Name: A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a isolar hepatócitos primários de camundongos para estudar respostas inflamatórias hepáticas. Este método enzimático permite quantificar citocinas como CRP e IL6 por ELISA e PCR em tempo real.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH (R01HL128714 para CF) e (F31DK10236101 para KS) e da American Heart Association (CF e AG).

Todos os protocolos de animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Miami Miller School of Medicine. 1. Preparação <ol><li> Pré-aqueça meios de perfusão hepática e fígado digerir mídia em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Configurar uma bomba de perfusão (30 mL / min). Cuidadosamente prefill o sistema de tubulação da bomba com a mídia perfusão hepática. Evitar as bolhas de ar no sistema e preparar o microscópio estereotáxica. </li><li> placas de cultura de células de revestimento usando colágeno tipo I, de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> 2. A recuperação do fígado <ol><li> Anestesiar o rato doador uso de oxigênio / inalação de isoflurano (isoflurano 4% / 2 L / min de oxigênio). <ol><li> Manter a anestesia de isoflurano, diminuindo a 2-2,5% ou por injecção de cetamina (100 mg / kg de peso corporal por via intraperitoneal) e xilazina (10 mg / kg de peso corporal intraperitoneally). anestesia isoflurano contínua é preferido, uma vez cetamina diminui a pressão sanguínea e pode causar hepatotoxicidade. </li></ol></li><li> Coloque o rato anestesiado numa almofada absorvente. Fix extremidades do rato com fita adesiva. </li><li> Raspar e desinfectar o abdome do mouse e realizar uma laparotomia ventral do púbis até a fronteira cranial do fígado usando uma tesoura cirúrgica com pontas afiadas / contundentes. Faça uma incisão na parede abdominal para ambos os lados, caudal do diafragma. </li><li> Expor a veia cava inferior (IVC), movendo cuidadosamente o intestino para o lado direito. Dissecar cuidadosamente tecido adiposo em torno do IVC usando cotonetes de ponta de algodão estéreis e uma pinça de ponta em ângulo. </li><li> Faça uma incisão na membrana suprahepática e abrir a cavidade torácica por duas incisões laterais usando finas tesouras cirúrgicas com pontas afiadas / afiadas. Ligadura da VCI torácica usando seda cirúrgica (5/0). </li><li> Canular da VCI infra usando um cateter iv blindado, retire cuidadosamente a agulha,ligar a bomba de perfusão e começar a perfusão do fígado. Se realizada corretamente, o fígado deve começar imediatamente a branquear e swell. </li><li> Transecto da veia porta permitindo a drenagem adequada dos meios de comunicação de sangue e de perfusão usando finas tesouras cirúrgicas. </li><li> Perfundir fígado, com aproximadamente 30 ml de fígado meios de perfusão, e depois mudar para o fígado digerir media (30 mL). Desligue a bomba de perfusão e retire a cânula, uma vez perfusão for concluída. </li><li> Com cuidado, expor a região central do fígado e localizar o tecido de ligação que liga os lobos hepáticos. Agarrar as fibras de conexão central e dissecar cuidadosamente todos os tecidos que prendem o fígado no lugar e retire cuidadosamente o fígado. </li><li> Imediatamente transferir o fígado para um tubo cónico de polipropileno de 50 ml contendo 15 ml de meios de fígado digerir. NOTA: Não há nenhuma linha de tempo específico para esta etapa. Após a perfusão, o fígado continua em media Digest para o transporte de uma capa de cultura de células estéril. tudo éubsequent passos devem ser realizados num ambiente estéril. </li></ol> 3. Isolamento e tratamento de células <ol><li> Num capuz de cultura de células, transferir o fígado a partir do tubo de polipropileno de 50 mL cónico contendo meio de digestão em uma placa de cultura de tecido estéril. </li><li> Utilizando fórceps estéreis, gentilmente rasgar as quatro lóbulos do fígado. Se realizada corretamente, médio digestão deve tornar-se turva devido ao isolamento de hepatócitos do fígado. </li><li> Utilizando um ponta de pipeta 25 mL estéril, filtrar o meio de digestão turva através de um coador de células de nylon de 70? M para um novo tubo cónico de polipropileno de 50 ml para remover as partículas de tecido não digerido e os detritos celulares. </li><li> Repita os passos 3.2 e 3.3 com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Isto auxilia na remoção de quaisquer residuais hepatócitos do fígado. </li><li> Centrifugar a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante contendo excesso de detritos celulares e as células suavemente em 25 mL de 1x frio re-suspenderWilliams &#39;Medium E. </li><li> Utilizando um ponta de pipeta 25 mL estéril, filtrar a re-suspensão através de um novo filtro de células de nylon de 70? M para um tubo de 50 mL de polipropileno cónico para alcançar uma suspensão mais limpo. </li><li> Repita os passos 3.5 e 3.6 para três lavagens adicionais usando fria Williams &#39;Medium E 1x para obter uma suspensão de células claras. </li><li> Após o passo de lavagem final, o sobrenadante aspirado para remover o excesso de restos de células. Re-suspender e células de filtro em 25 mL Williams quente &quot;Mídia E 1x que contém o descongelamento de hepatócitos primários e suplementos chapeamento através de um novo filtro de células de nylon de 70 mm em um tubo de 50 mL de polipropileno cónico. </li><li> Contagem de células no seio da suspensão de células de 25 ml, utilizando um hemocitómetro. Em média esperar 15 - 20 milhões de células por fígado adulto. Determinar a viabilidade celular utilizando coloração com azul de tripano. </li><li> células da placa em 2 mL de Williams do meio E 1x que contém o descongelamento de hepatócitos primários e suplementos um plaqueamento em colagénio revestido ce 6 poçoscluster de cultura LL (9 x 10 5 células por poço). </li><li> Após 4 h, alterar mídia para Williams &#39;Mídia E 1x que contém suplementos de manutenção de hepatócitos primários. </li><li> Após 24 h, soro privar as células com meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) meios 1x durante 6 h. </li><li> Tratar as células com PBS como veículo, FGF23 (25 ng / mL), LPS (100 ug / ml) ou IL-6 (50 ng / mL) em meio isento de soro e incubar durante 24 h. </li></ol> 4. Isolamento de ARN <ol><li> Prepare ARN utilizando um kit comercial coluna de centrifugação de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 5. cDNA Geração de RNA isolado por transcrição reversa <ol><li> Adicionou-se 200 ng de ARN isolado da amostra a um tubo de PCR. </li><li> Adicionar 14 mL de livre-endonuclease H2O a PCR tubo a partir do passo 5.1. </li><li> Adicionar 4 uL de transcriptase reversa para o tubo de PCR a partir do passo 5.1. </li><li> Re-suspender conteúdos delicadamente para fazer mistura homogénea; centrifugar suavemente. </li&gt; <li> Coloque tubo de PCR contendo a mistura em um termociclador. termociclador correr para a transcrição reversa: 1 ciclo de 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) e, em seguida, manter a 4 ° C. O produto final será o ADNc desejado. </li></ol> 6. A análise das células por Quantitative PCR em tempo real (qPCR) <ol><li> Preparar a placa de 96 poços. <ol><li> Coloque todos os componentes de reacção em gelo qPCR: 1 uL de ADNc, 0,25 uM iniciador directo, iniciador reverso 0,25? M, 5 uL SYBR Green, 3,5 pL de PCR água grau de pureza para um volume total de 10 ul. Usando SYBR Green, preparar mistura principal para executar todas as amostras em triplicado. </li><li> Uma vez que a mistura principal está completo, vortex para fazer homogênea. Aliquota 9 mL de qPCR mistura principal em cada poço de uma placa de 96 WLL. Depois, adicionar cuidadosamente 1 mL de ADNc em cada poço. o volume total da reacção irá tornar-se 10 ul. </li><li> Após o carregamento está completo, selar placa de 96 poços com ópticopelícula adesiva e placa de 96 poços brevemente centrifugação (50 x g durante 1 min). </li></ol></li><li> As amostras são executados em um instrumento Real-Time PCR. Coloque selado placa de 96 poços em instrumento Time-PCR real e as amostras são executados conforme as recomendações do fabricante do instrumento. Exemplos de ciclos normais e rápidos estão incluídas abaixo. <ol><li> Para os parâmetros de ciclagem padrão, utilizar o seguinte: desnaturação inicial a 94 ° C durante 120 s, depois 40 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 60 s, e em seguida, opcionalmente segurar a 4 ° C. </li><li> Para os parâmetros de ciclagem rápidas: usar o seguinte: desnaturação inicial a 94 ° C durante 30 s, depois 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 58 ° C durante 15 s, e em seguida 72 ° C durante 10 s. </li></ol></li><li> Consulte o manual do instrumento para obter orientação sobre como analisar dados. </li></ol> 7. Análise de sobrenadantes celulares por ELISA NOTA: Todos os passos são realizados de acordo com o protocolo do fabricante. </p&gt; <ol><li> Preparação de amostra <ol><li> Dispensar 398 ul de diluente em tubos separados. Pipeta 2 mL da amostra de sobrenadante celular para dentro do tubo 398 ul de diluente. Isto irá proporcionar uma dobra de diluição de 200. </li><li> Repetir o passo 7.1.1 para cada amostra a ser testada. </li></ol></li><li> Procedimento <ol><li> Pipetar 100 L de 200 vezes da amostra diluída e um padrão para as cavidades de uma placa de 96 poços. </li><li> Incubar a placa de 96 poços a 25 ° C durante 45 min num agitador de microplacas a 150 rpm. </li><li> Lavar os poços 5 vezes com solução tampão de lavagem 1x. Uma vez que a última lavagem é concluída, remover qualquer Solução de Lavagem residual com papel absorvente. </li><li> Adicionar 500 uL de reagente HRP-conjugado em cada poço. </li><li> Repita os passos 7.2.2 - 7.2.3. </li><li> Pipetar 100 L de tetrametilbenzidina (TMB) do reagente em cada poço de placa de 96 poços. </li><li> Misturar suavemente placa de 96 poços, a 25 ° C durante 20 min numa microplacaagitador a 150 rpm. Parar a reacção por adição directa de 100 ul de solução de paragem a cada poço e agitar suavemente. Uma vez que a solução de paragem é adicionado a cor deve virar amarelo. Este informa que a solução de parada foi correctamente misturados. </li><li> Utilizando um leitor de placa de microtitulação, determinar a densidade óptica a 450 nm, dentro dos primeiros 5 min. </li></ol></li><li> Cálculo dos resultados <ol><li> Calcular uma tabela de valores de absorvância média (A 450) para cada amostra e cada padrão. </li><li> Montar uma curva padrão representando graficamente a A450 média de cada padrão contra a sua concentração padrão em ng / mL num gráfico linear. Permitir que o eixo-x para representar a concentração e o eixo-y para representar um 450 valores. </li><li> Utilizando a média ± 450 de cada amostra diluída para determinar a concentração da proteína desejada em ng / ml a partir da curva padrão. </li><li> Multiplicar a concentração da amostra pelo facto de diluiçãor. Isto irá permitir a determinação da concentração real da proteína desejada na amostra de sobrenadante celular. </li><li> Traçar a tabela construída a partir de amostras em um gráfico de linha. Se os valores de DO450 cair fora da curva padrão, as amostras devem ser adequadamente diluídas e re-testado. </li><li> Normalizar os resultados para 500.000 células. </li></ol></li></ol>

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<li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li>
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<li>Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+pathway+in+the+liver%3A+From+physiopathology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy.</a> J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).</li>
<li>Grabner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Cardiac+Fibroblast+Growth+Factor+Receptor+4+Causes+Left+Ventricular+Hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy.</a> Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).</li>
<li>Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShulman%2C+M+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. 945, 287-302 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm qualquer conflito de interesses a declarar.

Isolamento de hepatócitos primários a partir de ratinhos é uma ferramenta rápido, barato e fiável para estudar as respostas inflamatórias ex vivo. Se realizado corretamente, os resultados podem ser facilmente gerada e reproduzida de forma atempada e eficiente. Os seguintes pontos devem ser cuidadosamente avaliada, a fim de garantir um isolamento bem sucedido. A incisão cirúrgica ea canulação da VCI deve ser realizada sob anestesia geral e não após a eutanásia. Um investigador jovem,...

Doença renal crónica (IRC) pode ser definida como um estado de inflamação aguda e crónica 1. Em pacientes com DRC, os níveis séricos do fator fosfatúrico hormona de crescimento de fibroblastos 23 (FGF23) aumentará progressivamente, a fim de manter a homeostase do fosfato sérico 2. Níveis FGF23 soro aumentados estão independentemente associadas com morbidade e mortalidade cardiovascular entre os pacientes que estão começando o tratamento de hemodiálise 3, 4. Além disso, vários estudos clínicos demonstraram uma correlação entre os níveis elevados e FGF23 níveis séricos de proteína C-reactiva (CRP), interleucina-6 (IL-6) e Tumor Necrosis Factor de α (TNFa) 5, 6. Além disso, em um estudo experimental, que demonstraram recentemente que FGF23 pode ter como alvo directamente hepatócitos e causa uma resposta inflamatória, aumentando PCR e IL-6 Produção no fígado 7. Assim, FGF23 pode atuar como um fator circulante que contribui para a inflamação sistêmica em CKD. No início dos anos 70, os hepatócitos primários foram isolados e estudados pela primeira vez 8. Desde então, as células hepáticas cultivadas primárias têm sido amplamente utilizados para examinar transformação metabólica, função hormonal, o metabolismo de drogas e toxicidade, bem como a imunidade e respostas inflamatórias 9, 10. Protocolos anteriores descreveram-se principalmente o isolamento enzimático de hepatócitos primários a partir de tecido de figado humano 11, 12. Enquanto um excelente modelo, este deixa de fora a possibilidade de estudar como a manipulação genética afeta os mecanismos de sinalização hepática complexos, bem como consequências funcionais sobre diferentes tipos de estímulos. No que se segue, descreve-se o isolamento de hepatócitos primários de murino. Notavelmente, o efeito de vários mediadores da resposta de fase aguda hepática, tais como lipopolissacáridos (LPS), IL-6 e FGF23 podem ser analisadas de uma forma fácil, rápida e reprodutível 13. Este trabalho apresenta um protocolo para o isolamento enzimático de hepatocitos de ratos adultos, e que demonstram que os indutores estabelecidos de inflamação, tais como LPS e IL-6, bem como novos mediadores inflamatórios, tais como FGF23, pode estimular directamente a expressão e secreção de citoquinas inflamatórias, tais como PCR e IL-6 em hepatócitos em cultura.

<table><tbody><tr><td>Consumíveis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &mu; m Filtro de células de nylon</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polipropileno Tubo Cônico</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>100 Aplicadores de Algodão de 6 polegadas&nbsp;</td><td>Seringa de Insulina Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>1cc U-100 28 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>Prato de Cultura de Tecidos 100 x 20 mm Estilo</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6 poços Cluster de Cultura de Células</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5/0 Seda Cirúrgica Trançada Preta (100 jardas)</td> <td>LOOK</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 Bomba de perfusão</td><td>Gilson</td><td>F155007</td><td></td></tr><tr><td>Kits de hemacitômetro, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-474</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de cobertura de hemactómetro, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-470</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras Cirúrgicas - Sharp/Blunt</td><td>F.S.T.</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Íris-ToughCut Reta</td><td>F.S.T.</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS-45 Fórceps</td><td>F.S.T.</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de Tecido de Estudante</td><td>FST</td><td>991121-12</td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>ReagentesSolução de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ácido acético, 2.0</td><td>N Sigma</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; A8976-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP 250 mL</td><td>Piramal Healthcare</td><td>&nbsp; &nbsp; 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>KetaVed 1.000 mg/10 mL (100 mg/mL)</td><td>VEDCO&</td><td>nbsp; &nbsp; &nbsp; 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina 100 mg/mL</td><td>AnaSed Injeção</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Willams' Medium E (1x)</td><td>gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Perfusão Hepática (1x)</td><td>gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Digestão do Fígado (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td></td></tr><tr><td>Suplementos Primários para Descongelamento e Plaqueamento de Hepatócitos Life Technologies</td><td></td> Suplementos de manutenção de hepatócitos primários <td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4</td><td>ThermoFisher científico</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>colágeno tipo 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>solução azul de tripano</td><td>VWR</td><td>45000-717</td><td></td></tr></tbody></table>

a indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

O fígado desempenha um papel decisivo na regulação da inflamação sistêmica. Na doença renal crónica, em particular, o fígado reage em resposta ao meio urémico, o stress oxidativo, endotoxemia e a diminuição da depuração da circulando citocinas pró-inflamatórias através da produção de um grande número de reagentes de fase aguda. ferramentas experimentais para estudar a inflamação eo papel subjacente dos hepatócitos são cruciais para compreender a regulação ea contribuição de citocinas hepáticas a uma resposta de fase aguda sistêmica e um cenário pró-inflamatória prolongada, especialmente em um ambiente complexo, tais como doença renal crónica. Uma vez que o estudo dos mecanismos complexos de inflamação in vivo permanece um desafio, uso intensivo de recursos e geralmente requer a utilização de animais transgénicos, hepatócitos isolados primários fornecer uma ferramenta robusta para obter insights mecanísticos para a resposta de fase aguda hepática. Desde esta técnica in vitro apresenta custos moderados, alta reprodutibilidade e conhecimento técnico comum, hepatócitos isolados primários podem também ser facilmente usados ​​como uma abordagem de triagem. Aqui, nós descrevemos um método baseado em enzimática para isolar os hepatócitos primários de murino, e que descrevem a avaliação de uma resposta inflamatória nestas células usando ELISA e quantitativa PCR em tempo real.

Histologia As imagens de microscopia de luz representativas de células isoladas e cultivadas primárias estão representados na Figura 1A. Análise imunocitoquímica demonstra que hepatócitos isolados altamente expressar albumina (vermelho), bem como do receptor de factor de crescimento de fibroblastos 4 (FGFR4) (verde). Os núcleos são corados com 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul). (Figura 1B)...

Aqui, mostramos uma abordagem enzimática para isolar hepatócitos primários a partir de ratos adultos, e descreve-se a quantificação de uma resposta inflamatória por meio de ELISA e PCR em tempo real.

A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar com sucesso hepatócitos murinos funcionais para estudar a expressão e secreção de citocinas inflamatórias, como PCR e IL6, em resposta a mediadores da resposta hepática de fase aguda. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a função hepatocelular e a contribuição das citocinas hepáticas para um ambiente inflamatório prolongado, como o encontrado na doença renal crônica. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma ferramenta robusta para uma análise simples, rápida e reprodutível de metabolômica hepática e inflamação, bem como da resposta a fármacos.Para começar, aqueça previamente o meio de perfusão hepática e o meio de digestão hepática em banho-maria a 37 graus Celsius. Monte uma bomba de perfusão conforme mostrado aqui. Em seguida, use o meio de perfusão hepática para preencher cuidadosamente o sistema de tubos da bomba.Tente evitar bolhas de ar no sistema. Prepare o microscópio estereotáxico para o procedimento de perfusão. Em seguida, após anestesiar um camundongo doador de acordo com o protocolo descrito, posicione o animal anestesiado sobre uma almofada absorvente.Use fita adesiva para fixar as extre

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Infecção de camundongos com um Adenovírus expressando o autoantígeno major humano do citocromo P450 2D6 (hCYP2D6) reconhecidas pelos soros de pacientes que sofrem a partir de tipo 2 resultados da hepatite auto-imunes em uma forma persistente da auto-imune-mediada doença do fígado caracterizada por extenso hepatite fibrose, e de geração de um CYP2D6 -específica resposta imune.

O modelo animal CYP2D6: Como induzir hepatite auto-imune em ratos

A interrupção do fluxo biliar resulta em lesão hepática colestática inflamatória grave com uma sequência característica de alterações morfológicas dependentes do tempo. Aqui apresentamos um protocolo para a ligadura cirúrgica do ducto colédoco em camundongos que permite induzir uma forte resposta fibrótica após 21 a 28 dias.

Ligadura do ducto biliar em ratos: Indução de Inflammatory Lesão hepática e fibrose por colestase obstrutiva

Aqui nós descrevemos um método comum para induzir lesão hepática crônica em ratos, alimentando-se de uma dieta deficiente em colina e ethionine-complementado do (CDE). Demonstramos que o monitoramento de integridade, perfusão hepática, isolamento e preservação. Um curso de tempo de seis semanas pode informar sobre a lesão hepática, pathohistology, fibrose, inflamatória e respostas de células progenitoras de fígado.

O murino colina deficiente, Ethionine-completada (CDE) dieta modelo de lesão hepática crônica

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação dos hepatócitos saudável e funcional principal do rato. Instruções para a detecção de síntese hepática da proteína nascente por substrato de rotulagem não-radioativo foram fornecidas para ajudar a compreender os mecanismos subjacentes a síntese de proteínas no contexto da homeostase do metabolismo energético no fígado.

Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

Descrevemos um modelo de imunização in vivo, hepatite translacional em camundongos BALB/c que pode ser utilizado para estudar a patogênese da hepatite autoimune induzida por drogas, incluindo diferenças sexuais observadas nesta doença. Descreveremos como este modelo demonstra análises reprodutíveis utilizando técnicas experimentais in vivo e in vitro.

Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos

Aqui, nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo murino clìnica relevante do cancro do fígado que recapitulando as características imunes típicas do cancro hepatocelular (HCC).

Um modelo de camundongo de câncer hepatocelular induzido por hepatócitos oncogênico, decorrente do ajuste da inflamação e fibrose hepática

Um modelo animal da dieta-induzido simples e de confiança do roedor para o esteatohepatite não alcoólico (Nash) é descrito, conseguido com a carcaça non-SPF dos animais e a administração de uma dieta high-fat específica. Nós descrevemos a identificação de subconjuntos hepatic e adiposos da pilha imune para recapitular condições imunológicas humanas expondo ratos aos germes ambientais.

Um modelo murino avançado para esteatohepatite não alcoólica em associação com diabetes tipo 2

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos de fígados de camundongos adultos usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também é descrita a cultura de longo prazo dos hepatócitos em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, bem como imunorotulagem dos componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta ao tratamento.

Isolamento e cultura sanduíche de colágeno 3D de hepatócitos de camundongos primários para estudar o papel do citoesqueleto na formação bile canalicular in vitro

Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.

Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

Este vídeo mostra como induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL e como avaliar sua gravidade pela histopatologia.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Aprenda a isolar hepatócitos primários de camundongos para estudar respostas inflamatórias hepáticas. Este método enzimático permite quantificar citocinas como CRP e IL6 por ELISA e PCR em tempo real.

A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

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