Name: Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a técnica de lavagem broncoalveolar em camundongos para analisar células inflamatórias e componentes imunes pulmonares. Este método simples e reprodutível auxilia pesquisadores em imunologia respiratória.

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HVE é um assistente de pesquisa no Departamento de biomédica Biologia Molecular da Universidade de Ghent. ERJ é suportado por UniVacFlu, número de concessão 607690. KR é suportado pela CE-FP7 FLUNIVAC projeto.

Todos os experimentos com animais descritos neste estudo foram realizados de acordo com o (lei belga 14/08/1986 e 22/12/2003, belga Real Decreto 06/04/2010) nacional e legislação europeia (directivas da UE 2010/63 / UE e 86 / 609 / CEE). Todos os experimentos com camundongos e todos os protocolos animais foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Ghent (números de licenças LA1400091 e EC2016-027). 1. Preparação <ol><li> lavado <ol><li> Prepara-se uma solução de sal equilibrada com 100 uM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). NOTA: Para medir os neis de protea no fluido BAL, recomenda-se adicionar inibidores de protease para prevenir a actividade da protease no fluido BAL. </li></ol></li><li> Cateter <ol><li> Adicione um cateter através da inserção de uma agulha de 23 G em polietileno de plástico transparente 21 de tubagem L (diâmetro interno de 0,58 mm, diâmetro exterior: 0,965 milímetros, e comprimento: 0.5 cm). cateteres pré-fabricados também pode ser usado. </li></ol></li><li> AnesthEtics <ol><li> Preparar um anestésico terminal, preferencialmente um que cause parada respiratória ( por exemplo, um barbitúrico como solução de pentobarbital de sódio (&gt; 100 mg / kg) em solução salina tamponada com fosfato (PBS)). NOTA: Recomenda-se a utilização de anestesia injectada em vez de anestesia inalatória, uma vez que a anestesia inalatória pode ter uma influência no conteúdo de fluido BAL. CO 2 , por exemplo, tem uma influência sobre o pH do sangue e consequentemente sobre a redistribuição de diferentes compostos 12 . </li></ol></li><li> Tampão de lise de glóbulos vermelhos de amónio-cloreto-potássio (ACK) <ol><li> Preparar um tampão de lise de ACK dissolvendo 8,29 g de NH4Cl e 1 g de KHCO3 em 1 L de H2O com 100 μM de EDTA; Tampão de lise de células vermelhas do sangue também pode ser adquirido a partir de uma fonte externa. </li></ol></li></ol> 2. Realizando a Lavagem Broncoalveolar (BAL) <ol><li> Introdução do cateter na traquéia<ol><li> Eutanásia do rato através de injecção intraperitoneal de uma dose letal de anestésico um barbiturato de curta duração, utilizando uma agulha 26 G. Para confirmar anesthetization letal adequada, aperte a pata traseira do rato com uma pinça para verificar a pé reflexo. </li><li> Colocar o animal em suas costas em uma placa cirúrgica e corrigir o mouse, fixando-se nos membros. </li><li> Spray de etanol a 70% sobre o pescoço para desinfectar. Faça uma incisão na pele do pescoço, perto da traquéia usando um bisturi. </li><li> Abra a pele para expor as glândulas salivares. Separaram-se as glândulas salivares usando pinças para expor o músculo esterno. Inciso o músculo ao redor da traquéia usando pinças para expor a traquéia. </li><li> Coloque um fio de algodão sob a traquéia usando pinças. </li><li> Cuidadosamente perfurar a meio da traqueia exposta entre dois anéis de cartilagem com uma agulha 26 G. Tome cuidado para não danificar a traqueia mais longe. </li><li> Inserir o cateter de cerca de 0,5 cm para dentro da traqueia. Certifique-se de que o catheTer não é inserido demasiado longe para baixo para dentro da traqueia, tal como isto pode conduzir a danos da estrutura do pulmão. </li><li> Estabilizar o cateter amarrando a traqueia ao redor do cateter através do fio de algodão colocados no passo 2.1.5. Se o cateter não está ligada suficientemente, a solução salina equilibrada injectado pode fluir para a parte superior do tracto respiratório em vez de para baixo para dentro dos pulmões. </li></ol></li><li> Recolhe-se o fluido de lavagem <ol><li> Carregar uma seringa de 1 mL com 1 mL de solução salina equilibrada estéril com 100 ^ M de EDTA. </li><li> Conectar a seringa de 1 mL para o cateter e suavemente injectar a solução de sal / EDTA para o pulmão. </li><li> Aspirar a solução suavemente enquanto massageia o tórax do mouse. Se o fluido aspirado não é visível na seringa, cuidadosamente inserir o cateter um pouco mais para baixo ou para cima da traqueia. </li><li> Remover a seringa da agulha e transferir o fluido de lavagem recuperado para um tubo de 15 ml colocados em gelo. Normalmente, 700-900 &amp;# 181; L de BAL é recuperado a partir de 1 mL de solução injectada. </li><li> Repita os passos 2.2.1 - 2.2.4 duas vezes mais. NOTA: Se o objetivo é analisar o conteúdo não-celular, recomenda-se concentrar as amostras agrupadas quando houver problemas com sensibilidade. </li></ol></li></ol> 3. Coleta dos Componentes Celulares e Não-Celulares do Líquido BAL <ol><li> Centrifugar o fluido de lavagem durante 7 min a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Recolher o sobrenadante e utilizá-lo imediatamente para análises adicionais ( por exemplo, ELISA) ou congelar a -80 ° C. Mantenha o sedimento celular para analisar o influxo celular nos pulmões. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 200 μL de tampão de lise de ACK. NOTA: Esta etapa garante a lise dos eritrócitos, mantendo os glóbulos brancos intactos. </li><li> Incubar durante 2 min à RT. NOTA: Para reduzir a variação causada pela lise dos eritrócitos, esta etapa não deve ser realizada por mais de 2 min. </li&gt; <li> Adicionar 1 ml de PBS frio para diluir o tampão de lise ACK. </li><li> Centrifugar durante 7 min a 400 xg e 4 ° C. Descartar o sobrenadante e re-suspender as células num volume adequado de PBS para análise a jusante (ver abaixo). NOTA: O volume de PBS depende do estudo a jusante que vai ser realizada. </li></ol> 4. Análise dos diferentes tipos de células no LBA por citometria de fluxo NOTA: Uma possibilidade é o de analisar a composição celular absoluta e relativa do fluido BAL através da realização de citometria de fluxo. O objetivo deste trabalho é elaborar a técnica de BAL. A citometria de fluxo é uma técnica especializada por conta própria. Recomenda-se ler jornais especializados na citometria de fluxo técnica de 13, 14, 15, 16, 17. Anticorpos acoplados a um fluororo tReconhecem os antigénios de superfície (ver Tabela 1 ) específicos para um ou mais tipos de células particulares. Usando uma estratégia de gating, é possível identificar células T, macrófagos, células dendríticas, células B, eosinófilos e neutrófilos na fracção celular do BAL. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antígeno </td><td> Tipo de célula </td></tr><tr><td> Cluster de diferenciação 3 (CD3) </td><td> Expresso em células T </td></tr><tr><td> Cluster de diferenciação 11c (CD11c) </td><td> Alta expressão na maioria das células dendríticas, mas também em monócitos, macrófagos, neutrófilos e algumas células B. </td></tr><tr><td> Cluster de diferenciação 11b (CDllb) </td><td> Expresso na superfície de muitos leucócitos, incluindo monócitos, neutrófilos, células assassinas naturais, granulócitos e macrófagos. </td></tr><tr><td> SiglecF </td><td> UMAMacrófagos lveolares e eosinófilos. </td></tr><tr><td> MHCII </td><td> Normalmente encontrado apenas em células apresentadoras de antígenos, como células dendríticas, fagócitos mononucleares e células B. </td></tr><tr><td> CD19 </td><td> Antígeno de linfócito B </td></tr><tr><td> Ly-6G </td><td> Um marcador para monócitos, granulócitos e neutrófilos </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Selecï¿½o de antigï¿½ios de superfï¿½ie celular imune. Esta tabela fornece uma lista de epítopos de superfície usados ​​para caracterizar os diferentes tipos de células. Serão necessárias combinações de vários marcadores para definir de forma fiável um tipo de célula específico. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Amostras </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antígeno-fluoróforo a ser adicionado às células </Td&gt; <td> Concentração de estoque de anticorpos (mg / mL) </td><td> Diluição de anticorpos </td><td> Volume total (μL) </td></tr><tr><td></td><td> Corante de viabilidade fixa </td><td> 0,2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11c </td><td> 0,2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> SiglecF </td><td> 0,2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Amostra X </td><td> MHCII </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD3 </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD19 </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11b </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> Ly6G </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Controles de tensão </Forte </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antígeno-fluoróforo a ser adicionado às células </td><td> Concentração de estoque de anticorpos (mg / mL) </td><td> Diluição de anticorpos </td><td> Volume total (μL) </td></tr><tr><td> Células não coradas </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células coloridas simples </td><td> Corante de viabilidade fixa </td><td> 0,2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células coloridas simples </td><td> CD11c </td><td> 0,2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células coloridas simples </td><td> SiglecF </td><td> 0,2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células coloridas simples </td><td> MHCII </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células coloridas simples </td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> células coradas individuais </td><td> CD19 </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> células coradas individuais </td><td> CD11b </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> células coradas individuais </td><td> Ly6G </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> controles de compensação </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antigen-fluoróforo para ser adicionado a esferas </td><td> Concentração estoque de anticorpo (mg / ml) </td><td> diluição do anticorpo </td><td> O volume total (mL) </td></tr><tr><td> pérolas não coradas </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 200 </td></tr><tr><td> pérolas manchadas individuais </td><td> CD11c </td><td> 0,2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </Td&gt; </tr><tr><td> Único, manchado, contas </td><td> SiglecF </td><td> 0,2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Único, manchado, contas </td><td> MHCII </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Único, manchado, contas </td><td> CD3 </td><td> 0,2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Único, manchado, contas </td><td> CD19 </td><td> 0,2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Único, manchado, contas </td><td> CD11b </td><td> 0,2 </td><td> 1/400 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Único, manchado, contas </td><td> Ly6G </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Lista de controles a serem incluídos. Esta tabela mostra todos os controles necessários para a interpretação correta dos resultados obtidos. <ol><li> Coloração da superfície celular NOTA: É impoPara incluir todos os controles críticos para a análise de citometria de fluxo. São necessários três conjuntos de tubos (ver Tabela 2 ): (1) tubos contendo as amostras; (2) tubos com células BAL para cada anticorpo-fluoróforo para fazer manchas únicas; Isto permite a determinação das tensões para cada canal no citómetro de fluxo; E (3) tubos com pérolas para cada anticorpo-fluoróforo para fazer manchas únicas; Isto é para determinar a matriz de compensação. <ol><li> Fazer uma mistura dos anticorpos e Fc-bloco (anti-CD16 / CD32) em PBS nas diluições apropriadas (ver Tabela 2 ). É necessário determinar a diluição de trabalho óptima para cada anticorpo antes da experiência. </li><li> Ressuspender as células em 50 μL da mistura de anticorpos para a amostra e adicionar 50 μL do anticorpo apropriadamente diluído aos controlos críticos. NOTA: A coloração pode ser realizada em uma placa de 96 poços em forma de &quot;u&quot;. Isto torna possível reduzir facilmente o volume de mancha aE executar quantidades significativas de amostras. </li><li> Incubar durante 30 min no escuro a 4 ° C. </li><li> Centrifugar durante 7 min a 400 xg e 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Re-suspender as células em PBS para um volume final de 200 μL. NOTA: Este volume final depende do volume mínimo ao qual o citómetro de fluxo pode acessar. Isso pode variar um pouco entre as máquinas. Além disso, o volume de leitura depende do número de células e / ou do tempo que a amostra demorará a correr no citómetro de fluxo. </li><li> Utilizar as amostras e os controlos para análise de citometria de fluxo. NOTA: Para determinar o número absoluto de células das diferentes populações de células, devem ser adicionadas contas. Adicione o mesmo número de esferas (± 25.000 esferas) a cada amostra imediatamente antes da medição. Utilizando dispersão directa e lateral, as contas de contagem podem ser identificadas por citometria de fluxo (ver Figura 1 ). Subsequentemente, o número absoluto de células na amostra pode ser calculadoE de eventos de cordão para eventos de célula. A seguinte fórmula pode ser usada: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55398/55398eq1.jpg" /></li></ol></li><li> Análise de citometria de fluxo NOTA: A análise de citometria de fluxo deve ser feita imediatamente após a conclusão do protocolo de coloração. Deve ser utilizado um citómetro de fluxo com lasers e filtros adequados para detecção de sinal. A Tabela 3 dá uma visão geral dos lasers e filtros necessários para o estudo descrito neste manuscrito. Para obter mais informações sobre análise de citometria de fluxo, ver Adan et al. 18 . <ol><li> Configure os portões primários com base na dispersão frontal e lateral, excluindo detritos e dupletos (consulte a Figura 1 ). </li><li> Ajustar a tensão e a compensação para a sobreposição espectral com a ajuda das células e pérolas unicamente coradas. NOTA: Estas configurações são diferentes para cada citómetro de fluxo e precisam ser verificadas antes de cada experimento. FOu análise de fluxo correto, as tensões de dispersão direta e lateral são críticas. Um correto encaminhamento lateral e lateral pode ajudar na identificação e confirmação da identidade das células analisadas. Para determinar essas tensões, uma amostra não corada deve ser executada primeiro. </li><li> Configurar portas de fluorescência para o antígeno de superfície (ver Figura 1 ) e analisar as amostras. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tipo de laser </td><td> Configuração do filtro </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 505 LP </td><td> 525/50 </td></tr><tr><td> Azul (488 nm) </td><td> 550 LP </td><td> 575/26 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td> 670 LP </td><td> 685/35 </td></tr><tr><td></td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr><tr><td> Violeta 405 nm </td><td></td><td> 450/50 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vermelho 633 nm </td><td></td><td> 660/20 </td></tr><tr><td> 70 mW </td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Resumo dos Láseres e Filtros do Citómetro de Fluxo utilizado neste Estudo.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

BAL é uma técnica útil para obter informações citológicas e bioquímicas em resposta a infecções ou drogas. Inicialmente, o BAL foi utilizado para gerenciar a produção excessiva de muco em pacientes humanos que sofrem de toxicidade por fosgênio 3 . Atualmente, a técnica é utilizada em humanos para investigar patogênese pulmonar, diagnóstico e manejo terapêutico de doenças 3 , 24 . Em animais de laboratório, o BAL é comumente usado para monitorar respostas inflamatórias, mecanismos imunológicos e processos de doenças infecciosas que ocorrem nas vias aéreas pulmonares 1 , 2 . Para estudar o padrão celular inflamatório em modelos de doença respiratória, o BAL deve ser seguido pela contagem de células absoluta e diferencial. Além do número absoluto de células, os números de células relativos são também de interesse. Por exemplo, modelos de reparo e câncer mostram very pequeno para não BAL contagem de células aumenta. Neste modelo, a avaliação da composição celular é útil. Usando coloração de células combinada com microscopia de luz, diferentes tipos de células, tais como eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos, podem ser identificadas com base na morfologia 25, 26, 27, 28, 29, 30. A citometria de fluxo pode ser usado para as avaliações específicas, tal como para identificar diferentes fenótipos de células T 7, 31. Para além da identificação das diferentes populações de células de infiltração, a composição não-celular do pulmão pode ser investigado utilizando BAL. Métodos tais como ELISA, imunotransferência, matriz citocina grânulo, imuno-histoquímica, e reacção em cadeia da polimerase quantitativa são realizadas no fluido de BAL a determinar citocinas, crescimentoFatores inflamatórios e outros componentes inflamatórios. Para determinar o dano pulmonar, os níveis de proteína total e lactato desidrogenase no fluido BAL também podem ser medidos 32 , 33 . Com o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico, a caracterização genômica e proteômica de componentes BAL será possível no futuro próximo. A combinação de capacidades computacionais em expansão e tecnologias de expressão génica de alto rendimento tornará possível definir perfis de expressão de genes específicos para vários estados de doença. A realização destas técnicas em fluidos BAL pode fornecer padrões de expressão de genes e proteínas para identificar as moléculas importantes envolvidas nas diferentes fases das doenças pulmonares. A principal limitação dos dados obtidos a partir do fluido BAL é a falta de comparabilidade entre os diferentes ensaios de pesquisa 3 , 9 . Existe um elevado grau deVariabilidade na técnica de lavagem eo processamento subsequente do fluido BAL. Para poder comparar cada ensaio BAL, é necessário padronizar o tipo de fluido de lavagem que é instilado, o local de instilação ea fração que deve ser analisada quanto à composição celular e não celular. Existem diferenças significativas no número de fracções de lavagem entre diferentes ensaios, variando de um a 14 vezes 34 , 35 , 36 . Esta diferença pode ter um impacto no número total estimado de células nos pulmões. É importante saber qual a fração de fluido BAL contém a maioria das células. Song et ai. Mostraram que aproximadamente 70% do número total de células foram recuperadas na fração um a três 22 . No entanto, outros relatórios sugeriram que a segunda lavagem continha mais células do que a primeira 37 , 38 </sup&gt;. Podemos concluir a partir desses estudos que uma lavagem com apenas uma fração não representa todo o pulmão, levando a má interpretação dos resultados. A composição não-celular do fluido BAL contém informações valiosas sobre o estado de saúde do pulmão 33 , 39 , 40 . Variações na diluição do fluido BAL contribuem para a diferença na quantificação da fração solúvel e, conseqüentemente, para as diferenças nos resultados entre os ensaios. Song et ai. Comparou os níveis de proteína e lactato desidrogenase de cada fracção de lavagem e concluiu que a primeira fracção de lavagem continha duas a três vezes mais do que a segunda fracção. Para obter uma amostra BAL representativa para análise, algumas considerações técnicas são cruciais. Um deles é realizar anestesia adequada. É muito importante verificar a referência do péLex do rato para assegurar sedação terminal. Isto não é apenas importante por razões éticas, mas também porque é difícil colocar e reter o cateter na posição correcta se o rato não for adequadamente anestesiado. Uma segunda consideração técnica importante é a posição do cateter na traquéia. Quando o cateter é inserido muito profundo, pode danificar a estrutura pulmonar. A extremidade distal do cateter não deve atingir os pulmões durante o procedimento BAL. O cateter também deve ser estabilizado e amarrado com um fio de algodão. Se o cateter não está estabilizado, a solução salina injetada pode fluir para cima na cavidade nasal em vez de para dentro dos pulmões. Durante a injecção ea aspiração da solução salina, é importante manter o cateter estável. Os dados obtidos a partir do fluido BAL devem representar o pulmão murino inteiro. Portanto, é importante incutir um volume adequado de tampão salino ( ie3 mL, dividido em 3 aluotas de 1 mL de cada vez). Não existe uma relação linear entre o rendimento de células e o rendimento de fluido BAL. É importante recolher a solução suavemente enquanto massageia o tórax do mouse. Se as forças de cisalhamento são demasiado forte, a viabilidade, a função e estrutura de células dentro do fluido das vias aéreas e LBA pode ser comprometida. Se o fluido aspirado não é visível na seringa, cuidadosamente mover o cateter mais profunda ou superior na traqueia. atenção especial deve ser dada aos aspectos específicos de processamento e análise BAL. Isto vai maximizar a informação retida a partir de amostras de BAL. Depois de BAL, as células estão em um meio salino pobre em nutrientes. É, portanto, muito importante para processar as amostras dentro de 1 h após a amostragem BAL. Se o armazenamento prolongado é necessário, é necessária a utilização de um meio suplementado com nutrientes. Para preservar a viabilidade das células, os tubos evitar que promovem a aderência das células à superfície. Evite ceNtrifugação de suspensões de células a velocidades que são susceptíveis de comprometer a integridade celular ou para evitar uma ressuspensão uniforme das células BAL recuperadas. As células que contêm fluido BAL devem ser centrifugadas a 400 xg e 4 ° C durante 7 min. É importante ter em mente que as suspensões celulares devem ser mantidas a 4 ° C durante o processamento.

As vias aéreas encontram inúmeros insultos, que podem levar a inflamação, invasão de patógenos ou transformação maligna. As células epiteliais que revestem o lúmen pulmonar formam uma das principais barreiras do corpo de mamíferos. Juntamente com os macrófagos alveolares, eles impedem que as ameaças ambientais ganhem entrada no sistema sistêmico através das vias aéreas. Exemplos de tais ameaças incluem produtos químicos orgânicos e inorgânicos, bactérias e vírus. Do mesmo modo, imunizações específicas ou intervenções terapêuticas podem ser concebidas para atingir os pulmões. Em todos estes casos, uma análise elaborada da resposta evocada é importante para compreender, intervir ou evitar processos biológicos que ocorrem dentro do sistema respiratório. O lavado broncoalveolar (BAL) é um método inestimável para analisar tais respostas, pois as amostras resultantes contêm informações importantes sobre as respostas inflamatórias, mecanismos imunológicos e progressão da doença infecciosaque podem ocorrer nas vias aéreas pulmonares 1, 2. Usando BAL, é possível estudar as células infiltrantes. Isto contrasta com os pulmões digerida, que dão uma população de células &quot;mais sujo&quot;, com muitas células mortas e pegajosas. BAL é realizada através da introdução de uma solução salina nos bronquíolos terminais e, posteriormente, recuperar esta solução. A solução obtida pode em seguida ser utilizada para quantificar e fenotipicamente analisar pulmão residentes e células inflamatórias infiltrantes. Este método é frequentemente aplicado para estudar influxo celular em modelos de doenças das vias respiratórias, tais como asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), e modelos de doenças infecciosas. Para além da composição celular, a composição molecular das vias aéreas pulmonares reflecte-se também no fluido BAL. Para analisar esta,-ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), imunotransferência, e a análise simultânea de múltiplos citocinas por uma variedade de citoquinas pode ser grânuloRealizado para avaliar a presença de citocinas e quimiocinas. O BAL é um método bem estabelecido para estudar o influxo de células inflamatórias em modelos animais de doenças respiratórias inflamatórias. A observação de um influxo celular alterado ( por exemplo, níveis aumentados de linfócitos, eosinófilos ou neutrófilos) pode levar a uma melhor compreensão da doença e pode ser um parâmetro objetivo para avaliar o desempenho de uma intervenção terapêutica. A interpretação precisa e reprodutível da análise celular BAL requer que o BAL seja realizado correctamente e que o fluido recolhido seja manuseado e processado adequadamente. O termo &quot;lavagem brônquica&quot; foi introduzido há mais de oitenta anos por Stitt 3 . Em 1961, Myrvik obteve macrófagos alveolares do fluido de lavagem de pulmões de coelho 3 . BAL é agora um método comumente usado para analisar e monitorar os pulmões no modelo de rato,Ainda não há relato de um procedimento BAL padronizado na literatura científica 4 , 5 . Além disso, há provavelmente tantas maneiras de executar BAL quanto há laboratórios de pesquisa usando a técnica 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . É importante que os dados obtidos a partir do BAL representem todo o pulmão murino e não apenas uma parte do pulmão. Este tipo de variabilidade complica a interpretação e comparação de resultados entre os diferentes ensaios. Aqui, descreve-se um procedimento BAL básico, barato e reprodutível que permite a recolha da fracção celular e solúvel presente no lúmen das vias respiratórias do rato. Em resumo, um cateter é colocado na traquéia expostafa rato terminal anestesiado. Uma seringa é ligado ao cateter, e uma solução salina tamponada contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) é introduzido nos pulmões. O lúmen dos pulmões é amostrado por lavagem repetida suave da solução salina utilizando o êmbolo. A pressão negativa aplicada durante este passo é mínimo para impedir o colapso das vias aéreas. Após a colheita, a BAL obtido deve ser processado ainda mais para enumerar e identificar as células por citometria de fluxo.

<table><tbody><tr><td>Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>ácido etilenondiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>irritante</td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 agulha</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>tamanho: 0,60 x 30 mm</td></tr><tr><td>26 G x 1/2 agulha</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004512</td><td>tamanho: tubo de plástico de 0,45 x 12 mm</td></tr><tr><td></td><td>Tecnologia médica BD</td><td>427411</td><td>Tubo de polietileno, ID 0,58 mm (0,023") OD 0,965 mm (0,38") 30,5 m (100')</td></tr> <tr><td>pentobarbital de sódio</td><td>Kela NV</td><td>514</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS sem Ca2+ Mg2+ ou vermelho de fenol; seringas estéreis filtradas</td></tr><tr>de<td>1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td>pinça não pirogênica e não tóxica</td></tr><tr><td>Fine</td><td>Science Tools GmbH&nbsp;</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Fine Science Tools GmbH&nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga 50 mL</td><td>TH. Geyer</td><td>7696705</td><td>Livre de tubo de centrífuga Rnase/Dnase/endotoxina</td></tr><tr><td>15 mL</td><td>TH. Geyer</td><td>7696702</td> Livre de tubo de microcentrífuga <td>Rnase/Dnase/endotoxina</td></tr><tr><td>1,5 mL</td> Microcentrífuga <td>de polipropileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0030 120.094</td></tr><tr><td>Centrífuga Centrífuga</td><td></td> Sigma-Aldrich <td></td> 5415R Thermo Fisher Scientific 75004030 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) Lonza 10-548E filtrado estéril <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vivo/morto - efluor 506</td><td>ebioscience</td><td>65-0866-18 &nbsp;</td><td>Corante de viabilidade fixável</td></tr><tr><td>CD11c-PE-cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF-PE</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>552126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MHCII-APCefluor780</td><td>Biolegend</td><td>107628&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE-cy5</td><td>VWR</td><td>55-0031-U100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE-cy5</td><td>eBiosciences</td><td>15-0193-83&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-V450</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>560455&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G-AF700</td><td>Biolegend</td><td>127621</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Contagem Absoluta</td><td>Life Technologies Europe B.V.&nbsp;</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>96-well 340 &micro; l placa de armazenamento</td><td>Falcon</td><td>353263</td> fundo <td>em V,</td></tr><tr><td>citômetro de fluxo</td> de polipropileno natural <td>BD Biosciences cateter BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>393202</td><td></td></tr></tbody></table>

lavagem broncoalveolar de pulmões murinos para analisar a infiltração de células inflamatórias

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lavagem Broncoalveolar (BAL) é um procedimento experimental que é usada para examinar o conteúdo celular e acelular do lúmen dos pulmões ex vivo para ter uma visão do estado de doença em curso. Aqui, um método simples e eficiente é descrito para executar BAL em pulmões de murino sem a necessidade de ferramentas ou equipamentos especiais. fluido BAL é isolado por meio de inserção de um cateter na traqueia de ratos anestesiados terminalmente, por meio do qual uma solução salina é instilada nos bronquíolos. O fluido instilado é suavemente retraído para maximizar a recuperação de fluido BAL e para minimizar as forças de cisalhamento. Esta técnica permite a viabilidade, a função e estrutura de células dentro das vias aéreas e LBA a ser preservada. Inúmeras técnicas podem ser aplicadas a ganhar mais compreensão do estado de doença do pulmão. Aqui, uma técnica vulgarmente utilizada para a identificação e contagem de diferentes tipos de células imunitárias éDescrito, em que a citometria de fluxo é combinada com um painel seleccionado de marcadores marcados fluorescentemente com uma superfície celular específica. O procedimento BAL aqui apresentado também pode ser utilizado para analisar agentes infecciosos, constituintes fluidos ou partículas inaladas dentro de pulmões murinos.

Após a realização de BAL com 3x 1 mL de solução salina tamponada, um volume entre 2 e 3 mL deve ser recuperado. Este fluido BAL pode ser analisado adicionalmente para caracterizar o conteúdo celular e não celular. Para investigar a presenï¿½ de citocinas e quimiocinas, ELISA 19 , imunotransferï¿½cia 20 , e a anï¿½ise simultï¿½ea de citoquinas mï¿½tiplas por um conjunto de esferas de citoquinas 21 pode ser realizada. Além disso, a albumina eo conteúdo protéico total deste fluido podem ser determinados 22 . Como exemplo, este manuscrito descreve como analisar o conteúdo celular do fluido BAL por citometria de fluxo. O fluido BAL analisado foi recolhido a partir de murganhos Balb / cAnNCrl fêmeas (idade: 7 semanas) 24 h depois de serem incutidos intratraquealmente com lipopolissacárido. Os anticorpos seguintes, acoplados a um fluoróforo, wForam utilizados para identificar os diferentes tipos de células: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g e CDllb (ver Tabela 1 e Tabela de Materiais ). O corante de viabilidade fixï¿½el foi tambï¿½ utilizado. Utilizando uma estratégia de gating baseada na expressão diferencial de antigénios nas superfícies das diferentes populações celulares ( Figura 1 ), foi possível identificar macrófagos, células dendríticas, células B, células T, neutrófilos e eosinófilos. Primeiro, os detritos e duetos foram fechados com base nos parâmetros de dispersão direta e lateral. Um corante de viabilidade facilitou o bloqueio das células vivas. Em seguida, foram identificadas células CD11c elevadas e células CD11c baixas. Na população elevada CD11c, os macrófagos e células dendríticas foram identificados com base na expressão de MHCII e SiglecF, respectivamente. Na população CD11c baixa, as células T e células B foram identificadas com base na expressão de CD3ε e CD19, respectivamente. EmA população celular restante, neutrófilos e eosinófilos foram identificados com base na expressão de marcador CD11b e Ly-6G, respectivamente. As contas de contagem foram adicionadas para determinar o número de células absoluto das diferentes populações de células comparando a razão de eventos de cordão com os eventos de célula 23 . Estas contas de contagem foram identificadas com base nas suas propriedades de dispersão directa e lateral ( Figura 1 ). A Tabela 4 dá uma visão geral dos números de células absolutos das diferentes populações de células no fluido BAL de um rato naive e de um rato que foi estimulado durante 24 h com 5 μg de lipopolissacárido. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55398/55398fig1.jpg" /> Figura 1: Estratégia de passagem para a detecção por citometria de fluxo de macrófagos, células dendríticas, células T, células B, neutrófilos e eosinófilos iFluido de BAL n. células de BAL foram isolados utilizando o protocolo descrito BAL. As células foram isoladas a partir de ratinhos 24 h após a instilação intratraqueal de lipopolissacarídeo. grânulos e contagem de células foram identificados com base em propriedades prospectivas e lado-dispersão. No portão de células, as células isoladas foram identificados utilizando dispersão frontal e lateral. Neste último população, as células que estavam vivos foram identificados. Células de alta CD11c e células de baixa CD11c foram então identificados. Na população elevada CD11c, macrófagos e células dendríticas foram identificados com base na expressão MHCII e SiglecF, respectivamente. Na população de baixa CD11c, as células T e as células B foram identificados com base na expressão CD3ε e CD19, respectivamente. Na população de células remanescente, neutrófilos e eosinófilos foram identificados com base na expressão de CD11b e Ly-6G, respectivamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55398/55398fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma</a>Versão maior desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> População celular </td><td> Número absoluto de células em ratos ingênuos </td><td> Número absoluto de células em ratos estimulados com LPS </td></tr><tr><td> Macrófagos </td><td> 79.612 </td><td> 25 439 </td></tr><tr><td> células dendríticas </td><td> 495 </td><td> 671 </td></tr><tr><td> Células T </td><td> 45.271 </td><td> 28.089 </td></tr><tr><td> Células B </td><td> 4.164 </td><td> 2.926 </td></tr><tr><td> Neutrófilos </td><td> 632 </td><td> 566.716 </td></tr><tr><td> Eosinófilos </td><td> 3.483 </td><td> 4.332 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: RepresenResultados da Análise de Citometria de Fluxo sobre o Fluido BAL de Ratinhos Estimulados por Naïve e LPS.

O estado de saúde do pulmão é refletido pelo tipo e número de células imunes que estão presentes nos bronquíolos do pulmão. Descrevemos uma técnica de lavagem broncoalveolar que permite o isolamento e estudo de células não aderentes e fatores solúveis do trato respiratório inferior de camundongos.

Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

O objetivo geral deste procedimento é colher o conteúdo celular e acelular do lúmen pulmonar por meio de lavagem broncoalveolar para análises ex vivo e para avaliação do estado atual da doença no animal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imunologia respiratória sobre mecanismos imunes induzidos por infecção e inflamação, por meio da quantificação das respostas inatas celulares e humorais no pulmão. As principais vantagens desta técnica são sua simplicidade, eficiência, alta reprodutibilidade e a ausência de necessidade de equipamentos ou ferramentas especiais.Antes de iniciar o procedimento, crie um cateter inserindo uma agulha de calibre 23 em um pedaço de 0,5 centímetro de tubo plástico transparente de polietileno de calibre 21 e posicione o animal em posição supina. Prenda as patas do camundongo e desinfete o pescoço com etanol 70%. Em seguida, use um bisturi para fazer uma incisão na pele próxima à traqueia.Abra a pele para expor as glândulas salivares e use uma pinça para separar as glândulas e revelar o músculo hioide esternal. Use a pinça para incisar o músculo ao redor da traqueia. Quando for visível, use a pinça para passar um fio de sutura de algodão sob o tecido traqueal.Em seguida, use uma agulha de calibre 26 para perfurar cuidadosamente o centro da traqueia entre dois anéis cartilaginosos e insira o cateter pré-fabricado cerca de 0,5 centímetros na luz traqueal. Estabilize o cateter com o fio de sutura. Então, carregue uma seringa de um mililitro com um mililitro de solução salina balanceada estéril, suplementada com 100 micromolar de EDTA.Conecte a seringa carregada ao cateter e injete suavemente a solução salina balanceada e EDTA no pulmão. Quando toda a solução salina tiver sido injetada, aspire suavemente a solução enquanto massageia o tórax. É muito importante ser gentil ao injetar e recolher o fluido para maximizar a recuperação do fluido de lavagem broncoalveolar e minimizar as forças de cisalhamento.Se o fluido sólido passar pelo nariz, reative a sutura ao longo do cateter. Quando todo o aspirado tiver sido coletado, transfira o fluido para um tubo de 15 mililitros sobre gelo e repita a lavagem mais duas vezes. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em sete minutos, se realizada corretamente.Após a terceira coleta de lavado broncoalveolar, centrifugue o aspirado em pool e armazene o sobrenadante a -80 graus Celsius. Re-suspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de lise ACK. Após não mais de dois minutos à temperatura ambiente, dilua o tampão de lise com um mililitro de PBS frio e recupere as células por centrifugação.Re-suspenda o pellet no volume apropriado de PBS conforme o número de amostras a serem analisadas e distribua as células no número adequado de poços de uma placa de 96 poços para a análise. Colete as células por meio de uma nova centrifugação e re-suspenda os pellets em 50 microlitros de FC Block e PBS. Após 10 minutos à temperatura ambiente, adicione 50 microlitros da mistura apropriada de anticorpos de interesse a cada poço e incube as células por 30 minutos a 4 graus celsius, protegidas da luz.Após o término da incubação, centrifugue a placa e descarte o sobrenadante, re-suspendendo os pellets em um volume final de 200 microlitros de tampão FAX por poço para análise por citometria de fluxo. Utilizando uma estratégia de seleção baseada na expressão diferencial de antígenos nas superfícies de várias populações celulares do lavado broncoalveolar, é possível identificar diversos tipos de células imunes. As células e os singletes são selecionados com base em suas propriedades de dispersão para frente e dispersão lateral.As células negativas para o corante vivo/morto são selecionadas, seguidas pela identificação das células Cd11c Alta e Cd11c Baixa. Na população Cd11c Alta, macrófagos e células dendríticas podem ser identificados com base na expressão de MHC-II e SinglecF, respectivamente. Na população Cd11c Baixa, células T e células B podem ser identificadas com base na expressão respectiva de CD3/CD19 e MHC-II.Nas células restantes, eosinófilos e neutrófilos podem ser identificados pela expressão de seus marcadores Cd11b ou Ly-6G, respectivamente. Contadores de microesferas também podem ser adicionados para determinar os números absolutos de células das diferentes populações celulares, comparando a proporção de eventos de microesferas em relação aos eventos celulares, por exemplo, em animais ingênuos versus estimulados com LPS. Após a coleta do fluido BAL, outras técnicas, como ELISA, immunoblot e arranjo de microesferas para citocinas, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais sobre o conteúdo acelular do fluido BAL.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores da área de imunologia explorarem o conteúdo celular e acelular do lúmen pulmonar de camundongos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar de forma eficiente e reprodutível a lavagem broncoalveolar (BAL).

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós ilustramos não-cirúrgico de entrega de materiais de teste para os pulmões de ratos anestesiados através da traquéia. Este método permite a exposição de pulmão a patógenos virais e bacterianas, citocinas, anticorpos, miçangas, químicos ou corantes. Iremos descrever colheita e processamento dos pulmões e dos gânglios linfáticos de drenagem de pulmão (LDLNs) para citometria de fluxo.

Não-cirúrgico instilação endotraqueal de camundongos com Análise de Pulmões e Drenagem Linfática Nodes Lung por citometria de fluxo

Fonte: Venuprasad, K., et al. Administração intratraqueal de Haemophilus influenzae em modelos de camundongos para estudar a inflamação das vias aéreas. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a coleta e o processamento do fluido de lavagem broncoalveolar de um camundongo sacrificado infectado com Haemophilus influenzae não tipável para análise a jusante.

Coleta de fluido de lavagem broncoalveolar de um modelo de camundongo infectado com Haemophilus influenzae não tipável

Este vídeo demonstra o uso da citometria de fluxo para identificar e contar várias células imunes no fluido de lavagem broncoalveolar. Inicialmente, células imunes únicas são identificadas usando um corante de viabilidade, seguido pela coloração diferencial de proteínas marcadoras de superfície, permitindo a enumeração precisa de cada tipo de célula.

Identificação e Enumeração de Células Imunes no Lavado Broncoalveolar por Citometria de Fluxo

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para identificar células imunes que residem em pulmões murinos. Depois de isolar as células-alvo do tecido pulmonar murino, elas são marcadas na superfície usando um coquetel de anticorpos marcados com fluoróforo contra marcadores específicos em células imunes inatas e adaptativas. Além disso, monócitos, macrófagos e células dendríticas são marcados usando um marcador intracelular. Os vários tipos de células imunes são então identificados usando...

Um método in vitro para identificar células imunes inatas e adaptativas que residem em pulmões murinos

A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.

A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

Descreve-se um método para a indução de inflamação pulmonar neutrofílica desafio por aerossol para lipopolissacarídeo por nebulização, para modelar a lesão pulmonar aguda. Além disso, também são descritas as técnicas cirúrgicas básicas para isolamento pulmonar, intubação traqueal e lavado bronco-alveolar.

Um método para gerar Pulmonar Neutrofilia Usando Aerosolized Lipopolysaccharide

Embora o estudo in vitro das interações patógeno-hospedeiro permita a caracterização de respostas imunes específicas, modelos in vivo são necessários para observar os efeitos de respostas complexas. Usando a exposição a Candida albicans seguida de infecção pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, estabelecemos um modelo murino de interações microbianas envolvidas na patogenicidade da pneumonia associada à ventilação mecânica.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Neste estudo, apresentamos um protocolo eficaz e reprodutível para isolar as populações imunes do sistema respiratório murino. Também fornecemos um método para a identificação de todas as células imunes inatas e adaptativas que residem nos pulmões de camundongos saudáveis, usando um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores.

Análise Citométrica de Fluxo para Identificação das Células Imunes Inatas e Adaptativas do Pulmão murino

Aqui, descrevemos a medição da tosse usando um sistema de pletismografia de corpo inteiro (WBP) não invasivo e em tempo real e os procedimentos normativos para a coleta de amostras de tecido de camundongos e introduzimos alguns métodos para avaliar a inflamação das vias aéreas.

Métodos para detectar tosse e inflamação das vias aéreas em camundongos

Aprenda a técnica de lavagem broncoalveolar em camundongos para analisar células inflamatórias e componentes imunes pulmonares. Este método simples e reprodutível auxilia pesquisadores em imunologia respiratória.

Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias

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