Name: Os métodos para a auto-integração da Megamolecular Biopolímeros na secagem ao ar-LC interface (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda a auto-integração induzida pela secagem de biopolímeros megamoleculares na interface ar-LC cristalino líquido. Este método permite visualizar dinâmicas de polissacarídeos, microtúbulos e DNA em escala milimétrica.

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Este trabalho foi apoiado por grant-in-aid para Jovens Cientistas (16K17956) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão, The Kyoto tecnociência Center, ea Fundação Mitani para a Investigação e Desenvolvimento.

1. Instrumentos <ol><li> dispositivo de polarização <ol><li> Para construir um dispositivo de polarização, proporcionar uma fonte de luz com uma lâmpada de halogéneo, um guia de luz, polarizadores, um estágio da amostra, um trilho óptico, haste está, e uma câmara digital de lente única reflexo (ver Figura 1C e Materiais Lista para a polarização peças do dispositivo). </li></ol></li></ol> 2. Preparação da Solução Biopolymer <ol><li> soluções de polissacarídeos <ol><li> Dissolver sacran 7 (0,5 g) em água pura (100 ml) por agitação a ~ 80 ° C durante mais de 12 h. Durante a dissolução, cobrir o recipiente com película de plástico para evitar a evaporação. Prepara-se uma solução aquosa de goma de xantano da mesma maneira. </li><li> Arrefecer as soluções a ~ 25 ° C para se obter soluções aquosas a 0,5% em peso. </li><li> Centrifugar a solução para remover impurezas sacran (48400 xg, 4 ° C, 1 h, 3 times). </li></ol></li><li> solução MT <ol><li> Prepara-se uma solução de tubulina de 0,5% em peso (1 ml) em um tampão de Britton-Robinson (80 mM de piperazina-N, N&#39;-bis (ácido 2-etanossulfónico) (PIPES), etileno glicol-bis (éter 1 mM β-aminoetil) - N, N, N &#39;N&#39; tetraacico (EGTA); e 5 mM de MgCl2, pH 6,8) em gelo 8. </li><li> Use solução tubulina 0,5% em peso (50 mL) e a guanosina-5&#39; - [(α, β) -methyleno] trifosfato (GpCpp) (5 mL) para preparar uma solução de tubulina GpCpp contendo (50 mL). Incubar a 37 ° C durante 3 h para se obter um núcleo estável MT. NOTA: O papel do GpCpp é apoiar a formação de MT e para suprimir completamente a despolimerização de MT para tubulina. </li><li> Misturar a solução de 0,5% em peso de tubulina (950 mL) e a solução tubulina GpCpp contendo (50 mL) a ~ 25 ° C durante um dia para se obter uma solução estável MT de 0,5% em peso. </li></ol></li><li> solução de ADN<ol><li> Prepara-se uma solução de ADN de 0,5% em peso (1 ml) em solução tampão de Tris-EDTA (Tris 10 mM, pH 8,0, com EDTA 1 mM). </li></ol></li><li> Manter as soluções de amostra biopolímero 0,5% em peso a 25 ° C durante a experiência de secagem. </li></ol> 3. Experiências de secagem e Observação sob luz Cross-polarizada <ol><li> Soluções em uma célula de um lado aberto (Figura 1A) <ol><li> Cortar uma folha de silício (ver Lista de Materiais) em uma forma apropriada com uma espessura de 1 mm (dimensão interna de 5-15 mm, de 1 mm, e ~ 20 mm; Figura 1A). <ol><li> Montar uma célula de um lado aberto composto por um espaçador de silício com dimensão interna de 5-15 mm, de 1 mm, e ~ 20 mm e duas lâminas de vidro não-modificada (76 mm × 1 mm × 26 mm). Fixar ambos os lados da célula com os grampos duplos com antecedência para manter a solução de amostra de vazar para fora. </li></ol></li><li> Lentamente adicionar cada da solução do biopolímero 0,5% em peso (100-300 uL) utilizando uma pipeta de 1 mm de tamanho de poro de ~te ponta para cada célula a ~ 25 ° C. Retirar as bolhas de ar a partir das culas utilizando uma agulha de seringa. </li><li> Colocar as células em um forno com um circulador de ar a 60 ° C sob pressão atmosférica durante a evaporação; a direcção evaporação é oposto ao da gravidade. </li></ol></li><li> Observações sob luz polarizada cruzada (Figura 1B-1C) <ol><li> Fornecer luz linear visível através de uma lâmpada de halogéneo de 100 W com uma fonte de luz de superfície plana sobre uma vasta área (80 mm x 80 mm). Ajustar os polarizadores para 45 ° e 135 °, utilizando os detentores (Figura 1C). </li><li> Fixar as posições da fonte de luz, polarizadores, estágio da amostra, e a câmara utilizando um trilho óptico e bancadas haste (Figura 1C). Coloque a fase de amostra entre os dois polarizadores (a distância entre os polarizadores deve ser ~ 5 centímetros). Coloque a câmara ~ 20 cm de altura a partir da fase da amostra para permitir focar. </li><li> Em determinados momentos, colocar as amostras a partir do passo 3.1.3 entre a polarizers na fase paralela ao plano xz e cobrir o dispositivo com uma cortina preta; o próprio dispositivo é mostrado na Figura 1C. </li><li> Fotografar as amostras através de polarizadores lineares cruzou usando uma câmera digital reflex de lente única com uma lente de zoom standard (ver Lista de Materiais). Controlar as configurações da câmera, como a distância focal, utilizando software de computador (ver Lista de Materiais). </li></ol></li><li> Análise espácio-temporal da intensidade da luz transmitida (Figura 1C) <ol><li> Para avaliar a mudança do parâmetro de orientação ordem no processo de secagem, recolha fotografias de hora em hora, durante 24 h. </li><li> Medir a intensidade da luz transmitida ao longo do eixo na direcção Z como um valor de cinzento, utilizando um programa de processamento de imagem (por exemplo, ImageJ). </li><li> Traçar um gráfico do valor de cinza como uma função da distância a partir do lado superior aberto. </li></ol></li><li> Observações microscópicas sob ligh polarizado-cruzt (Figura 1D) <ol><li> Para verificar os métodos, fazer observações microscópicas com um microscópio de polarização equipado com uma câmara CCD 9. Mantenha uma placa retardo de primeira ordem no caminho da luz. Controlar as condições para as fotos usando um software de PC. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Flemming, H. -C., Wingender, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20676145">The biofilm matrix.</a> Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOsada%2C+Y+%22Hydrogels+of+cytoskeletal+proteins%22">Hydrogels of cytoskeletal proteins</a>. , Springer. (2016).</li>
<li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440, 297-302 (2006).</li>
<li>Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milliscale+self-integration+of+megamolecule+biopolymers+on+a+drying+gas-aqueous+liquid+crystalline+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).</li>
<li>De Gennes, P. G., Prost, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Gennes%2C+PG+%22The+physics+of+liquid+crystals%22">The physics of liquid crystals</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).</li>
<li>De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Gennes%2C+PG+%22Capillarity+and+wetting+phenomena%3A+drops%2C+bubbles%2C+pearls%2C+waves%22">Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves</a>. , Springer. (2003).</li>
<li>Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma802829x">Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations.</a> Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).</li>
<li>Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/%E2%80%8Btb/c3tb21242d">Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin.</a> J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).</li>
<li>Olympus. Support BX51P. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/">http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/</a> (2016).</li>
<li>Matsuo, E. S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.455115">Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels.</a> J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).</li>
<li>Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/RA/C5RA18585H">Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules.</a> RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).</li>
<li>Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+control+of+diffusion+and+swelling+in+megamolecular+polysaccharide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels.</a> Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Às vezes era difícil para a câmara focar a amostra devido à intensidade de luz transmitida ser demasiado baixo. Nesses casos, colocar um filme plástico transparente estendida no palco ajudou a organizar o foco. A limitação da resolução observável era dependente da lente da câmara, ~ 10 um, neste caso. A limitação observável da espessura da amostra, Ay, era dependente da intensidade de luz máxima da lâmpada, ~ 10 mm neste caso. A vantagem do dispositivo mostrado na Figura 1B ...

Ao concentrar-se nas estruturas rígidas, em forma de bastonete de biopolímeros, materiais macios dinâmicas têm sido usados para várias aplicações, incluindo matrizes de polissacárido biofilme 1, &quot;geles&quot; activas compostas de proteínas do citoesqueleto 2, e &quot;origami de DNA&quot; de 3 formas desejadas. Para esclarecer as propriedades estruturais, muitas estratégias têm sido exploradas, como a microscopia eletrônica de transmissão, microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica e microscopia de fluorescência confocal. No entanto, porque esses métodos são em sua maioria realizados em um estado seco ou estática, é difícil de explicar os comportamentos dinâmicos em escalas macroscópicas, como visto em sistemas vivos reais. Recentemente, observou-se com êxito o comportamento dinâmico de biopolímeros na interface ar-aquoso LC através da luz polarizada 4. Durante a visualização da estrutura orientada durante a secagem do biopolimerosolução, as alterações temporais indicados auto-integração de biopolímeros na interface ar-LC instável. Aqui, descrevemos um protocolo para a secagem de soluções LC biopolímeros na interface ar-LC utilizando instrumentos polarizadas. Ao contrário de outras análises da fase LC que não consideram secagem 5, 6, a dinâmica de LC durante o processo de secagem foram investigados aqui, avaliando o parâmetro de orientação ordem na vista lateral da fase de fluido de uma célula de um lado aberto . A combinação da evaporação de células e o uso de instrumentos polarizados permitidos para monitorização macroscópico com uma direcção de evaporação controlada. Além disso, foi possível para validar os registos de secagem, concentrando-se nas estruturas cristalinas de microdomínios adsorvidas, que foram afectados pelo peso molecular, concentração, etc. Para demonstrar a eficácia do método, a pró secagemcessos de biopolímeros básicos com formas em vareta rígida tais como, polissacáridos, os microtúbulos (MTS), e ADN, foram investigados. Escolhemos estes biopolímeros porque eles são exemplos típicos de macromoléculas hierárquicos com pesos megamolecular, e as suas interacções intermoleculares lhes permitir formar estados de LC.

<table><tbody><tr><td>sacran</td><td>Green Science Materials Inc., Japão</td><td></td><td>De Aphanothece sacrum. Mw = 1,9 &times; 107 g mol-1</td></tr><tr><td>xanthan goma</td><td>Taiyo Kagaku Co., Japão</td><td>Neosoft XC</td><td>De Xanthomonas campestris. Mw = 4,7 &times; 106 g mol-1</td></tr><tr><td>tubulina</td><td>Citoesqueleto, Inc., EUA</td><td>T240</td><td>Do cérebro suíno.</td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience, Alemanha</td><td>NU405L</td><td></td></tr><tr><td>piperazina-N,N&prime; -bis(ácido 2-etanossulfônico)</td><td>Sigma-Aldrichi, Co. LLC.</td><td>P6757-500G</td><td>TUBOS</td></tr><tr><td>etilenoglicol-bis(&beta;-éter aminoetílico)-N,N,N',N'-tetraacético</td><td>ácido Dojindo Molecular Technologies, Inc.</td><td>342-01314</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>MgCl2-6H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>135-15055</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>162-21813</td><td>pellet</td></tr><tr><td>DNA</td><td>Sigma-Aldrich, Co. LLC.</td><td>D1626</td><td>De testes de salmão. Mw = 1,3 &vezes; 106 Da (~2.000 pb)</td></tr><tr><td>Solução tampão Tris-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Co. LLC.</td><td>T9285-100ML</td><td>10 mM Tris, pH 8,0, com vidro deslizante EDTA de 1 mM</td></tr><tr><td></td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd., Japão</td> Folha de borracha de silicone <td>S1111</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Asone Co.</td><td>6-611-32</td><td>Espessura:</td></tr><tr><td>centrífuga</td> de 1 mm <td>Beckman-Coulter, Inc., EUA</td><td>Avanti J-25</td><td>equipada com uma fonte de luz de rotor JA-20</td></tr><tr><td></td><td>Sumita Optical Glass, Inc., Japão</td><td>Guia de luz LS-LHA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sumita Optical Glass, Inc., Japão</td><td>GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)</td><td>80 mm e vezes;</td></tr><tr><td>lâmpada halógena</td> de 80 mm <td>Ushio Inc., Japão</td><td>JCR 15V150WBN</td><td></td></tr><tr><td>titular</td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Estágio de amostra KMH-80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Suporte de amostra TARW-25503L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Haste SHA-25RO</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Porta-postes ROU-12-40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Porta-postes RS-6-40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>RS-12-60</td><td></td></tr><tr><td>postes titular</td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>RS-12-80</td><td></td></tr><tr><td>postes titular</td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Portadora RS-12-130</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Suporte de câmera CAA-25LS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td>Trilho óptico médio <td>CMH-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>Tubo de lente OBA-500SH</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tomytech, tubo</td> de <td>lente BORG BK</td><td>80&phi;, L25 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>tubo de lente</td><td>Tomytech, tubo</td> de <td>lente BORG BK</td><td>80&phi;, L50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>multibanda Tomytech, BORG</td><td></td><td>80&phi; &nbsp;</td></tr><tr><td>Placa em V</td><td>Tomytech, BORG</td> Suporte de placa <td>em V 60S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Viexen, Co.,Ltd.</td><td>suporte para prato SX</td><td></td></tr><tr><td>EOS Kiss X7i&nbsp;</td><td>Canon Inc., Japão</td><td>8594B001</td><td>com uma lente zoom padrão,&nbsp; EFP 18-55 mm</td></tr><tr><td>software fotográfico</td><td>Canon Inc., Japão</td><td>EOS Utility</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Microsoft</td><td>Microscópio</td> de polarização de superfície <td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>placa de retardo de primeira ordem</td><td>Olympus</td><td>U-TP530</td><td>&lambda; = 530 nm</td></tr><tr><td>CCD câmera</td><td>Olympus</td><td>DP80</td><td></td></tr><tr><td>software fotográfico</td><td>Olympus</td><td>cellSens Programa</td> de processamento de imagem baseado em Java padrão <td></td></tr><tr><td></td><td>do National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr></tbody></table>

os métodos para a auto-integração da megamolecular biopolímeros na secagem ao ar-lc interface

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Os organismos vivos que usam a água está sempre propenso a secar no meio ambiente. As suas actividades são accionados por micro-com base de biopolímero e macro-estruturas, como pode ser visto nos casos de água em movimento em feixes vasculares e hidratação de água nas camadas da pele. Neste estudo, foi desenvolvido um método para avaliar o efeito das soluções aquosas líquidas cristalinas (LC) compostas de biopolímeros sobre secagem. Como biopolímeros de LC peso megamolecular, escolhemos estudar polissacarídeos, proteínas do citoesqueleto, e ADN. A observação de soluções de biopolímeros durante a secagem sob luz polarizada revela auto-integração milliscale começando a partir da interface ar-LC instável. A dinâmica das soluções aquosas de biopolímero LC pode ser monitorizada por evaporação de água a partir de uma célula de um lado aberto. Ao analisar as imagens tiradas usando a luz cross-polarizado, é possível reconhecer as mudanças espaço-temporais no parâmetro ordem de orientação. estemétodo pode ser útil para a caracterização de materiais artificiais, não só em vários campos, mas também tecidos vivos naturais. Nós acreditamos que ele irá fornecer um método de avaliação para materiais macios nas áreas biomédicas e ambientais.

<html> Utilizando o dispositivo, como mostrado na Figura 1, o auto-integração de microdomínio para macrodomain sobre uma secagem interface ar-LC foi avaliada (Figura 2A). Como a primeira demonstração da experiência de secagem, dois tipos de polissacáridos, megamolecular sacran (M w = 1,9 x 10 7 g mol-1) e goma de xantano (4,7 x 10 6 g mol-1), foram comparados. A Figura 2B mos...

Um método para a secagem induzida por auto-integração de biopolímeros megamolecular na interface ar-líquido cristalino é fornecida aqui. Esta metodologia será útil não só para a compreensão dos potenciais macroscópicas de biopolímeros, mas também como um método de avaliação para materiais macios em campos biomédicos e ambientais.

Os métodos para a auto-integração da Megamolecular Biopolímeros na secagem ao ar-LC interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar o efeito da interface entre o ar de secagem e o cristal líquido ou interface ar-LC na orientação de biopolímeros megamoleculares, como polissacarídeos, microtúbulos e DNA, conforme observado em comportamentos dinâmicos em escala milimétrica. Esta abordagem pode ajudar a responder questões fundamentais nas áreas de estrutura dispersiva, como a auto-organização de biopolímeros em ambientes de secagem, onde organismos vivos começaram a se deslocar em ambientes terrestres há aproximadamente 500 milhões de anos. A principal vantagem desta técnica é que ela permite obter vistas laterais da amostra durante o processo de secagem, sem que a secagem ocorra no plano horizontal.Para iniciar este procedimento, adicione 0,5 gramas de sacran a 100 mililitros de água. Cubra o recipiente com filme plástico e agite a solução a aproximadamente 80 graus Celsius por mais de 12 horas. Após deixar as soluções de sacran e goma xantana esfriarem, centrifugue a solução de sacran para remover impurezas.Agora, prepare uma solução de tubulina a 0,5 por cento em peso em tampão Britton-Robinson em gelo. Misture 50 microlitros da solução de tubulina com 5 microlitros d

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