Análise de Linfócitos extravasamento Usando um In Vitro Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

O objetivo geral deste ensaio de transmigração é investigar o extravasamento de linfócitos para o sistema nervoso central in vitro. Este método pode ajudar a aprofundar nossa compreensão das doenças inflamatórias do sistema nervoso central e no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Algumas vantagens desta técnica são que ela é facilmente acessível e permite a análise de populações raras de linfócitos em nível de célula única.

Este método pode fornecer informações sobre a transmigração de linfócitos através da barreira hematoencefálica e pode ser aplicado ao estudo da transmigração através da barreira hematoencefálica. Além disso, a análise de permeação azul de Evans pode ser realizada para avaliar a integridade do modelo de barreira hematoencefálica. Comece cobrindo o fundo de um frasco de cultura de células T-25 com dois mililitros de solução de fibronectina recém-preparada para uma incubação de pelo menos três horas em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

No final da incubação, substitua a solução de fibronectina por 7,2 vezes 10 para a quarta célula endotelial microvascular do cérebro humano, ou HBMEC, em seis mililitros de meio ECM-b completo e retorne o frasco à incubadora. Quando o HBMEC atingir uma confluência de 80%, transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mililitros e lave as células aderentes três vezes com cinco mililitros de PBS. Após a terceira lavagem, adicione dois mililitros de solução de Accutase pré-aquecida às células por dois minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, bata firmemente no frasco várias vezes, confirmando o descolamento da célula por microscopia de luz. Quando as células começarem a sair do fundo do frasco, use o sobrenadante colhido para enxaguar o frasco repetidamente até que a maior parte do HBMEC seja ressuspensa. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio ECM-b fresco para contagem.

Para preparar as inserções de cultura de células para um ensaio de transmigração, primeiro adicione 100 microlitros de solução de fibronectina a cada inserção e a um poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Após três horas a 37 graus Celsius, substitua a solução de fibronectina por 100 microlitros de HBMEC e adicione 600 microlitros de meio ECM-b fresco aos compartimentos inferiores das inserções de cultura de células. Em seguida, retorne as placas para a incubadora de cultura de células por três a quatro dias.

Para testar se a integridade da barreira foi atingida, aspire o meio dos compartimentos inferior e superior de uma inserção de cultura de células e adicione 100 microlitros de solução de azul de Evans recém-preparada à inserção. Adicione 600 microlitros de PBS suplementado com B27 ao compartimento inferior e retorne a placa à incubadora. Após uma hora, use uma pinça para remover cuidadosamente o inserto e transfira 100 microlitros de PBS B27 do compartimento inferior para dois poços individuais de uma placa de fundo plano preta de poliestireno de 96 poços.

Em seguida, carregue a placa em um leitor de microplacas multimodo e determine a posição z ideal. Para determinar a função de barreira do HBMEC, meça a excitação da solução de corante azul de Evans usando as configurações apropriadas e compare os dados adquiridos com uma curva padrão representando a permeação do azul de Evans em todo o HBMEC em diferentes pontos de tempo após a semeadura. Depois de confirmar a formação da monocamada celular, ressuspenda a amostra de célula mononuclear do sangue periférico, ou PBMC, para uma concentração de cinco vezes 10 elevado à sexta células por mililitro em meio RPMI suplementado com B27.

Em seguida, aspirar o meio dos compartimentos inferior e superior do número apropriado de inserções de cultura de células contendo as monocamadas confluentes de HBMEC e adicionar 100 microlitros de PBMC por doador às inserções de cultura de células e a um poço de uma placa de 24 poços por controle in vitro. Adicione 600 microlitros de RPMI mais B27 aos compartimentos inferiores das inserções de cultura de células e 500 microlitros aos poços de controle in vitro e retorne as placas à incubadora de cultura de células por seis horas. No final da incubação, use uma pinça para remover as inserções de cultura de células, enxaguando cuidadosamente o fundo com 400 microlitros de PBS sem tocar nas membranas.

Em seguida, misture completamente 20 microlitros de fluoroesferas de contagem de fluxo com as células nos poços de controle experimental e in vitro e transfira um mililitro das suspensões de PBMC resultantes para os tubos de citometria de fluxo correspondentes apropriados. Colete as células por centrifugação e adicione os anticorpos conjugados com fluorocromo de interesse em 100 microlitros de tampão de citometria de fluxo a cada amostra. Após 30 minutos a quatro graus Celsius, lave as células com 250 microlitros de tampão de citometria de fluxo fresco e ressuspenda os pellets no volume apropriado de tampão de citometria de fluxo para análise.

Quando todos os dados tiverem sido adquiridos, abra o software de análise de citometria de fluxo apropriado. Para analisar a transmigração do subconjunto de células NK, primeiro selecione os linfócitos em um gráfico de canal de dispersão lateral versus direta e exiba as células em um gráfico de pontos CD3 versus CD56. Em seguida, selecione as células NK CD56-positivas e CD3-negativas.

Para distinguir entre os subconjuntos de células NK transmigradas, exiba as células em um gráfico CD56 versus CD16 e porta para as células CD56bright, CD16dim ou negativas e CD56dim, CD16-positivas. Em seguida, selecione as fluoroesferas de contagem de fluxo em um gráfico de dispersão direta versus lateral. Para determinar o número do cordão, exiba os dados selecionados em um gráfico de um canal cobrindo um comprimento de onda de emissão entre 525 e 700 nanômetros em relação ao tempo.

Finalmente, determine a porcentagem de células NK migradas como a razão entre o número total de células migradas e o número total de células no controle in vitro. Após três a quatro dias de cultivo, o HBMEC expressou a molécula de junção apertada Zonula occludens-1 e cresceu em monocamadas que exibem resistência elétrica transendotelial e permeação reduzida do corante azul de Evans. A estimulação da monocamada de células endoteliais com interferon gama e TNF alfa por 24 horas antes de um ensaio de transmigração PBMC completo resulta em um aumento da migração de todas as populações de linfócitos analisadas.

Curiosamente, as células NK CD56bright, CD16dim ou negativas exibem uma capacidade migratória maior do que as células NK CD56dim, CD16-positivas em HBMEC não estimuladas e ativadas por citocinas. Embora o aumento relativo da transmigração através de uma monocamada de células inflamadas seja maior para as células CD56dim em geral, imitando as observações in vivo de que as células NK CD56 brilhantes e CD16dim-negativas são enriquecidas no compartimento intratecal. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 10 horas.

O pré-tratamento da configuração de transmigração in vitro com interferon gama e TNF alfa permite o estudo da migração de linfócitos em condições inflamatórias. Nosso protocolo pode ser modificado pela aplicação de forças de cisalhamento ou pelo co-cultivo com outras células da barreira hematoencefálica, como astrócitos, para fornecer um modelo refinado para a transmigração de linfócitos para o sistema nervoso central. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como investigar a transmigração de linfócitos usando um modelo in vitro da barreira hematoencefálica humana.