Usando um alça estéril, selecione uma única colônia bem isolada de uma placa de ágar. Inocule-a com essa bactéria dos dias anteriores.Mantendo o tubo em um ângulo, espalhe o inóculo do alça sobre a superfície interna do tubo. Complete com 10 mililitros de caldo tripticaseína de soja. Incube a cultura bacteriana a 25 graus C por 12, 18 horas.A concentração bacteriana do inóculo é estimada espectrofotometricamente. Agite o inóculo em vórtex e meça a densidade óptica no comprimento de onda de 600 nanômetros. Utilize caldo tripticaseína de soja como branco.Para obter uma concentração bacteriana conhecida, dilua dois mililitros do inóculo vortexado adicionando a quantidade de caldo soja triptica calculada por esta fórmula. Verifique se a densidade óptica do inóculo diluído é 14, o que corresponde ao ponto 0,5 do padrão nefelométrico de McFarland. Centrifugue o inóculo diluído por 10 minutos a 3.000 ×g.Elimine o sobrenadante e ressuspenda a paleta microbiana em um mililitro de solução a 2% de cloreto de sódio. Adicione 150 microlitros da inóculo bacteriano ressuspenso a cada tubo. Exponha a suspensão de Vibrio anguillarum por seis horas a 25 graus C sob escuridão e com agitação contínua para evitar sedimentação.No início e no final da exposição, após seis horas, realize a contagem de bactérias em todas as suspensões bacterianas expostas utilizando o método de contagem de unidades formadoras de colônias. Prepare uma diluição estéril da suspensão bacteriana aplicando um fator de diluição de 10 vezes, até 10 elevado a menos cinco. Para cada suspensão bacteriana, prepare três réplicas de um conjunto de cinco tubos.Rotule os tubos com o fator de diluição e o número da replicata e preencha todos os tubos com 900 microlitros de solução de cloreto de sódio a 2%. Adicione 100 microlitros da suspensão bacteriana aos tubos correspondentes. Prossiga com a diluição em série, fazendo vortex a cada etapa.Plaque 10 microlitros das duas últimas diluições em placas de ágar soja triptona em segmentos correspondentes e, rapidamente, faça o gotejamento deslizar em um pequeno círculo girando a placa. Em seguida, incube as placas a 25 graus C por 48 horas. Após 48 horas, conte as colônias desenvolvidas nas placas de Petri.Placas contendo entre cinco e 50 colônias são ideais para uma contagem precisa. O número de bactérias viáveis por mililitro em cada solução de teste pode ser calculado, e a mortalidade pode ser avaliada e comparada com o controle. Para o cálculo das unidades formadoras de colônias por mililitro, multiplique a média de colônias obtida nas réplicas paralelas pelo fator de diluição conhecido N por 100.A mortalidade em porcentagem é obtida pela seguinte fórmula. Os resultados dos três testes independentes mostram aquela mortalidade dependente. A CL50, ou seja, a concentração letal que mata 50% das colônias bacterianas expostas ao tóxico, é calculada por meio de uma análise de regressão linear conhecida, modelo logito L, utilizando o Software Benchmark Dose.A CL50 dos três testes independentes destaca a viabilidade e a reprodutibilidade deste método. Em conclusão, descrevemos um método ecotoxicológico para avaliar a resposta biológica da bactéria marinha Vibrio anguillarum. Este microrganismo foi escolhido porque é halotolerante, ubíquo e representativo dos ecossistemas marinhos.O novo teste foi aplicado com sucesso para avaliar o efeito tóxico do sulfato de cobre, demonstrando uma relação clara de resposta dose-resposta. Este protocolo, quando comparado aos métodos existentes com outros micro-organismos, pode ser aplicado em uma faixa mais ampla de pH e salinidade, sem limitações para amostras. Assim, pode ser realizado também em amostras ambientais.Além disso, este bioensaio avalia a mortalidade em vez da inibição da taxa de crescimento ou da atividade enzimática. Isso facilita a comparação com outros testes de ecotoxicidade aguda para o ambiente marinho que têm a mortalidade como ponto final. O teste foi desenvolvido para avaliar a ecotoxicidade de contaminantes emergentes, como nanopartículas, e trabalhos sobre essa questão estão em andamento.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

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Fonte: Chen, Y., et al. Avaliando a Virulência e Patogênese da Infecção por Aeromonas em um Modelo de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra o Ensaio de Toxicidade Líquida de C. elegans com Aeromonas, um método usado para avaliar a virulência bacteriana medindo a sobrevivência de vermes em um ambiente líquido com poucos nutrientes. O ensaio revela patogenicidade específica da cepa com base na extensão do dano induzido por toxinas e na mortalidade em C. elegans.

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