A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

O objetivo geral deste procedimento é isolar com sucesso hepatócitos murinos funcionais para estudar a expressão e secreção de citocinas inflamatórias, como PCR e IL6, em resposta a mediadores da resposta hepática de fase aguda. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a função hepatocelular e a contribuição das citocinas hepáticas para um ambiente inflamatório prolongado, como o encontrado na doença renal crônica. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma ferramenta robusta para uma análise simples, rápida e reprodutível de metabolômica hepática e inflamação, bem como da resposta a fármacos.

Para começar, aqueça previamente o meio de perfusão hepática e o meio de digestão hepática em banho-maria a 37 graus Celsius. Monte uma bomba de perfusão conforme mostrado aqui. Em seguida, use o meio de perfusão hepática para preencher cuidadosamente o sistema de tubos da bomba.

Tente evitar bolhas de ar no sistema. Prepare o microscópio estereotáxico para o procedimento de perfusão. Em seguida, após anestesiar um camundongo doador de acordo com o protocolo descrito, posicione o animal anestesiado sobre uma almofada absorvente.

Use fita adesiva para fixar as extremidades do camundongo. Em seguida, depile e desinfete o abdômen do camundongo. Depois, use tesoura cirúrgica com pontas afiadas e rombas para realizar uma laparotomia ventral, indo do púbis até a borda cranial do fígado.

Faça incisões na parede abdominal em ambos os lados em uma posição caudal ao diafragma. Exponha a veia cava inferior ou VCI movendo cuidadosamente o intestino para o lado direito usando cotonetes estéreis. Com tesoura cirúrgica fina e pontas bem afiadas, faça incisões laterais através do diafragma supra-hepático e abra a cavidade torácica.

Em seguida, utilize seda cirúrgica 5-0 para ligar a veia cava inferior torácica. Com um cateter intravenoso com proteção, canule a veia cava inferior infrarrenal. Conecte a bomba de perfusão e inicie a perfusão do fígado.

Se realizado corretamente, o fígado deve começar imediatamente a clarear e inchar. Em seguida, com tesoura cirúrgica fina, seccionar a veia porta, permitindo drenagem adequada do sangue e do meio de perfusão. Após perfundir o fígado com aproximadamente 30 mililitros de meio de perfusão de fígado, interromper a bomba de perfusão.

Altere para o meio digestivo para fígado e reinicie a bomba. Após a perfusão ser concluída, remova a cânula. Exponha suavemente a região central do fígado e localize o tecido conjuntivo que liga os lobos hepáticos.

Segure as fibras centrais de conexão e dissecar cuidadosamente todos os tecidos que fixam o fígado em sua posição. Em seguida, remova suavemente o fígado. Transfira imediatamente o órgão para um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros contendo 15 mililitros de meio digestivo para fígado.

Enquanto trabalha sob uma capela de cultura celular, transfira o fígado do tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros para uma placa de cultura tecidual estéril. Com pinças estéreis, rasgue suavemente os quatro lobos do fígado. Se realizado corretamente, o meio de digestão deverá ficar turvo devido ao isolamento de hepatócitos do fígado.

Usando uma ponteira estéril de pipeta de 25 mililitros, filtre o meio de digestão turvo através de um filtro celular de náilon de 70 micrômetros para um novo tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros para remover partículas de tecido não digerido e debris celular. Centrifugue o filtrado combinado a 50 vezes g a quatro graus Celsius por dois minutos, depois aspire o sobrenadante contendo excesso de debris celular e use 25 mililitros de Meio E de William 1X frio para ressuspender suavemente as células. Após repetir a filtração e a lavagem dos hepatócitos três vezes, aspire o sobrenadante para remover o excesso de debris celular.

Resuspenda as células em 25 mililitros de meio E de William's 1X aquecido, contendo suplementos para descongelação e semeadura de hepatócitos primários, e filtre a suspensão através de um novo filtro celular de nylon de 70 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros. Após a contagem das células, semeie-as em dois mililitros de meio E de William's contendo suplementos para descongelação e semeadura de hepatócitos primários, em um conjunto celular de seis poços revestido com colágeno. Após duas trocas de meio para privar progressivamente as células de nutrientes, trate as células com PBS como veículo, 25 nanogramas por mililitro de FGF23, 100 microgramas por mililitro de LPS ou 50 nanogramas por mililitro de IL6 em meio sem soro.

Incube as culturas por 24 horas. Após preparar o RNA utilizando um kit com coluna de centrifugação de acordo com as instruções do fabricante, adicione 200 nanogramas do RNA isolado a um tubo de PCR. Em seguida, adicione 14 microlitros de água livre de endonuclease e quatro microlitros de transcriptase reversa ao tubo.

Coloque o tubo de PCR no termociclador e execute o seguinte programa de transcrição reversa para gerar cDNA. Para realizar PCR quantitativa, combine os seguintes componentes da mistura mestra de QPCR em um tubo sobre gelo. Vortexe a mistura mestra.

Em seguida, alíquota nove microlitros da solução em cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione cuidadosamente um microlitro de cDNA em cada poço, preparando três poços para cada amostra. Por fim, execute as amostras em um aparelho de PCR em tempo real e analise os dados de acordo com o protocolo descrito no texto.

Uma imagem representativa de microscopia de luz de células primárias isoladas e cultivadas é mostrada aqui. A análise imunocitoquímica demonstra que os hepatócitos isolados expressam fortemente albúmina, bem como o receptor 4 de fator de crescimento de fibroblastos. Neste experimento, hepatócitos primários isolados foram tratados com FGF23, LPS ou IL6 por 24 horas e os níveis de mRNA de CRP e IL6 foram analisados por PCR quantitativa em tempo real.

LPS, IL6 e FGF23 aumentaram significativamente a expressão de PCR e IL6. Como mostrado aqui, os sobrenadantes de cultivo celular de hepatócitos primários isolados foram analisados por ELISA para determinar os níveis de PCR. Conforme demonstrado na análise por QPCR, os tratamentos com LPS, IL6 e FGF23 aumentaram significativamente os níveis de PCR nos sobrenadantes celulares em comparação com as células tratadas com PBS.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em apenas algumas horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter um ambiente estéril. Devido ao trabalho com cultivo primário, minimizar o risco de contaminação possível é o mais importante para obter resultados ideais.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar com sucesso hepatócitos de camundongos para estudar diversas funções hepatocelulares, como a expressão e a secreção de citocinas hepáticas.