Name: Cinética da Síntese da Fita Atrasada de DNA In Vitro pelas Proteínas de Replicação do Bacteriófago T7 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a examinar a cinética da síntese da fita atrasada de DNA usando proteínas de replicação do bacteriófago T7. Este método permite identificar etapas-chave na formação de fragmentos de Okazaki e na utilização de primers.

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Agradecemos aos membros do laboratório do C.C.R. pelos comentários e a S. Moskowitz pela preparação das figuras. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Grants F32GM101761 (AJH) e GM54397 (CCR).

NOTA: Siga todas as normas institucionais relativas à utilização segura e eliminação de material radioactivo, incluindo, mas não limitado a, o uso de equipamento de protecção individual, como luvas, óculos de segurança, jaleco, e escudos de acrílico adequados. NOTA: O tampão padrão consiste em 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, glutamato de potássio 50 mM, DTT 5 mM, EDTA 0,1 mM (tampão esta é pré-fabricados, a uma concentração 5x) e 0,3 mM de cada dNTP. Proteínas de replicação de T7 são purificados como descrito 8, 9, 10. ADN de cadeia simples contendo um único sítio de reconhecimento da primase de T7 (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;-GTGTC-3&#39;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) podem ser adquiridos a partir de uma variedade de companhias de síntese de ADN (o comprimento o ADNcs pode depender da enzima de escolha, para a primase de T7, um pentâmero é o comprimento mínimo do molde para sintetizar um iniciador de comprimento completo 11, como o críptico C é essencial, no entanto, se o iniciador está a ser estendido pela polimerase de, nucleótidos adicionais deve estar presente na extremidade 3 &#39;do molde. As reacções são iniciadas pela adição de uma concentração final de 10 mM de MgCl 2 e incubou-se a 25 ° C. a amostragem manual funciona bem para pontos de tempo de 5 segundos ou mais. Se pontos de tempo mais curto do que são necessárias, é recomendado o uso de um instrumento de fluxo rápido de retardamento para obter dados precisos. 1. Multiple-turnover Primer Síntese Reaction por amostragem manual <ol><li> Antes de iniciar a experiência, alíquota de 2 mL de tampão de corante de formamida (formamida a 93% (v / v) de formamida, 50 mM de EDTA, 0,01% de cianol de xileno e 0,01% de azul de bromofenol) em 8 tubos de polipropileno de 1,5 mL. Em geral, o número de tubos é igual ao número de pontos de tempo analisados. </li><li> Prepara-se uma mistura de 20 uL de tampão 1x que consiste, ATP 0,1 mM e CTP, 0,25 mCi / ml de [32 P α-] CTP, 0,1 uM SSDMolde de NA, e 0,1 uM GP4 (expresso como concentração hexâmero - 0,6 uM monómero). </li><li> Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Retirar 2 ul da mistura utilizando um pipetador e misturar com 2 ul de tampão de formamida de corante num tubo de 1,5 ml, preparado no passo 1.1 para o controlo sem reacção (tempo zero). </li><li> Adicionar 2 mL de 0,1 M MgCl2 a mistura reaccional (para uma concentração final de 10 mM). </li><li> retirar manualmente amostras de 2 mL da misturas reaccionais utilizando um pipetador em intervalos de 10s e misturar-se com corante de formamida predispensed em tubos de 1,5 ml, preparado no passo 1.1. </li><li> amostras de calor a 95 ° C durante 5 min num bloco de calor. </li><li> Carregar alíquotas das amostras num gel desnaturante. Os pequenos produtos de iniciadores tetraribonucleotide sintetizados pelo primase de T7 estão bem resolvidas num 0,4 mm de espessura de 25% de acrilamida: bisacrilamida (19: 1), ureia 3 M, 1 x TBE (Tris-borato de 100, 1 mM de EDTA). </li><li> Coloque toda gel em chromatograpapel phy e cubra com filme plástico. gel seco utilizando um secador de gel. </li><li> Prepara-se uma série de diluições do restante da mistura de reacção e detectar o mesmo volume carregados sobre o gel para papel de cromatografia, ou seja, Spot 4 uL da diluição se 4 ul de amostra foram carregados. NOTA: Este servirá como a curva padrão para determinar a concentração de produtos secundários formados durante a reacção. Por exemplo, diluições de cinco vezes, utilizando tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) funcionam bem, abrangendo uma gama de 1:25 a 1: 15625 (5 2 -5 6), mas as diluições devem ser ajustado, dependendo do nível de actividade. </li><li> Expor gel seco e padrão usando uma tela phosphorimager. Quantificar a radioactividade na série de diluição e construir uma curva padrão, tal como descrito 8, 12 NOTA: Inclusão de polimerase de ADN de T7 à mistura reaccional permite EXAmina o uso de iniciadores tetraribonucleotide por esta enzima. Optimamente, a concentração da polimerase deve ser saturando para simplificar a interpretação dos dados. A concentração da polimerase de 0,4 uM ou mais elevadas dá bons resultados. Além disso, o efeito de outras proteínas, tais como proteínas de ligação de cadeia simples de ADN, de cada iniciador de síntese ou em atraso de cadeia de iniciação pode ser examinado desta maneira. </li></ol> 2. Multiple-turnover Reaction Primer Síntese Usando um Instrumento Rapid-têmpera <ol><li> Preparação de misturas reaccionais <ol><li> Preparar 400 uL de solução A, contendo tampão 1x, 0,2 uM GP4 hexâmero, 0,2 uM molde de ADNcs, dNTP 0,6 mM, 0,2 mM de ATP e CTP (incluindo 0,5 mCi / ml de [32 P α-] CTP. </li><li> Prepare a 400 ul de solução B, contendo tampão 1x e MgCl2 20 mM. </li></ol></li><li> A operação do instrumento de fluxo rápido-têmpera <ol><li> Ligue rapinstrumento de fluxo id-têmpera; depois de aparecer o menu principal, digite 7 no teclado do instrumento para mover o motorista seringa para a posição inicial. </li><li> posição seringa aberta tampão para &quot;LOAD&quot;. </li></ol></li><li> Seringas Carregando tampão <ol><li> Anexar um tampão contendo 10 mL seringa à porta seringa unidade. Alterar posição do botão de seringa para &quot;LOAD&quot;. </li><li> Usando 10 mL seringas, encher tampão instrumento reservatório A e B com 10 mM de Tris, pH 7,5, EDTA 1 mM e encher a seringa C com solução de paragem (EDTA 250 mM, e SDS a 0,2%). Remover bolhas de ar empurrando êmbolos dentro e para fora. </li><li> posições Alterar botão para &quot;FOGO&quot;. Digite 2 para ajustar a posição da barra de motorista seringa. Pressione o botão &quot;AJUSTE PARA BAIXO&quot; botão para baixar a seringa até tampão sai do loop de saída: (7-desce continuamente; 8 grande passo para baixo; 9-pequeno passo para baixo). Tipo &quot;ESC&quot; para voltar ao menu principal. </li></ol></li><li> tubos de lavagem <ol><li> Attach linha de saída para vácuo. Alterar botões de amostra para &quot;FLUSH&quot;. Fechar tampão de seringa definindo as pegas para a posição horizontal. Ligue vácuo e mergulhar as alças 2 de descarga em H2O durante 10 s, em seguida, mergulhar em MeOH durante 10 s. lacetes secas por sugar o ar para ~ 15 s, ou até secar. </li></ol></li><li> de colocar as amostras <ol><li> Mudança amostra posição do botão de &quot;Load&quot;. Coloque a solução A à seringa de 1 mL. Ligue seringa em uma das portas de carga da amostra. Repita o procedimento para a solução B, e coloque no porto de carga amostra oposto. </li></ol></li><li> Recolha de pontos temporais <ol><li> No menu principal, digite 1 para execução de têmpera-flow. Digite o tempo de reação (s) e pressione &quot;ENTER&quot;. O número de loop reação a utilizar será exibida. Mudar para loop de reacção necessário. Repita o procedimento de lavagem no passo 2.2.4. </li><li> Vire botões de amostra para &quot;carregar&quot;. reação carga mistura em loops até pouco fora do compartimento de mistura central. Coloque todos os botões para &quot;FIRE &quot;. Confirmar que todos os botões estão na posição correcta. </li><li> Coloque 1,5 mL tubo na extremidade do circuito de saída. Pressione o botão &quot;GO&quot; para executar a reação. Repita o procedimento de lavagem no passo 2.2.4. Recarregar seringas tampão A e B, até que atingiu o motorista. </li><li> Repetir passos 2.2.6.2-2.2.6.3 para cada ponto de tempo desejado. Exceção: Não coloque solução contendo o reagente de partida (ou seja, MgCl 2, neste caso) quando apagar o controle de tempo de ponto-zero. </li><li> Quando terminar a recolha de amostras, digite &quot;ESC&quot; para voltar ao menu principal. Pressione o botão &quot;7&quot; para voltar motorista tampão seringa para sua posição inicial. </li></ol></li><li> Instrumento de limpeza <ol><li> Remover seringas mistura de reacção. Vire amostra de carga botão para &quot;LOAD&quot; posição. Sob vácuo, lavar cada circuito de amostra com 10 mL de NaOH 0,2 N, seguido de 10 ml de 0,3 NH 3 PO 4 e 10 mL de MeOH. </li><li> Vire botões de seringa para a posição &quot;LOAD&quot;. Pressione os 3 syringe êmbolos para recuperar de reacção e extingue-se tampões. Lavar seringas com 5 mL de H 2 O, pelo menos, duas vezes. </li><li> Preencha seringas novamente com 5 mL de H2O e vire botões para &quot;fogo&quot; posição. Mudar posições dos botões e ligue vácuo para remover H 2 O. Lavar como no passo 2.2.4. Desligue instrumento. Nota: Os produtos são analisados conforme descrito nas etapas 1.7-1.12. Além disso, a polimerase de ADN de T7 e outras proteínas de replicação pode ser adicionado na mistura de reacção para analisar o seu efeito sobre a síntese de iniciador ou de extensão. </li></ol></li></ol> 3.-turnover Individual Primer Síntese Reaction NOTA: Os ensaios de iniciador de síntese / extensão-turnover único são levadas a cabo de modo semelhante às reacções de múltiplas volume de negócios, com algumas diferenças importantes: estes ensaios segue a conversão de ATP marcado radioactivamente no iniciador ou de extensão de produtos, no entanto, a concentração de substratos e proteínas são considerăBly superior. Além disso, a fim de atingir a resolução de milisegundos para permitir a análise da reacção de síntese de iniciadores, deve-se utilizar uma máquina de fluxo rápido-têmpera. <ol><li> Preparação das misturas de reacção. <ol><li> Preparar 400 uL de solução A, contendo tampão 1x, 3 uM hexâmero GP4, 6 uM molde de ADNcs, dNTPs 0,6 mM, CTP a 1 mM, e 2 nM de [γ- 32 P] ATP. Prepare a 400 ul de solução B, contendo tampão 1x e MgCl2 20 mM. </li></ol></li><li> Operação de fluxo Rapid-têmpera <ol><li> Realizar reacções tal como descrito na etapa 2.2. Se desejado, adicionar ADN-polimerase T7 ou a proteína de ligação-ADN de cadeia simples de T7 a uma concentração de 15 uM e 20 uM, respectivamente. Neste caso, os produtos de extensão acumulam num regime de tempo que permite a amostragem manual da reacção. </li></ol></li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> curvas de progresso do produto Fit para menos- não-linearquadrados modelos usando software disponível comercialmente capazes de mínimos quadrados ajustes e / ou integração numérica. Os detalhes da operação irá variar de acordo com o software utilizado, mas abaixo são formas generalizadas de equações utilizadas para ajustamento dos dados. </li><li> Determinar a velocidade de formação de produto de múltiplas reacções de síntese de rotatividade iniciador ajustando a curva de progresso de uma equação linear. Se houver curvatura significativa, utilizar o método da taxa inicial 13, 14, através do ajuste dos dados a uma função exponencial simples: y = A (e - k t), onde y é a concentração de produto, A é a amplitude de reacção, k é a constante de velocidade observada, t é o tempo, em segundos. A inclinação da linha tangente em tempo = 0 é a velocidade inicial. NOTA: reações de síntese de primer estado Fit pré-constante para uma equação linear ou para a equação de estado pré-estacionário estouro y = A (e - bu krst t) + taxa ss t, em que A é a amplitude da reacção, k ruptura é a constante de velocidade observada para a explosão estado pré-estável, SS taxa é o estado estacionário ss Velocidade = k cat [Enzima]), t é o tempo , em segundos. Fit reações de síntese primer volume de negócios única curva de progresso para uma única função exponencial y = A (e - k t). No caso de GP4, ajustar os dados por integração numérica 15, para um modelo com três passos de condensação de NTP, em que cada intermédia está em equilíbrio com a enzima, utilizando software disponível comercialmente. </li></ol>

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<li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O factor mais importante na realização destas experiências é a disponibilidade da enzima purificada altamente activa. Durante o nosso trabalho com GP4, por exemplo, verificou-se que o armazenamento da enzima purificada em tampão (fosfato de potássio 20 mM, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) contendo 50% de glicerol a -20 ° C, leva a uma redução a actividade específica da preparação ao longo de alguns meses. Portanto, agora flash-freeze pequenas alíquotas de GP4 purificada em Tris-HCl a 25, pH 7,5, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, T...

A replicação de ADN é uma característica conservada de toda a vida celular. Enquanto a identidade e número de componentes de replicação variam amplamente, os mecanismos gerais são compartilhadas entre a evolução 1. Aqui, descrevemos, experimentos cinéticos descontínuos à base de gel, utilizando substratos radioativos, visando a compreensão da cinética de síntese de DNA atraso vertente in vitro por componentes do replisome T7. A maquinaria de replicação do bacteriófago T7 é muito simples, consistindo em apenas quatro proteínas (a polimerase de ADN, GP5, e o seu factor de processabilidade, tioredoxina de E. coli, os GP4 primase-helicase bifuncionais, e a proteína de ligação ao ADN de cadeia simples, GP2. 5) 2. Esta característica torna-se um sistema de modelo atractivo para estudar os mecanismos bioquímicos conservadas envolvidas na replicação do ADN. Especial ênfase é colocada sobre a formação de primers ribonucleï¿½ido por DNA T7 primase, uma critical passo na iniciação de síntese de ADN. Além disso, pode-se também analisar a utilização desses iniciadores por ADN-polimerase de T7 ou outras proteínas de replicação através da sua inclusão na mistura de reacção. A primase de T7-helicase, GP4, catalisa a formação de iniciadores para a síntese de DNA em sequências de ADN específicos chamados locais de reconhecimento, ou primase PRS, (5&#39;-TCG-3 &#39;). A citosina no PRS é enigmática, é essencial para o reconhecimento do local, mas não é copiado para o produto 3. O primeiro passo na síntese do iniciador por GP4 envolve a formação do dinucleótido pppAC, que é então estendida a um trímero, e, eventualmente, a iniciadores tetranucleotídeo funcionais pppACCC, pppACCA, ou pppACAC dependendo da sequência no molde 4. Estes iniciadores podem então ser utilizados por ADN-polimerase de T7 para iniciar a síntese de ADN, que é também um processo assistido por GP4 5, 6. A este respeito, o primasedomínio estabiliza os tetraribonucleotides extremamente curtos com o modelo, impedindo a sua dissociação, envolve polimerase ADN de uma forma conducente a garantir o primer / modelo no sítio ativo 7 polimerase. Estes passos (a síntese de ARN do iniciador, a polimerase de handoff iniciador, e extensão) são repetidos em ciclos múltiplos de replicar a costa de retardamento e tem de ser coordenado com a replicação da costa principal. Os ensaios descritos aqui são altamente sensíveis e podem ser executadas num período de tempo moderado. No entanto, eles são relativamente de baixo rendimento e um grande cuidado deve ser exercido no uso e descarte de materiais radioativos. Dependendo da velocidade à qual a reacção prossegue, pode-se empregar um instrumento de têmpera rápida para atingir as amostras em escalas de tempo favorável para análise significativa de cursos de tempo da reacção, quer em contínuo ou no estado pré-estável. Recentemente, usamos ensaios descritos aqui para fornecer evidence a importância da introdução do iniciador a partir do domínio de primase de GP4 na iniciação de fragmentos de Okazaki. Além disso, encontramos evidências de um papel regulador para a proteína, gp2.5 ligação do T7 DNA de cadeia simples, na promoção da formação de primer eficiente e utilização 8.

<table><tbody><tr><td>Cristais pré-definidos Tris pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>Sal de potássio L-Glutâmico monohidratado</td><td>SIGMA</td><td>G1501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr> <tr><td>(Etilenodinititrilo) Ácido tetraacético, sal dissódico, di-hidratado</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr> <tr><td>[&alpha; -32P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioativo, tome medidas de proteção</td></tr><tr><td>[&gamma;-32P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioativo, tome medidas de proteção</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>quatro dNTPs parte do conjunto</td></tr><tr><td>100 mM ATP e CTP</td><td>Epicentro</td><td>RN02825</td><td>parte do conjunto NTP</td></tr><tr><td>construções ssDNA Tecnologias</td><td>Integradas de DNA</td><td>N/A</td><td>sequências personalizadas&nbsp;</td></tr><tr><td>metanol&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamida</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td>SIGMA</td><td>B8026&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cylene xyanol&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrilamida</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>N,N&prime; -Metilenobisacrilamida</td><td>SIGMA</td><td>M7279&nbsp;</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de Fluxo de Têmpera Rápida&nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Explorador Kintek</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Caleidógrafo&nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

cinética da síntese de adn de cadeia simples de retardamento<em&gt; in vitro</em&gt; pelos bacteriophage t7 replicação proteínas

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Aqui fornecemos protocolos para o exame cinético da síntese de DNA de fita atrasada in vitro pelas proteínas de replicação do bacteriófago T7. O replissoma T7 é um dos sistemas de replicação mais simples conhecidos, composto por apenas quatro proteínas, o que é uma característica atraente para experimentos bioquímicos. Ênfase especial é colocada na síntese de primers de ribonucleotídeos pela imase-helicase T7, que são usados pela DNA polimerase para iniciar a síntese de DNA. Como os mecanismos de replicação do DNA são conservados ao longo da evolução, esses protocolos devem ser aplicáveis, ou úteis como um trampolim conceitual, para investigadores que usam outros sistemas modelo. Os protocolos descritos aqui são altamente sensíveis e um investigador experiente pode realizar esses experimentos e obter dados para análise em cerca de um dia. O único equipamento especializado necessário é um instrumento de fluxo de têmpera rápida, mas esse equipamento é relativamente comum e está disponível em várias fontes comerciais. As principais desvantagens desses ensaios, no entanto, incluem o uso de radioatividade e o rendimento relativamente baixo.

Os resultados mostrados na Figura 1A foram obtidos como descrito no passo 1 do protocolo, isto é, por amostragem manualmente uma reacção de síntese de primer catalisada por GP4 sob condições de turnover múltiplo. Aqui, uma gama de produtos, após electroforese em gel pode ser observado usando CTP marcado com 32 P na posição-α em reacções de síntese do iniciador (Figura 1A). O precursor marcado, CTP, mostra a maior mobi...

Descrevemos ensaios descontínuos sensíveis baseados em gel para examinar a cinética de iniciação da fita atrasada usando as proteínas de replicação do bacteriófago T7.

Cinética da síntese de ADN de cadeia simples de retardamento<em&gt; In Vitro</em&gt; Pelos Bacteriophage T7 replicação Proteínas

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

O objetivo geral deste procedimento é examinar a cinética da síntese do primer e da fita descontínua de DNA. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da replicação do DNA, como a formação de primers pela primase do DNA, sua transferência e utilização pela DNA polimerase. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a identificação de etapas-chave durante a síntese dos fragmentos de Okazaki.Como materiais radioativos são utilizados neste experimento, todas as regulamentações institucionais relativas ao uso seguro e descarte de materiais radioativos devem ser seguidas. Comece distribuindo dois microlitros de tampão corante de formamida em oito tubos de polipropileno de 1,5 mililitro, correspondentes ao número de pontos de tempo a serem analisados. Em seguida, prepare uma mistura de 20 microlitros contendo tampão, ATP, CTP, CTP marcado no grupo alfa-fosfato com P32, molde de DNA de fita simples e a proteína gene quatro, ou primase helicase GP quatro.Incube a mistura à temperatura ambiente por cinco minutos. Após cinco minutos, use uma pipeta para remover dois microlitros da mistura e misture-os com dois microlitros de tampão corante com formamida em um dos tubos de 1,5 mililitro preparados anteriormente. Este é o controle sem reação.Adicione dois microlitros de cloreto de magnésio 0,1 molar à mistura de reação e inicie imediatamente um cronômetro. Em intervalos de 10 segundos, retire manualmente amostras de dois microlitros da mistura de reação e misture com o corante em formamida nos tubos de 1,5 mililitro. Após a coleta de todos os pontos de tempo, aqueça as amostras em um bloco térmico a 95 graus Celsius por cinco minutos.Carregue alíquotas das amostras em um gel desnaturante para eletroforese. Inicie este procedimento preparando as misturas de reação. Prepare 400 microlitros da solução A contendo tampão, hexâmero GP quatro, molde de DNA de fita simples, dNTPs, ATP, CTP e CTP marcado no grupo alfa-fosfato com P32.Prepare 400 microlitros da solução B, contendo um tampão X e 20 milimolares de cloreto de magnésio. Em seguida, configure o instrumento de fluxo com quench rápido. Ligue o instrumento e, após aparecer o menu principal, digite sete no teclado do instrumento para mover o driver da seringa para a posição inicial.Abra a posição da seringa de buffer para carregar. Encha a seringa C com a solução de quench, depois, utilizando uma seringa de 10 mililitros, encha os reservatórios de buffer do instrumento A e B com buffer. Remova as bolhas de ar empurrando os êmbolos para dentro e para fora.Altere as posições dos botões para disparar. Digite dois para ajustar a posição da barra do driver da seringa. Pressione o botão de ajuste para baixo para abaixar a seringa até que o tampão saia pelo loop de saída.Pressione escape para retornar ao menu principal. Para lavar a tubulação, conecte a linha de saída a uma bomba de vácuo. Gire os botões da amostra para enxaguar.Posicione os botões na posição horizontal para fechar a seringa de tampão. Ligue o vácuo, mergulhe os dois laços de lavagem na água por 10 segundos e, em seguida, mergulhe no metanol por 10 segundos. Seque os laços aspirando ar por cerca de 15 segundos, ou até ficarem secos.Para carregar as amostras, altere a posição do botão de amostra para "carga". Coloque a solução A em uma seringa de um mililitro, conecte a seringa em uma das portas de carga de amostra e, da mesma forma, coloque a solução B na porta de carga de amostra oposta. Inicie a coleta dos pontos de tempo digitando um no menu principal para um experimento de fluxo interrompido.Digite o tempo de reação e pressione enter. O número do ciclo de reação a ser usado será exibido. Alterne para o ciclo de reação necessário.Após lavar o tubo conforme demonstrado anteriormente, gire os botões de amostra para carregar. Carregue as misturas de reação nos loops de amostra até logo antes do compartimento central de mistura. Gire todos os botões para disparar e confirme que todos os botões estão na posição correta.Coloque um tubo de 1,5 mililitro na extremidade do loop de saída. Pressione iniciar para executar a reação. Após repetir o procedimento de lavagem do tubo, recarregue as seringas de buffer A e B até que atinjam o driver das seringas de buffer.Repita os passos para realizar a reação em cada ponto de tempo desejado, com uma exceção: não carregue a solução B ao interromper o controle do ponto de tempo zero. Quando a coleta das amostras for concluída, pressione escape para retornar ao menu principal. Pressione sete para retornar o driver da seringa de tampão à sua posição inicial.Inicie a limpeza do instrumento removendo as seringas da mistura reacional e gire o botão de carregamento da amostra para a posição de carga. Sob vácuo, lave cada loop de amostra com 10 mililitros de hidróxido de sódio, ácido fosfórico e metanol, respectivamente. Pressione os êmbolos das três seringas para recolher os tampões de reação e de quenching.Lave as seringas com cinco mililitros de água pelo menos duas vezes. Encha novamente as seringas com cinco mililitros de água, gire os botões para a posição de fogo, ligue o vácuo e abaixe o pistão por meio do comando do teclado para remover a água. Lave os tubos conforme demonstrado anteriormente.Por fim, desligue o instrumento de fluxo com parada rápida. As amostras são posteriormente analisadas conforme descrito no protocolo textual. Esses resultados foram obtidos por meio de coleta manual de amostras de uma reação de síntese de primer catalisada pela GP quatro em condições de múltiplas voltas.O precursor marcado CTP apresenta a maior mobilidade e migra em direção ao fundo do gel, seguido por espécies que migram mais lentamente, correspondentes ao corante e aos tetrarribonucleotídeos sintetizados pela GP quatro. Dependendo do tempo de incubação e do contexto da sequência do molde, podem ser observados produtos marcados adicionais correspondentes a oligômeros maiores. Quando um instrumento de parada rápida é utilizado para examinar a reação catalisada pela GP quatro em escalas de tempo na faixa de segundos até alguns milissegundos, é evidente que o acúmulo do iniciador não é linear, mas exibe um perfil bifásico indicado pela linha sólida.Isso sugere que a formação do produto é rápida e que a liberação é a etapa limitante no estado estacionário. A linha tracejada representa uma curva de progresso hipotética que resultaria se a formação do primer pela GP quatro não ocorresse com uma explosão pré-estacionária. Um experimento de síntese de primer em único ciclo fornece informações sobre a formação e o decaimento de espécies intermediárias durante a conversão de substrato em produto.Uma sequência temporal da formação de tetrâmeros é mostrada pela imagem do gel. O gráfico mostra a formação de intermediários versus o tempo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 90 minutos, se for executada corretamente.Não se esqueça de que trabalhar com reagentes radioativos pode ser extremamente perigoso e precauções, como blindagem adequada, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

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Genetics

Genética

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