Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo
11 de maio de 2017
Este manuscrito descreve uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente ovócitos de cavalo. Especificamente, o presente trabalho ilustra como recolher ovócitos de equídeos imaturos e maduros por captação de óvulos guiados por ultra-som (OPU) e como investigar a segregação cromossómica, a morfologia do fuso, a acetilação das histonas globais ea expressão de mRNA.
Os objetivos gerais desta abordagem experimental são, em primeiro lugar, caracterizar morfológica e bioquimicamente oócitos de cavalo e, em segundo lugar, comparar gametas do mesmo animal que foram processados in vitro ou in vivo. Esta abordagem experimental pode ajudar a responder a questões-chave na biologia e fertilidade de oócitos em espécies monovulatórias. Também pode melhorar a segurança dos procedimentos de manipulação de gametas.
Essa abordagem foi desenvolvida para superar a disponibilidade restrita de amostras de oócitos, especialmente de espécies monovulatórias. Demonstrando os procedimentos da OPU estarão o professor Stefan Deleuze, da Universidade de Liège, Cecile Douet, gerente do laboratório do meu laboratório, e Fabrice Reigner, gerente da unidade equina do INRA Centre Val de Loire. Diariamente, avalie o diâmetro dos folículos ovarianos em uma coorte de éguas adultas usando ultrassom.
Procure um folículo grande com diâmetro superior a 33 milímetros. Uma vez encontrado, prepare-se para injetar 1.500 unidades de gonadotrofina coriônica humana para induzir a maturação do oócito em um folículo dominante. Em seguida, localize o sulco jugular e limpe o local da injeção com álcool.
Então, para fazer a veia subir, aplique alguma força dois ou três centímetros abaixo do local da injeção. Insira a agulha quase paralela ao pescoço, aspire levemente para garantir que a agulha esteja na veia e injete o hormônio. Prepare uma sonda de ultrassom para acesso vaginal.
Em seguida, conecte a agulha a um sistema de sucção. 35 horas após a injeção de hCG, configure a instrumentação para OPU e sedative a égua. Uma boa analgesia é extremamente importante para a segurança do animal e do operador.
Um animal que não sente dor ou desconforto permitirá a manipulação do ovário, facilitando a realização de punções e rubores. Uma vez que a sonda da agulha é inserida, um operador deve manipular o ovário para ficar de frente para a sonda enquanto o outro operador manipula a agulha. Localize o folículo dominante na imagem ecográfica.
Em seguida, use a agulha para perfurar a parede vaginal e a parede do folículo dominante. Uma vez que o espaço folicular é acessado, aspire o fluido folicular. Gire a agulha para raspar a parede folicular e anexar o complexo cumulus-oócito.
Em seguida, despeje o fluido em uma placa de Petri grande. E sob um estereoscópio, procure o COC. Enquanto isso, lave o folículo com PBS modificado de Dulbecco quente contendo heparina.
Pode levar várias liberações para coletar o COC. Depois que o COC for encontrado, troque a agulha por uma agulha de duplo lúmen e colete os COCs imaturos de todos os folículos que têm entre cinco e 25 milímetros de diâmetro. Estes serão usados para maturação in vitro.
Depois que todos os folículos de um ovário forem aspirados, repita os mesmos procedimentos para coletar os COCs imaturos do outro ovário. Agora, escolha entre os COCs. Mantenha apenas COCs com várias camadas completas de células do cumulus e um ooplasma marrom finamente granulado.
Descarte os outros. No final do procedimento, injete na égua 15.000 unidades de benzilpenicilina para prevenir a infecção. Em seguida, aloje a égua em um estábulo silencioso e limpo por pelo menos duas horas enquanto ela se recupera.
Antes do início da OPU, aqueça uma garrafa de TCM-199 suplementado com tamponamento HEPES a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare o meio IVM. Dispense 500 microlitros de TCM-199 tamponado com bicarbonato de sódio suplementado nos poços de um prato de quatro poços.
Em seguida, incube o prato a 38,5 graus Celsius por pelo menos duas horas. Transfira os COCs imaturos recuperados para um prato de 3,5 centímetros cheio de dois mililitros do HEPES TCM-199 aquecido. Mova os COCs por diferentes regiões do prato para lavar suavemente os detritos ao redor.
Agora, transfira os COCs para o meio IVM e incube-os por 28 horas a 38,5 graus Celsius. Para realizar uma contagem cromossômica em COCs maduros, incube-os em monastrol 100 micromolares por uma hora a 38,5 graus Celsius. Em seguida, remova as células do cumulus tratando os COCs com 0,5% de hialuronidase em TCM-199 tamponado com HEPES.
Monitore essa reação em um palco aquecido ajustado para 38 graus Celsius. Em cerca de cinco minutos, remova todas as células. Use pipetagem suave para remover as últimas células teimosas.
Em seguida, remova a zona pelúcida usando 0,2% de pronase em TCM-199 tamponado com HEPES. Monitore essa reação em um estágio aquecido também. Deve levar cerca de cinco minutos para ser concluído.
Em seguida, fixe os oócitos em 4% de paraformaldeído em DPBS por 15 minutos a 38,5 graus Celsius, seguido por mais 45 minutos de fixação a quatro graus Celsius. Após a fixação, lave os oócitos transferindo-os sequencialmente entre três poços de álcool polivinílico a 0,1% em DPBS. Use cerca de meio mililitro de solução por poço.
Em seguida, transfira os oócitos para um poço cheio de 0,3% de Triton X-100 em PBS e deixe-os incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Para bloquear sinais inespecíficos, banhe as células em DPBS com 1% de BSA e 10% de soro de burro normal. Incube as células por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente.
Após 30 minutos, aplique o anticorpo primário e, em seguida, incube as células a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave os oócitos e aplique o anticorpo secundário por uma hora em temperatura ambiente, protegido da exposição à luz. Depois de aplicar o secundário, lave os oócitos novamente.
Em seguida, antes da montagem, prenda tiras de fita dupla-face nas lâminas para servir como suportes de lamínula. Agora, monte os oócitos três a quatro por lâmina em uma gota de meio de montagem antidesbotamento não endurecido suplementado com 20 micromolares de YO-PRO-1. Deixe os oócitos assentarem por cerca de 10 minutos e, em seguida, aplique as lamínulas.
Dos 32 COCs recuperados por OPU de folículos dominantes, 28 estavam em metáfase II. Usando a maturação in vitro, 37 dos 44 COCs coletados de folículos não dominantes foram amadurecidos até a metáfase II. Os oócitos maturados in vitro foram frequentemente afetados por aneuploidia, principalmente hiperploidia. Isso não foi observado nos oócitos amadurecidos in vivo.
Em seguida, o comprimento do fuso pólo a pólo e o diâmetro do fuso em seu máximo foram medidos. Os oócitos maturados in vitro foram significativamente mais longos e largos do que os oócitos maturados in vivo. Nas mesmas amostras, o nível de acetilação global de H4K16 foi medido.
Os resultados foram os esperados. A acetilação de H4K16 foi significativamente menor em oócitos amadurecidos in vitro do que em oócitos amadurecidos in vivo. Uma equipe bem treinada pode processar cinco éguas em uma manhã de OPU com uma taxa de recuperação de 80% para o oócito pré-ovulatório e 50 a 60% de recuperação dos oócitos imaturos.
Durante a OPU, sempre monitore a temperatura e o bem-estar do animal e esteja pronto para fornecer cuidados veterinários adequados, se necessário. A abordagem experimental também pode ser aplicada a oócitos de outras espécies e é especialmente aplicável quando a disponibilidade de amostras é um problema, como em humanos. Com base em nossos resultados, estudos devem ser realizados para entender melhor as condições de cultura necessárias para a segregação cromossômica adequada e alterações epigenéticas.
O objetivo geral é melhorar a eficiência da maturação in vitro tanto para a medicina veterinária quanto para o tratamento de fertilidade humana.
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Visão Geral
Este manuscrito apresenta uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente óvulos equinos. Descreve a coleta de óvulos equinos imaturos e maduros utilizando a captação ovular guiada por ultrassom (OPU) e examina a segregação cromossômica, a morfologia do fuso, a acetilação global de histonas e a expressão de mRNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do ovócito
- Fertilidade em espécies monovulatórias
- Procedimentos de manipulação de gametas
Antecedentes
- Compreender as características dos ovócitos é fundamental para a pesquisa em fertilidade.
- As espécies monovulatórias têm disponibilidade limitada de ovócitos.
- A OPU guiada por ultrassonografia pode aprimorar a coleta de amostras.
- A análise comparativa de gametas processados in vitro e in vivo é essencial.
Objetivo do Estudo
- Caracterizar morfológica e bioquimicamente os ovócitos equinos.
- Comparar gametas do mesmo animal processados em diferentes ambientes.
- Melhorar a segurança nos procedimentos de manipulação de gametas.
Métodos Utilizados
- Coleta de óvulos por punção folicular guiada por ultrassonografia (OPU).
- Avaliação do diâmetro folicular ovariano em éguas adultas.
- Investigação da segregação cromossômica e da morfologia do fuso.
- Análise da acetilação global de histonas e da expressão de mRNA.
Resultados Principais
- Coleta bem-sucedida de ovócitos imaturos e maduros de égua.
- Informações sobre a segregação cromossômica e a morfologia do fuso.
- Dados sobre os níveis globais de acetilação de histonas.
- Foram estabelecidos perfis de expressão de mRNAs relevantes.
Conclusões
- O estudo fornece uma estrutura para a caracterização de ovócitos em cavalos.
- Os achados podem aprimorar a compreensão da fertilidade em espécies monovulatórias.
- Técnicas de OPU podem melhorar a segurança na manipulação de gametas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Caracterizar a biologia do ovócito em espécies monovulatórias aborda um gargalo crítico no desenvolvimento e pesquisa reprodutiva, onde a disponibilidade limitada de amostras dificulta estudos mecanicistas. Esta abordagem permite a análise comparativa dos efeitos da maturação in vitro versus in vivo sobre a integridade cromossômica e a regulação epigenética, fornecendo insights preditivos para a otimização das condições de cultivo. Esses dados contribuem para a redução de riscos em tecnologias reprodutivas assistidas, identificando aneuploidias e defeitos no fuso acromático induzidos pelo cultivo antes da translação clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar mecanismos de fidelidade meiótica por meio da quantificação da incidência de aneuploidia como leitura funcional da competência na segregação cromossômica.
- Valor Científico: O perfil de acetilação de histonas (H4K16) associa o estado epigenético à morfologia do fuso, apoiando a validação de alvos nas vias HDAC/HAT durante a maturação do óvulo.
- Valor Operacional: Fornece uma estrutura citológica padronizada para avaliar parâmetros de qualidade do óvulo, aplicável a diversas espécies com acesso limitado a óvulos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: A morfometria quantitativa de cromossomos e fuso estabelece métricas objetivas e reprodutíveis para avaliar condições de cultivo de maturação.
- Valor Operacional: Protocolos de imunomarcação para tubulina e histonas acetiladas criam ensaios transferíveis para triagem de alto conteúdo de modificadores epigenéticos.
- Valor Científico: A análise de estabilidade de mRNA por qPCR sob silêncio transcricional fornece subsídios para a identificação de alvos regulatórios pós-transcricionais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: A comparação direta de oócitos maduros in vitro e in vivo provenientes do mesmo animal isola efeitos específicos do cultivo, aumentando a relevância translacional de modelos pré-clínicos.
- Valor Operacional: Estabelece parâmetros de referência para dimensões do fuso e limiares de acetilação na definição de estados fisiológicos de maturação em espécies com restrições monovulatórias.
- Valor Científico: Conjuntos de dados de modificações de histonas apoiam a descoberta de biomarcadores para predição da competência do oócito em processos de reprodução assistida.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se na fase de biologia de descoberta, na qual informações mecanicistas sobre a qualidade dos gametas orientam a validação de alvos upstream e o desenvolvimento de ensaios downstream para terapêuticas reprodutivas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a desregulação epigenética induzida por cultivo e seu impacto na fidelidade da segregação cromossômica.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas padronizadas (contagens cromossômicas, morfometria do fuso, níveis de acetilação) para avaliar os efeitos de compostos ou condições sobre a maturação de ovócitos.
- Análises: Gera saídas mensuráveis (taxas de aneuploidia, intensidade de H4K16, dimensões do fuso) que permitem comparações estatísticas entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a parâmetros in vivo, reduzindo o risco de extrapolação específica à espécie no desenvolvimento de modelos pré-clínicos de fertilidade.
- Reutilização Empresarial: Protocolos de OPU e fixação criam uma plataforma reutilizável de caracterização de ovócitos, aplicável a outras espécies monovulatórias que enfrentam escassez de amostras.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na segurança do protocolo de maturação por meio da ligação direta entre condições de cultivo e métricas de integridade epigenética e cromossômica.
- Valor Operacional: Fluxos de trabalho padronizados de coleta e processamento de ovócitos melhoram a reprodutibilidade entre laboratórios e espécies.
- Valor Estratégico: Detecção precoce de defeitos meióticos induzidos pelo cultivo reduz o risco de falha em estágios tardios no desenvolvimento de tecnologias reprodutivas assistidas.
- Impacto no Portfólio: Priorização baseada em dados das formulações de meio de maturação com base em limiares de aneuploidia e normalidade do fuso.
Considerações sobre a Implementação
- É necessária experiência no manuseio de ovócitos, micro-manipulação e microscopia de fluorescência para análise precisa de cromossomos e fuso.
- A microscopia confocal de varredura a laser e sistemas de platina aquecida são essenciais para a fixação e imagem com resolução temporal de estruturas meióticas.
- A padronização entre laboratórios da validação de anticorpos (tubulina, H4K16ac) e protocolos de montagem assegura resultados quantitativos comparáveis.
- O ajuste a diferentes espécies requer otimização dos limites de tamanho de folículos para OPU e da dosagem hormonal com base na fisiologia reprodutiva.
- As limitações incluem baixa produção de ovócitos por sessão e a impossibilidade de avaliar a atividade transcricional devido ao silenciamento global durante a maturação, deslocando o foco para a regulação pós-transcricional.
