Um método completo para avaliar o

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o comportamento in vivo de nanomedicamentos contra o câncer nos níveis sistêmico, tecidual, celular único e subcelular em camundongos imunocompetentes com tumor. Este método pode ajudar a responder a questão fundamental no campo da nanomedicina contra o câncer: como os nanomedicamentos se acumulam quantitativamente em diferentes tecidos de animais vivos ao longo do tempo?

A principal vantagem dessa técnica é que essa abordagem de dupla marcação permite a caracterização de nanomedicamentos in vivo desde o nível macroscópico até o microscópico. Escolhemos lipossomos como exemplo para demonstrar nosso procedimento porque os lipossomos estão atualmente em uso clínico e também são uma plataforma comum para nanomedicamentos experimentais. Para iniciar o procedimento, dissolva 20 miligramas de uma mistura lipídica, que inclui 0,1% em mols de um corante fluorescente catiônico lipofílico e dois mililitros de clorofórmio.

Em seguida, seque os lipídios com um evaporador rotativo. Adicione 20 mililitros de solução salina tamponada com fosfato aos lipídios secos. Sonique a mistura em gelo com um sonicator de sonda de 3,8 milímetros a 30 watts durante 30 minutos, mantendo a mistura entre 4 e 20 graus Celsius durante todo o processo.

Centrifugue a suspensão resultante de nanopartículas lipossomais a 4.000 G por 10 minutos. Descarte o pellet e lave os lipossomos com PBS, utilizando uma unidade de filtro centrífugo com limite de peso molecular de 100 kDa a 4.000 G. Transfira os lipossomos concentrados da câmara superior para um novo tubo de centrífuga. Os lipossomos podem ser armazenados em PBS na geladeira por até uma semana.

Realize a dispersão dinâmica da luz em uma mistura de 50 microlitros da suspensão de lipossomos purificados e 950 microlitros de PBS. Meça os tamanhos das partículas e determine a distribuição de tamanho. Para iniciar o procedimento de marcação radiativa, transfira para um tubo de 1,5 mililitro o volume necessário de lipossomos purificados e PBS, para obter dois miligramas de lipídios.

Adicione a isso um milicurie de oxalato de zircônio-89 para um volume final de 100 microlitros e um pH entre 6,9 e 7,1. Agite a mistura a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, remova o zircônio-89 livre por filtração centrífuga com uma unidade de filtro de 100 kilodaltons a 4.000 ×g. Lave o retentado com PBS estéril três vezes a 4.000 ×g. Em seguida, dilua o retentado para cerca de três microcuries por microlitro para injeção.

Utilize HPLC de exclusão por tamanho associada a um detector de radiação para determinar a pureza radioquímica dos lipossomos radiomarcados. Se a pureza radioquímica estiver abaixo de 95%, reformule a dose. Utilize espalhamento dinâmico de luz para confirmar que os valores de tamanho e distribuição das partículas são semelhantes aos dos lipossomos não radiomarcados.

Para iniciar o procedimento de imagem, injete cerca de 300 microcurie de lipossomos radiomarcados na veia da cauda de um camundongo com melanoma contido. Dois minutos após a injeção, utilize uma seringa de insulina com agulha de 28 graus para coletar de 10 a 20 microlitros de sangue da veia da cauda do camundongo. Transfira a amostra de sangue para um tubo de contagem previamente pesado.

Pese a amostra de sangue e meça a atividade com um contador gama. Calcule a concentração de radioatividade como porcentagem da dose injetada por grama. Quinze minutos após a injeção, colete e meça outra amostra de sangue da mesma maneira.

Em seguida, anestesie o camundongo mediante a administração de 2% de isoflurano e oxigênio por meio de um cone nasal. Colete e meça uma terceira amostra de sangue uma hora após a injeção. Em seguida, permita que o camundongo se recupere em uma gaiola de recuperação até que a mobilidade normal tenha sido restabelecida.

Colete amostras adicionais quatro, oito, 24 e 48 horas após a injeção. Permita que o camundongo se recupere completamente entre as injeções. Mantenha o camundongo em um ambiente designado para animais aos quais foram administrados materiais radioativos.

Após 24 ou 48 horas da injeção de lipossomos, anestesie o camundongo com 2% de isoflurano e oxigênio. Posicione o camundongo em decúbito ventral sobre a plataforma de um escâner microPET-CT para pequenos animais. Continue administrando 2% de isoflurano e oxigênio por meio de um cone nasal.

Aplicar pomada veterinária nos olhos do camundongo para evitar que sequem. Em seguida, mover a maca do scanner para dentro do instrumento. Realizar uma varredura estática de PET de corpo inteiro de 15 minutos com pelo menos 50 milhões de eventos coincidentes, com energia de 250 a 700 quiloeletronvolts e uma janela de tempo de coincidência de seis nanossegundos.

Em seguida, realize uma tomografia computadorizada de cinco minutos com 120 etapas rotacionais ao longo de 220 graus, com aproximadamente 145 milissegundos por quadro. Após a conclusão da varredura, sacrifique imediatamente o camundongo por asfixia com dióxido de carbono. Confirme a morte pinçando a pata do animal e, então, realize a dislocação cervical.

Perfunda os tecidos com PBS para remover o sangue e colete as amostras de tecido relevantes. Pese os tecidos coletados e meça sua atividade. Calcule a acumulação de lipossomos radiomarcados no tecido como porcentagem da dose injetada por grama.

Armazene o tecido tumoral em PBS frio. Realize citometria de fluxo ex vivo e imagem de imunofluorescência no tecido tumoral coletado para medir a acumulação em relação às populações celulares. A imagem PET/CT de camundongos com tumor injetados com nanopartículas marcadas com zircônio-89 mostrou acúmulo significativo de nanopartículas no tecido tumoral 24 horas após a injeção.

Determinou-se que a meia-vida sanguínea das nanopartículas era de aproximadamente 10 horas. As medidas de biodistribuição ex vivo realizadas 24 horas após a injeção foram consistentes com as medidas in vivo de PET/TC. Em seguida, a acumulação de nanopartículas foi investigada em nível de célula única por meio de técnicas de imunomarcação.

A citometria de fluxo indicou que as nanopartículas foram encontradas preferencialmente acumuladas em macrófagos auxiliados por tumor. A imagem de imunofluorescência de amostras tumorais também indicou o direcionamento específico das nanopartículas às células endoteliais. Esta técnica pode ajudar os pesquisadores a identificar nanomedicamentos promissores para a translação clínica.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três dias, se for executada corretamente. Ao radiomarcar nanomedicamentos, é importante aplicar altos padrões de controle de qualidade. Após este procedimento, outros nanomedicamentos, como nanoemulsões, nanopartículas poliméricas, micelas, anticorpos e fragmentos de anticorpos, podem ser marcados para medir seu desempenho in vivo em camundongos com tumor.