Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

O objetivo geral deste protocolo bioquímico é gerar nucleossomos com histonas irmãs marcadas isotopicamente de forma diferencial, para uso no mapeamento de modificações pós-traducionais simultaneamente em ambas as histonas irmãs. O objetivo geral deste protocolo bioquímico é gerar nucleossomos com histonas irmãs marcadas isotopicamente de forma diferencial para uso no mapeamento de modificações pós-traducionais simultaneamente em ambas as histonas irmãs.

Este método, em combinação com técnicas de alta resolução para mapear modificações pós-traducionais, como na espectrometria de massas, aborda questões fundamentais na biologia da cromatina, como quais mecanismos contribuem para a formação de nucleossomos simetricamente modificados? A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser facilmente implementada em um laboratório de bioquímica, pois combina protocolos padrão de reconstituição de nucleossomos com metodologias comuns de purificação de proteínas. Duas pools de histona H3 serão utilizadas para a reconstituição do octâmero.

H3 marcado com nitrogênio-15 que contém uma etiqueta de polihistidina no terminal amino e H3 marcado com carbono-13 que contém uma etiqueta de afinidade por estreptavidina no terminal amino. Inicie este procedimento dissolvendo as alíquotas liofilizadas de histonas, incluindo os dois tipos de histona H3, em tampão desnaturante. Em cada tubo que contém cerca de cinco miligramas de histonas, adicione um mililitro de tampão desnaturante e misture por pipetagem, mas não vortex.

Mantenha os tubos no gelo por 30 minutos para permitir o desdobramento completo. Em seguida, meça a absorbância em 280 nanômetros para determinar a concentração exata de cada histona. Misture as histonas centrais em razões molares iguais, lembrando-se de incluir 50% de cada um dos dois grupos de histona H3.

Use o tampão de desdobramento para ajustar a concentração final da proteína a aproximadamente um miligrama por mililitro. Transfira a mistura para uma membrana de diálise com corte de seis quilodaltons. E realize diálise contra um a dois litros de tampão de refoldagem resfriado a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, colete o material diálise e remova quaisquer precipitados por centrifugação em microcentrífuga durante cinco minutos a quatro graus Celsius em velocidade máxima. Após determinar a concentração do octâmero, utilize uma unidade de filtro centrífugo com corte de 10 kilodaltons para concentrar o octâmero até um volume final de cerca de dois mililitros. Deve-se obter uma concentração de octâmero entre 50 e 100 micromolares.

Prepare-se para a filtração em gel conectando a coluna de filtração em gel a um sistema FPLC. Equilibre com dois volumes da coluna, ou CV, de tampão de refoldagem filtrado em 0,22 micrômetro e desgaseificado. Injete o material concentrado a uma vazão de um mililitro por minuto e colete frações de um a 1,5 mililitro.

Para iniciar este procedimento, reúna as frações relevantes contendo octâmeros puros e determine a concentração conforme descrito anteriormente. Conecte uma coluna de ácido nitrilotriacético com níquel (ou NTA com níquel) de um mililitro ao sistema de FPLC e equilibre com 10 volumes de coluna de tampão de refoldagem filtrado em 0,22 micrômetro e desgaseificado, a uma vazão de um mililitro por minuto.

Transfira o octâmero purificado através da coluna de níquel NTA utilizando uma vazão de um mililitro por minuto. Colete o fluxo que passa. Elua com 10 CV do tampão de refoldamento contendo 250 milimolares de imidazol, utilizando uma vazão de um mililitro por minuto.

Colete a eluição de níquel NTA. A purificação baseada em estreptavidina deve idealmente ser realizada em câmara fria. Equilibre uma coluna de afinidade de um mililitro de estreptavidina comercial com 10 volumes de coluna de tampão de refoldagem contendo 250 milimolares de imidazol, utilizando um sistema de fluxo por gravidade em batelada.

Passe a eluição de níquel NTA pela coluna de afinidade com estreptavidina. Colete o fluxo que passa. Elua com 10 CV de tampão de refoldamento contendo 2,5 milimolares de desthiobiotina.

Colete o eluato. Após medir a concentração do octâmero no eluato, adicione uma quantidade dez vezes menor de protease TEV e deixe a reação prosseguir durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira a mistura para uma membrana de diálise com corte de 50 kilodaltons e realize a diálise contra o tampão de refoldagem durante a noite a quatro graus Celsius.

Concentre o octâmero assimétrico purificado utilizando uma unidade de filtro centrífugo com corte de 10 kilodaltons até um volume de um a dois mililitros. A concentração esperada do octâmero é de 20 a 50 micromolares. A reconstrução do nucleossomo requer DNA contendo uma sequência de posicionamento de nucleossomo.

Ajuste a concentração salina do DNA para dois molar de cloreto de sódio utilizando uma solução estoque de cloreto de sódio cinco molar. Misture o DNA com o octâmero e o tampão de refold usando a razão ótima de octâmero para DNA determinada a partir de um teste em pequena escala. Adicione o octâmero por último para evitar qualquer possibilidade de misturar o octâmero e o DNA em uma concentração salina inferior a dois molar.

Transfira a mistura para uma membrana de diálise com corte de seis quilodaltons e realize a diálise contra um litro de tampão de refoldagem durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, reduza a concentração de sal do tampão de diálise de maneira gradual, mantendo a amostra em cada tampão de cloreto de sódio por pelo menos três horas.

Em seguida, transfira a membrana de diálise para um béquer contendo um litro de tampão de ensaio e prossiga com a diálise durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, colete a amostra dialisada. Remova qualquer precipitado formado por centrifugação em microcentrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius em velocidade máxima.

Concentre a amostra utilizando uma unidade de filtro centrífugo com corte de 30 kilodaltons até um volume final de cerca de 300 microlitros. Meça a concentração de DNA em 260 nanômetros. A concentração final deve estar na faixa de 10 a 20 micromolar.

Armazene a amostra a quatro graus Celsius por até várias semanas. Um perfil de eluição por filtração em gel da mistura de histonas renaturadas mostra os octâmeros de histonas eluindo em cerca de 70 mililitros. Um gel de eletroforese em SDS-PAGE mostra a estequiometria correta das histonas.

O pool octamérico reconstituído, contendo os três tipos de octâmeros, é submetido a um esquema de purificação por afinidade em tandem. O isolamento das espécies assimétricas é verificado pela presença da marca de afinidade. As marcas de afinidade são posteriormente removidas com a protease TEV.

Uma reconstituição de nucleossomo em pequena escala utilizando diferentes razões molares de DNA para octâmero mostrou que uma razão de um para um foi a ideal. Foi realizada uma reconstituição de nucleossomo em larga escala utilizando a razão molar otimizada de DNA para octâmero, e observou-se a estequiometria correta dos quatro histonas centrais. A espectroscopia de RMN de nucleossomos diferencialmente marcados com isótopos confirmou a presença de histonas H3 irmãs marcadas com nitrogênio-15 e carbono-13.

Neste exemplo de aplicação, nucleossomos diferencialmente marcados com isótopos e fosforilados de forma assimétrica no anel C10 da histona H3 foram incubados com a acetiltransferase GCN5. A acetilação da lisina 14 da histona H3 em ambas as cópias de H3 foi então acompanhada em tempo real por espectroscopia de RMN. A análise revelou que a fosforilação no anel C10 da histona H3 estimula a acetilação da lisina 14 da histona H3 pela GCN5 em cis, em comparação com trans.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco dias se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como reconstituir nucleossomos contendo histonas irmãs com características diferentes.