Name: Análise de Linfócitos extravasamento Usando um In Vitro Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a analisar o extravasamento de linfócitos usando um modelo in vitro da barreira hematoencefálica humana. Este método permite estudar populações raras de células em nível individual e investigar doenças inflamatórias do sistema nervoso central.

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Este estudo foi apoiado pelo Centro de Pesquisa Colaborativa CRC TR128 "Iniciação/Efetor versus Mecanismos Regulatórios na Esclerose Múltipla-Progresso para o Combate à Doença" (Projeto A9 para H.W. e C.C.G., projeto B1 para N.S.).

1. Cultura de células de cérebro humano Células Endoteliais Microvasculares (HBMEC) <ol><li> Revestimento de frascos de cultura de células <ol><li> Para preparar a solução de fibronectina, adicionar 10 mL de PBS para um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 150 mL de fibronectina e misture bem. </li><li> Para cobrir o fundo de um frasco de cultura de células T-25, adicionar 2 ml de solução de fibronectina. Incubar o balão de cultura de células durante pelo menos 3 h a 37 ° C na incubadora. Revestidas com fibronectina frascos podem ser armazenados durante 2 semanas a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Sementeira e cultura de células de HBMEC <ol><li> Aspirar solução de fibronectina a partir do fundo do frasco de cultura de célula. Adicionar 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² suspenso em 6 ml de meio de ECM-b (= ECM-b suplementado com 5% de soro fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de suplemento de crescimento de células endoteliais). Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. Verifique o crescimento de células diariamente usando um microscópio. </li><li> Mudar o meio cada 3 dias.Colheita ou células divididas, quando HBMEC atingir aproximadamente 80% de confluência. HBMEC deve ser usado entre a passagem 1 e 15 para evitar a perda de propriedades fisiológicas. </li></ol></li><li> Colheita HBMEC. <ol><li> Prepare Accutase solução por mistura de Accutase (1x) com PBS numa proporção de 1: 1. Manter Accutase solução a 37 ° C em um banho de água até à sua utilização. </li><li> Transferência médio ECM-b a partir do balão de cultura de células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Lavar HBMEC por adição de 5 mL de PBS para o fundo do frasco de cultura de células. Aspirar PBS e repetir o passo de lavagem mais duas vezes. </li><li> Adicionar a solução de 2 ml pré-aquecido Accutase. Incubar a 37 ° C durante 2 min. Posteriormente, HBMEC são re-suspensos batendo firmemente o frasco de cultura de células várias vezes. destacamento das células é controlada usando um microscópio </li><li> O ECM-b-forma previamente armazenado num tubo de 15 ml é adicionado de volta ao frasco de cultura de células, logo que HBMEC começar a separar. Lavar o fundo do frasco repetidamente até que a maioria são HBMECre-suspensa. </li><li> Transferir a suspens celular para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante e as células em 1 mL de meio de ECM-b re-suspender. Contar as células e dilui-se a suspensão de células para se conseguir uma concentração final de 3 x 10 5 mL HBMEC por meio de ECM-b. </li></ol></li></ol> 2. Preparação do celular Cultura Insere <ol><li> Revestimento de inserções de cultura de células Nota importante: Evite tocar a membrana das inserções de cultura de células. <ol><li> Adicionar 100 de soluo de fibronectina (ver 1.1.1) de cada inserção de cultura de células (Figura 1A) e uma cavidade de uma placa de 96 poços de fundo plano (controlo óptico bem). Incuba-se durante pelo menos 3 h a 37 ° C. Depois da solução de incubação aspirado fibronectina. </li><li> Adicionar 100 mL HBMEC suspensão para as inserções de cultura de células e o controlo óptico bem. Adicionar 600 ul de ECM-b meio para o compartimento inferior da célulainserções cultura. Incubar durante 3 - 4 dias a 37 ° C / 5% de CO2 até que a integridade da barreira (Figura 1B) é atingido, verificar o crescimento celular por avaliação microscópica do HBMEC no controlo óptico bem. Nota: O crescimento celular para além de quatro dias não é recomendado. </li><li> Opcional: Para imitar as condições inflamatórias aspirar o meio a partir do compartimento inferior e substituí-la por ECM-b meio suplementado com 500 U / mL de IFN-γ / TNF-α 24 h antes do ensaio de migração. </li></ol></li></ol> 3. Controle de Qualidade com azul Evans no dia do ensaio Transmigração <ol><li> Preparação de solução de azul de Evans <ol><li> Para preparar PBS / B27 solução mistura de 10 mL de PBS com suplemento B27 200 ul utilizando um tubo de 15 ml de centrífuga. Diluir solução mãe de azul de Evans (20 mg / mL PBS) 1: 1000 com PBS / B27. </li></ol></li><li> ensaio de permeabilidade de azul de Evans <ol><li> Aspirar o meio do compartimento inferior seguido pelo compartimento superiorde uma inserção de cultura de célula contendo uma monocamada confluente HBMEC. Adicionar 100 mL Evans solução azul para a inserção de cultura de célula. </li><li> Adicionar 600 de PBS / B27 para o compartimento inferior e incubar durante 60 min a 37 ° C / 5% de CO 2. Cuidadosamente remover a inserção de cultura de célula usando uma pinça. </li></ol></li><li> medição de azul de Evans <ol><li> Remover PBS / B27 a partir do compartimento inferior e transferir 100 ul cada um de dois pos de uma polistirol preto placa de 96 poços de fundo plano. Inserir a placa num leitor de placas Tecan Pro Infinito M200 e determinar-z posição óptima. </li><li> excitação medida de azul de Evans, utilizando respectivas configurações (por exemplo: de excitação: 620 nm, emissão: 680 nm, largura de banda de excitação: 9 nm, largura de banda de emissão: 20 nm, realce 175x, 25 flashes, tempo de integração: 20 mS). </li><li> Para determinar as funções de barreira HBMEC comparar os dados adquiridos para uma curva padrão representando Evans permeação azul através HBMEC em diferentes pontos de tempo após a sementeing células (Figura 1B, à direita). </li></ol></li></ol> 4. Migração Assay <ol><li> Preparação de células mononucleares de sangue periférico (PBMC). <ol><li> Adicionar 10 mL de meio RPMI para um tubo de centrífuga de 15 ml e adiciona-se 200 uL suplemento B27. Contagem de células PBMC e de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Re-suspender as PBMC a uma concentração final de 5 x 10 6 culas / mL de RPMI / B27. </li></ol></li><li> Defina-se o ensaio de migração <ol><li> Meio aspirado a partir do compartimento inferior seguido pelo compartimento superior de inserções de cultura de células contendo monocamadas confluentes HBMEC (Figura 1A). Por doador, adiciona-se 100 uL de suspensão de PBMC de cada para as inserções de cultura de células e também a um poço de uma placa de 24 poços por (in vitro de controlo). </li><li> Adicionar 600? L de RPMI / B27 para o compartimento inferior das inserções de cultura de células e 500 ul para o PBMC do controlo in vitro e incubar 6 h a 37 ° C / 5% de CO 2. </li&gt; </ol></li><li> Colheita de PBMC migrado <ol><li> Retire a inserção de cultura de célula usando uma pinça e lavar cuidadosamente a parte inferior com 400 uL de PBS sem tocar na membrana. Descartar a inserção de cultura de célula. </li><li> Adicionar 20 ul fluorosferas contagem de fluxo (cerca de 1000 esferas / uL) para o compartimento inferior da cultura celular inserir, bem como para o controlo in vitro e misturar bem. Transferir 1 ml da resultante suspensão de PBMC para tubos de citometria de fluxo. </li></ol></li></ol> 5. Citometria de Fluxo <ol><li> Preparação de amostra <ol><li> Centrífuga PBMC a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Preparar a soluo de anticorpo através da adição de anticorpos fluorocromo-conjugados com 100 uL de tampão de citometria de fluxo (PBS / BSA a 1% / EDTA a 2 mM) por amostra. Para os resultados apresentados abaixo 1 uL de CD4-FITC, um μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 uL de CD56-PC7, 1 uL CD8-A700, e 1 uL de CD16-A750 foram usadas por amostra. </li><li> Re-suspender PBMC em 100 mL da solução de anticorpo e incubar durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 250 uL de tampão de citometria de fluxo e centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li></ol></li><li> aquisição amostra <ol><li> Re-suspender as PBMC na quantidade necessária (varia de acordo com o citetro de fluxo utilizado) de tampão de citometria de fluxo. </li><li> Adquirir manchado de PBMC utilizando um citómetro de fluxo com um detector activa entre 525 e 700 nm comprimento de onda para detectar fluorosferas contagem de fluxo (excitação 488 nm, emissão a 525-700 nm). (Os passos seguintes são um exemplo, se um fluxo Gallios citómetro operado com o software Kaluza G é usada:. (1) Iniciar o computador (2) Quando o sistema de operação está completamente carregado, iniciar o citómetro de fluxo por prensagem a &quot;citómetro no&quot; botão . (3) Coloque o respectivo protocolo de aquisição, premindo o botão &quot;protocolo aberto&quot;. (4) Escolha o protocolo necessário e selecione &quot;abrir&quot;. (5) Duplicar o protocolo para cada amostra, clicando com o direitobotão do mouse sobre o protocolo visível no carrossel virtual e um clique esquerdo no campo &quot;duplicado&quot;. (6) Rotular cada amostra na lista de amostra. (7) Transferir as amostras para as posições indicadas do carrossel e iniciar a aquisição.) </li></ol></li><li> análise de amostras <ol><li> Abrir fluxo resultante citometria de dados usando o respectivo software. Determinar o número de sub-populações de interesse para PBMC transmigradas, bem como células in vitro a partir de poços de controlo e fluir fluorosferas contagem usando o respectivo software de análise. (Um exemplo da estratégia de intermitcia é dada na parte resultados (Figura 1 C: Para analisar a transmigração de subconjuntos de culas NK, seleccionar primeiro os linfócitos em um canal de dispersão para um lado (SSC) em relação ao canal de dispersão FSC) trama (linfócitos são. então exibidos num CD3 contra CD56 trama e CD56 + CD3 -. As células NK são seleccionados para distinguir entre os subconjuntos de células NK, células NK são exibidas emum contra CD56 CD16 CD56 CD16 trama e brilhante dim / - células NK, bem como CD56 CD16 + são seleccionadas dim. Além disso, fluorosferas contagem de fluxo são seleccionados a partir de um FSC SSC contra trama e posteriormente apresentado numa trama de um canal com uma emissão entre 525 e 700 nm versus tempo para determinar o seu número.) </li><li> Para calcular o número total de células de cada amostra, normalizar o número de células detectadas usando fluorosferas contagem de fluxo: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Determinar a percentagem de células que migraram como a razão entre células que migraram totais e de células totais no controlo in vitro. </li></ol></li></ol>

O(s) autor(es) declarou(m) os seguintes potenciais conflitos de interesse com relação à pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo: A.S.-M. e a U.B. não têm divulgações financeiras. T. S.-H. recebeu despesas de viagem e conferência da Biogen. N.S. recebeu honorários de palestrante e conselho consultivo da Biogen e da Novartis Pharma, bem como despesas de viagem da Biogen. H.W. recebeu remuneração por atuar em Conselhos Consultivos Científicos/Comitês Diretivos da Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis e Sanofi-Genzyme. Ele também recebeu honorários de palestrante e apoio de viagem da Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis e Sanofi-Genzyme. Ele recebeu remuneração como consultor da Biogen, Merck Serono, Novartis e Sanofi-Genzyme. H.W. recebeu apoio de pesquisa da Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Alemanha e Sanofi US. C.C.G. recebeu honorários de palestrante e despesas de viagem por participar de reuniões da Genzyme, Novartis Pharma GmbH e Bayer Health Care.

Aqui apresentamos uma técnica para investigar a transmigração de linfócitos através da barreira sangue-cérebro humano. A análise in vitro de migração de linfócitos para o SNC é importante para estudar processos básicos de extravasamento de linfitos, potenciais alterações relacionadas com a doença, e de novas abordagens terapêuticas. Várias modificações do modelo de barreira sangue-cérebro são possíveis. Por exemplo, as células do compartimento superior poderia ser analisado...

migração de linfócitos a partir do sangue para os tecidos é crucial para a vigilância imunitária. Uma sequência de interacções moleculares específicos assegura extravasamento local específico para o intestino delgado, de pele, nódulos linfáticos, o sistema nervoso central (CNS), e outros tecidos 1. Alterações na migração de linfócitos estão envolvidos na patofisiologia de uma série de doenças ampla disseminação 2. Migração para o SNC imuno-privilegiado é fortemente regulada e, consequentemente, alterações deste processo estão envolvidos em doenças relacionadas com o SNC, como encefalomielite 3, neuromielite óptica, acidente vascular cerebral, e esclerose múltipla (MS), 2, 4, 5, 6, 7. Portanto, é importante estudar o extravasamento de linfócitos para melhor compreender a fisiopatologia da doença e desenvolver ferramentas para uma<html> melhoramento da doença de carga 8, 9, 10, 11, 12. Os linfócitos migra para o SNC através de rotas distintas. Extravasamento através de vénulas pós-capilares para o espaço subaracnóide através da barreira sangue-fluido cerebrospinal dentro do plexo coróide e através da barreira sangue-cérebro ter sido descrito um, 13, 14, 15. Migração através da barreira sangue-cérebro é conduzida pela interacção de linfócitos com células endoteliais 14. Em contraste com as células endoteliais na periferia, as células endoteliais do SNC expressar quantidades elevadas de moléculas de juno apertadas, assim limitar rigorosamente a quantidade de células e proteínas capazes de atravessar a barreira sangue-cérebrolass = &quot;xref&quot;&gt; 16. Inflamação resulta em afrouxamento de junções apertadas e induz a expressão de moléculas de adesão; assim, aumentando a migração de linfócitos para o SNC 1, 17, 18. Extravasamento através da barreira sangue-cérebro é um processo de múltiplos passos. Linfócitos do tirante para as células endoteliais e, em seguida, rolar ao longo do endotélio em um processo mediado principalmente por selectinas 1, 15. Posteriormente, as interacções entre as quimioquinas segregadas pelo endotélio e os respectivos receptores de quimiocinas expressas em linfócitos induzir mudanças conformacionais de integrinas, promovendo assim a adesão firme para as células endoteliais 1. Finalmente, quer linfócitos de rastreamento ao longo da barreira endotelial contra o fluxo de sangue antes transmigrando para o espaço perivascular, ou parar imediatamente e directamente transmigrate no local da empresa de aderência 1, 19, 20. Todos estes passos de extravasamento de linfitos pode ser analisada in vitro utilizando técnicas distintas 21. Microscopia de lapso de tempo vídeo é usado para estudar o tethering inicial e rolando 15. Os ensaios de adesão fornecem informações detalhadas sobre a prisão firme endoteliais barreiras 22. Os ensaios de transmigração como demonstrado aqui permitem a análise de transmigração de células imunes 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Usando o modelo humano in vitro barreira hematoencefálica, que recentemente poderia mostrar que uma maior migrAtory capacidade de CD56 CD16 brilhante dim / - células NK em comparação com o seu CD56 dim CD16 + homólogos foi reflectida por uma predominância deste subconjunto de células NK no compartimento 21 intratecal. Assim, a instalação experimental parece ser adequado para mimetizar a situação in vivo.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>sem CaCl2 ou MgCl2</td></tr><tr><td>Fibronectina 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>do frasco de</td></tr><tr><td>cultura de células T-25</td> de plasma bovino <td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de crescimento de células endoteliais</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>transparente, 6.5 mm de diâmetro, 3.0 & Micro; m tamanho do poro</td></tr><tr><td>96 poços placa de fundo plano</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans azul</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>solução estoque: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrado</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 poços preto placa de fundo plano</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>placa de 48 poços</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroesferas de Contagem de Fluxo</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Citômetro de fluxo de 10 cores</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gama;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>clone 300506</td><td>RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

análise de linfócitos extravasamento usando um<em&gt; in vitro</em&gt; modelo do sangue-cérebro humano barreira

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Linfócitos extravasão para o sistema nervoso central (SNC) é crítica para a vigilância imunitária. alterações relacionadas com a doença de extravasamento de linfócitos pode resultar em alterações fisiopatológicas no SNC. Assim, investigação sobre a migração de linfócitos para o SNC é importante para entender as doenças inflamatórias do sistema nervoso central e o desenvolvimento de novas abordagens de terapia. Aqui apresenta-se um modelo in vitro da barreira sangue-cérebro humano para estudar o extravasamento de linfitos. células endoteliais humanas microvasculares cerebrais (HBMEC) são cultivadas em confluently um tereftalato de polietileno poroso Transwell Insert para imitar o endotélio da barreira sangue-cérebro. a função de barreira é validado por zonula occludens imuno-histoquímica, a resistência eléctrica transendotelial (TEER) medidas bem como a análise de Evans permeação azul. Este modelo permite a investigação da diapedese de subconjuntos de linfócitos raras, tais como CD56 CD16 brilhante dim / - células NK. Furthermminério, os efeitos de outras células, citocinas e quimiocinas, alterações relacionadas com a doença, e regimes de tratamento diferentes na capacidade migratória de linfócitos podem ser estudados. Finalmente, o impacto de estímulos inflamatórios, bem como diferentes regimes de tratamento sobre a barreira endotelial pode ser analisado.

Os resultados representativos, mostrando a transmigração de células NK e subconjuntos de células T utilizando o modelo de barreira sangue-cérebro humano (Figura 1A) são mostrados. A integridade da monocamada HBMEC foi validado por coloração da molécula de junção estanque ZO-1, a resistência eléctrica medições transendotelial (TEER), e Evans permeação azul (Figura 1B). Seguindo 3 - 4 dias de cultura HBMEC expressa a molécula de junção estanque ZO-1 <stron...

Aqui, descrevemos um modelo de barreira hematoencefálica humana que permite investigar a transmigração de linfócitos para o sistema nervoso central in vitro.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

O objetivo geral deste ensaio de transmigração é investigar a extravasação de linfócitos para o sistema nervoso central in vitro. Este método pode contribuir para o aprofundamento do nosso entendimento sobre doenças inflamatórias do sistema nervoso central e para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Algumas vantagens desta técnica são sua fácil acessibilidade e a possibilidade de análise de populações raras de linfócitos em nível de célula única.Este método pode fornecer informações sobre a transmigração de linfócitos através da barreira hematoencefálica e pode ser aplicado ao estudo da transmigração por meio da barreira hematoencefálica liquoriana. Além disso, pode-se realizar a análise de permeação do azul de Evans para avaliar a integridade do modelo de barreira hematoencefálica. Comece cobrindo o fundo de um frasco de cultura celular T-25 com dois mililitros de solução de fibronectina recém-preparada, seguido de uma incubação de pelo menos três horas em uma estufa de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.No final da incubação, substitua a solução de fibronectina por 7,2 vezes 10 à quarta células endoteliais microvasculares do cérebro humano, ou HBMEC, em seis mililitros de meio ECM-b completo, e retorne o frasco ao incubador. Quando as HBMEC atingirem 80% de confluência, transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mililitros e lave as células aderentes três vezes com cinco mililitros de PBS. Após a terceira lavagem, adicione dois mililitros de solução de Accutase pré-aquecida às células por dois minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, bata firmemente no frasco várias vezes, confirmando o desprendimento celular por microscopia de luz. Quando as células começarem a se soltar do fundo do frasco, use o sobrenadante colhido para lavar o frasco repetidamente até que a maioria das HBMEC esteja ressuspensa. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio ECM-b fresco para contagem.Para preparar os insertos de cultura celular para um ensaio de transmigração, adicione primeiro 100 microlitros de solução de fibronectina a cada inserto e a um poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Após três horas a 37 graus Celsius, substitua a solução de fibronectina por 100 microlitros de HBMEC e adicione 600 microlitros de meio ECM-b fresco aos compartimentos inferiores dos insertos de cultura celular. Em seguida, devolva as placas ao incubador de cultura celular por três a quatro dias.Para testar se a integridade da barreira foi alcançada, aspire o meio dos compartimentos inferior e superior de um inserto de cultura celular e adicione 100 microlitros de solução de azul de Evans recém-preparada ao inserto. Adicione 600 microlitros de PBS suplementado com B27 ao compartimento inferior e retorne a placa ao incubador. Após uma hora, use pinça para remover cuidadosamente o inserto e transfira 100 microlitros de PBS com B27 do compartimento inferior para duas poças individuais de uma placa preta de poliestireno, de fundo plano, com 96 poças.Em seguida, carregue a placa em um leitor multifuncional de microplacas e determine a posição z ideal. Para determinar a função de barreira das HBMEC, meça a excitação da solução do corante azul de Evans usando as configurações apropriadas e compare os dados obtidos com uma curva padrão que represente a permeação do azul de Evans através das HBMEC em diferentes pontos temporais após a semeadura. Após confirmar a formação da monocamada celular, ressuspenda a amostra de células mononucleares do sangue periférico, ou PBMC, em uma concentração de cinco vezes 10 à sexta células por mililitro em meio RPMI suplementado com B27.Em seguida, aspire o meio dos compartimentos inferior e superior do número apropriado de inserts de cultura celular contendo monocamadas confluentes de HBMEC, e adicione 100 microlitros de PBMC por doador aos inserts de cultura celular e a um poço de uma placa de 24 poços por controle in vitro. Adicione 600 microlitros de RPMI mais B27 aos compartimentos inferiores dos inserts de cultura celular e 500 microlitros aos poços de controle in vitro, e retorne as placas ao incubador de cultura celular por seis horas. Ao final da incubação, use pinça para remover os inserts de cultura celular, lavando cuidadosamente as bases com 400 microlitros de PBS sem tocar nas membranas.Em seguida, misture bem 20 microlitros de Fluoresferas Flow-Count com as células nos poços experimentais e de controle in vitro e transfira um mililitro das suspensões resultantes de PBMC para os tubos apropriados de citometria de fluxo. Recolha as células por centrifugação e adicione os anticorpos conjugados a fluorocromos de interesse em 100 microlitros de tampão para citometria de fluxo a cada amostra. Após 30 minutos a quatro graus Celsius, lave as células com 250 microlitros de tampão fresco para citometria de fluxo e reconstitua os pellets no volume apropriado de tampão para citometria de fluxo para análise.Quando todos os dados tiverem sido adquiridos, abra o software apropriado de análise de citometria de fluxo. Para analisar a transmigração da subpopulação de células NK, selecione primeiro os linfócitos em um gráfico de dispersão lateral versus dispersão frontal e exiba as células em um gráfico de pontos de CD3 versus CD56. Em seguida, selecione as células NK positivas para CD56 e negativas para CD3.Para distinguir entre os subconjuntos de células NK transmigradas, exiba as células em um gráfico de CD56 versus CD16 e selecione as células CD56bright, CD16dim ou negativas e as células CD56dim, CD16-positivas. Em seguida, selecione as Fluoresferas Flow-Count a partir de um gráfico de dispersão para frente versus dispersão lateral. Para determinar o número de microesferas, exiba os dados selecionados em um gráfico de um canal que cubra um comprimento de onda de emissão entre 525 e 700 nanômetros versus tempo.Por fim, determine a porcentagem de células NK migradas como a razão entre o número total de células migradas e o número total de células no controle in vitro. Após três a quatro dias de cultivo, as HBMEC expressaram a molécula de junção apertada Zonula occludens-1 e cresceram em monocamadas que exibem resistência elétrica transendotelial e reduzida permeação do corante azul de Evans. A estimulação da monocamada de células endoteliais com interferon gama e TNF alfa por 24 horas antes de um ensaio de transmigração de PBMCs inteiros resulta em um aumento da migração de todas as populações de linfócitos analisadas.Curiosamente, as células NK CD56bright, CD16dim ou negativas exibem uma capacidade migratória maior do que as células NK CD56dim, CD16-positivas, tanto em HBMEC não estimuladas quanto em HBMEC ativadas por citocinas. Embora o aumento relativo da transmigração através de uma monocamada celular inflamada seja maior globalmente para as células CD56dim, isso imita as observações in vivo de que as células NK CD56bright, CD16dim-negativas estão enriquecidas no compartimento intratecal. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em até 10 horas.O pré-tratamento da montagem de transmigração in vitro com interferon gama e TNF alfa permite o estudo da migração de linfócitos sob condições inflamatórias. Nosso protocolo pode ser modificado mediante a aplicação de forças de cisalhamento ou pelo cultivo em co-cultivo com outras células da barreira hematoencefálica, como astrócitos, para fornecer um modelo aprimorado de transmigração de linfócitos para o sistema nervoso central. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como investigar a transmigração de linfócitos utilizando um modelo in vitro da barreira hematoencefálica humana.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma investigação experimental da transmigração de linfócitos através de um modelo de endotélio de barreira hematoencefálica (BBB). Uma monocamada de células endoteliais microvasculares do cérebro humano (HBMECs) é gerada in vitro, e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) contendo linfócitos são adicionadas à monocamada. As células são então incubadas para permitir a transmigração de linfócitos e as células migradas são quantificadas usando citometria de fluxo.

Estudando a transmigração de linfócitos através de uma monocamada de células endoteliais microvasculares

Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

Aqui, demonstramos os métodos para a quantificação na vivo de saída de leucócitos de ingênuo, inflamado e pele murino maligna. Realizamos uma Head-to-comparação de dois modelos: transdermal FITC photoconversion de aplicativo e in situ . Além disso, vamos demonstrar a utilidade da photoconversion para controlar a saída de leucócitos de tumores cutâneos.

Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

Nós apresentamos um ensaio da fluorescência para demonstrar que o amarelo de Lucifer (ly) é um marcador robusto para determinar a permeabilidade transcelulares paracelulares aparente de monolayers da pilha de hcmec/D3, um in vitro modelo da barreira Human do sangue-cérebro. Utilizou-se este ensaio para determinar a cinética de formação de monocamada confluente em células hCMEC/D3 cultivadas.

Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Neste protocolo, os linfócitos são colocados na câmara superior de um sistema de transmigração, separados da câmara inferior por uma membrana porosa. A quimiocina é adicionada à câmara inferior, o que induz a migração ativa ao longo de um gradiente de quimiocina. Após 48 h, os linfócitos são contados em ambas as câmaras para quantificar o transmigration.

Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Aqui, descrevemos um protocolo, o método de cultura de células endoteliais estendidas (EECM), que permite a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células cerebrais microvasculares semelhantes a células endoteliais (BMEC). Essas células apresentam expressão de moléculas de adesão de células endoteliais e são, portanto, um modelo de barreira hematoencefálica humana adequado para estudar interações de células imunes in vitro.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Células Semelhantes a Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais com Fenótipo Imune Maduro;

Este relatório fornece protocolos para montagem, cultura de células e ensaios na plataforma μSiM para a construção de modelos de barreira hematoencefálica.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Um método foi desenvolvido para visualizar o extravasamento de corante devido à quebra da barreira hematoencefálica (BBB), administrando dois corantes fluorescentes a camundongos em diferentes momentos. O uso do glicerol como crioprotetor facilitou a imuno-histoquímica na mesma amostra.

Avaliação da quebra da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática leve

Aprenda a analisar o extravasamento de linfócitos usando um modelo in vitro da barreira hematoencefálica humana. Este método permite estudar populações raras de células em nível individual e investigar doenças inflamatórias do sistema nervoso central.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um

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