Analisando celular superfície de adesão remodelação em resposta à tensão mecânica usando pérolas magnéticas

O objetivo geral deste experimento é explorar as vias bioquímicas que são ativadas em resposta à tensão usando microesferas magnéticas revestidas com ligante e aplicação forçada em receptores de adesão. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da transação mecânica, como a tensão mecânica da helometria expressa os direciona da diferenciação ou como a complacência do tecido impulsiona sua transformação. A principal vantagem dessa técnica é que muitas células podem ser estimuladas para análise química usando grânulos para aplicar tensão em um subconjunto específico de receptores de adesão.

Para começar, ressuspenda completamente as esferas superparamagnéticas tosilativadas no frasco original por vórtice por pelo menos 30 segundos. Alíquota de 40 microlitros das esferas superparamagnéticas ressuspensas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de fosfato de sódio molar a 0,1 pH 7,4. Em seguida, coloque o tubo em um suporte de separação magnética para separar as esferas magnéticas da solução.

Rejeitar o sobrenadante e retirar o tubo do suporte de separação magnética. Ressuspenda as contas em um mililitro de fosfato de sódio molar 0,1 pH 7,4. Depois de lavar as contas duas vezes, ressuspenda-as em um mililitro do mesmo tampão.

Em seguida, combine 100 microgramas de fibronectina bovina ou qualquer outro ligante do receptor de adesão celular aos grânulos e ao vórtice. Repita esta etapa substituindo o ligante por BSA, poli-D-lisina ou apotransferrina para controles negativos. Incubar os grânulos com a solução contendo o ligante por 12 a 24 horas a 37 graus Celsius em um rotor.

Se os agregados de grânulos aparecerem após a reação, sonicar por não mais de 10 a 20 segundos. Em seguida, isole as esferas usando um suporte de separação magnética e aspire a solução restante. Em seguida, adicione um mililitro de uma solução de PBS suplementada com 0,2% de albumina de soro bovino.

Incube por uma hora em um rotor a 37 graus Celsius. Usando um ímã, lave as esferas com um mililitro de solução de PBS suplementada com 0,2% de albumina de soro bovino duas vezes. Antes de ressuspendê-los em um mililitro do mesmo tampão.

Sonicar os grânulos se os agregados aparecerem por não mais do que 20 a 30 segundos. Prossiga para os ensaios de células ou armazene as contas a quatro graus Celsius por até um mês. Cultivar células aderentes em uma placa de cultura de tecidos de 60 mililitros em meio de crescimento apropriado até atingir 80% de confluência.

Depois de peletizar as esferas revestidas com ligante, ressuspenda o pellet em um mililitro de solução de PBS suplementada com 0,2% de albumina de soro bovino. Adicione 100 microlitros da solução de grânulo revestida com ligante a cinco mililitros de meio de cultura quente e vórtice. Em seguida, aspire o meio em uma placa de cultura de 60 mililitros e adicione cinco mililitros de meio de crescimento quente suplementado com miçangas.

Incubar a suspensão durante 20 minutos em condições de cultura de células para permitir que os grânulos sedimentem e adiram às células. É fundamental não exceder 20 minutos, pois as esferas podem ser internalizadas por fagocitose. Em seguida, observe as contas sob um microscópio de luz usando uma objetiva de 10X ou 20X.

Verifique a aderência do cordão agitando levemente o prato para discriminar entre grânulos presos e flutuantes. Coloque um ímã redondo de neodímio de 38 milímetros na face superior de uma tampa normal de 60 milímetros e mantenha-o no lugar usando dois ímãs menores de neodímio de 13 milímetros posicionados na face inferior da tampa. Incubar as células submetidas à tensão durante os pontos de tempo e condições de cultura celular desejados.

Troque a tampa normal do prato por uma tampa com o ímã. Como os ímãs são muito poderosos, manipule-os com cuidado. Após o tratamento, coloque o prato no gelo e aspire cuidadosamente todo o meio do prato.

Adicione 300 microlitros de tampão de lise celular e incube por 10 minutos no gelo. Em seguida, colete o lisado usando um raspador de células e transfira-o para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro. Pulverize os grânulos magnéticos usando o suporte de separação magnética e transfira o lisado celular total para um novo tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro.

Remover uma alíquota de 15 microlitros do lisado celular total obtido após a separação do grânulo para análise de western blot. Lave as contas três vezes com um mililitro de tampão de lise gelada. Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de amostra ao pellet de grânulos.

Depois de misturar a suspensão por vórtice, ferva-a a 95 graus Celsius por cinco minutos usando um aquecedor de bloco seco. Esta fração contém os complexos de adesão isolados. Prossiga para a análise bioquímica ou armazene a fração a menos 20 graus Celsius.

Esta figura é mostrada para demonstrar a purificação dos complexos de adesão. O immunoblotting de GAPDH é usado como um controle da carga para o lisado da pilha total e para verificar a pureza dos complexos da adesão. Uma longa exposição foi usada para validar a ausência de sinal citoplasmático na fração do complexo de adesão purificada.

Grânulos revestidos de fibronectina foram usados para investigar os processos de mecanotransdução que ocorrem ao longo do tempo nos complexos de adesão em resposta à tensão. Após a separação magnética da fração do complexo de adesão, o lisado e a fração do complexo de adesão foram analisados por western blot. O controle de carga e os candidatos conhecidos por serem recrutados ou fosforilados em complexos de adesão em resposta à tensão mecânica foram imunoblotados.

Embora a tensão não tenha afetado o recrutamento de paxilina para os complexos de adesão, sua fosforilação na tirosina 31 foi aumentada em resposta à tensão mecânica tanto no lisado celular total quanto na fração do complexo de adesão. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar forças tensionais às proteínas de superfície de adesão usando esferas magnéticas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser cauteloso com os ímãs poderosos. Após este procedimento, estudos bioquímicos, como western blots, ensaio de polimerização de actina ou ensaio enzimático, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se a atividade da quinase é regulada pela tensão. Essa técnica pode ajudar pesquisadores no campo da biologia celular a explorar vias de sinalização magnéticas sensíveis nas células.