Name: A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a técnica de sobreposição líquida para formar esferoides multicelulares uniformes em placas de 384 poços. Este método reduz a perda de meio de cultura e melhora a reprodutibilidade em ensaios de biologia celular e oncologia.

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Este trabalho foi financiado por doações do Ministério checo da Educação, Juventude e Desporto (LO1304) e da Agência Tecnológica da República Checa (TE01020028). Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lakshman Varanasi para tirar as imagens estáticas de tampas ambientais.

1. Preparação de placas de agarose revestidas <ol><li> Pesar 0,75 g de agarose de baixo ponto de fusão e adicioná-lo para 100 mL de meio de McCoy 5A (com ou sem vermelho de fenol) sem soro. Aquece-se a solução num forno de microondas e agite a cada 1-2 minutos para dissolver completamente a agarose. Autoclave a solução para esterilizá-lo. </li><li> Arrefece-se a autoclave de agarose a cerca de 70 ° C e filtra-se por uma de 500 ml, 0,22 um filtro de topo por filtração sob vácuo em uma caixa de fluxo laminar. Alíquota da solução de agarose filtrada 0,75% (FAS) em volumes menores se não estiver usando a solução inteira de uma vez. Conserva-se a solução de agarose de forma asséptica pronta-para-utilização numa sala fria a 4 ° C ou frigorífico durante até 4 semanas. </li><li> Anexar um pequeno tubo com uma cassete de plástico- ou dispensar com ponta de metal para um dispensador de reagente Combi e escorvar a cassete com 70% de etanol (EtOH) e, em seguida, com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) numa caixa de fluxo. </li><li> Antes da utilização, aquecer uma aliquota armazenado do FAS i<html> n o microondas para derreter-lo. Primeiro a cassete de distribuição com a solução de agarose e revestimento de 384 poços, cultura de tecidos (TC) tenha sido tratada com &quot;especial&quot; microplacas com 15 mL de FAS. Permitir que o de agarose em placa de arrefecer para 15-20 min antes de semear as células. Armazenar as placas revestidas com agarose assepticamente, envolvido num saco de polietileno em um quarto frio ou a 4 ° C e ao abrigo da luz directa. NOTA: Evitar o aquecimento repetido do FAS 0,75% para evitar uma mudança na concentração de agarose na solução estoque. placas revestidas com agarose pode ser armazenado durante até 2 semanas, quando armazenado sob as condições acima mencionadas. O FAS não requerem aquecimento durante o revestimento de placas. </li><li> Limpar a gaveta de distribuição por aprontá-lo com 70-80 ° C água estéril para remover qualquer agarose restante nas pontas cassete e tubos. </li></ol> 2. celular Cultura e MCTS Formação <ol><li> células HCT116 cultura humana de carcinoma colo-rectal, como descrito anteriormentelass = &quot;xref&quot;&gt; 8. </li><li> Remover o número necessário de revestidos por agarose, de 384 poços, TC-microplacas tratadas de armazenamento a frio e equilibrar-los à temperatura ambiente (TA) durante 15 min. </li><li> Prepare o distribuidor de reagente Combi para semeadura de células por priming uma cassete de tubo de distribuição padrão com etanol 70% e PBS estéril. Ajuste o volume de semeadura à ul necessária e a velocidade de distribuição de média usando os botões de ajuste manuais no distribuidor. NOTA: O processo inteiro semeadura de células é realizada sob condições estéreis e em uma caixa de fluxo laminar. </li><li> Separar as células aderentes a partir do frasco de cultura de tecido, utilizando uma enzima recombinante de células-dissociação. Adicione uma suspensão da célula em um recipiente estéril com células de semente a uma densidade de 2,5 x 10 4 culas / mL por cavidade em 50? L de meio de crescimento completo. Quando mais do que uma sementeira 384-WP, agita-se as células utilizando um agitador magnético, para evitar que se deposite no fundo do copo. </li><li> permitir que oplacas em repouso durante 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, centrifuga-se durante 15 min a 4 x g. </li><li> Enquanto isso, ter uma tampa ambiental-reduzir a evaporação e preenchê-lo com 8 mL de H 2 O esterilizada ou 5% de dimetil sul f óxido (DMSO) nos lados curtos (esquerda e direita) usando uma pipeta de 5 mL (Figura 1A). Em primeiro lugar, prescindir 4 ml de líquido de enchimento para a calha do lado esquerdo por varrer a ponta da pipeta lentamente cima e para baixo. Repita este passo com a calha do lado direito. NOTA: assegurar que o líquido acrescentado para as calhas laterais não se fundem no centro da tampa, e deixar um espaço para a troca de gás (Figura 1A). A adição de uma quantidade em excesso de H 2 O resulta na infiltração de H 2 O para o exterior da tampa e, posteriormente, nas cavidades exteriores das placas de 384 poços TC. </li><li> Encha o reservatório de líquido da placa TC 384 poços com H 2 O estéril e substituir as tampas de placas regulares com as tampas ambientais cheios de líquido (Figura 2A). </li><li> Colocar as placas num incubador rotativo a 37 ° C com 95% de humidade, 5% de CO 2, e 20% de O2, e permitir que as células se agregar em MCTSes durante 4 dias. Evitar a abertura da porta da incubadora durante muito tempo nos dias subsequentes, a fim de evitar que o nível de humidade de cair abruptamente. </li></ol> 3. meio de permuta Usando um sistema robótico <ol><li> No dia 4 após a formação MCTS, adicionar 30 mL de meio de pré-aquecido por poço utilizando um dispensador de microplacas máquina de lavar automática. Permitir que as MCTSes a crescer durante mais 3 dias. Substituir o meio regularmente a cada 3 dias, até atingir o tamanho desejado para a experimentação. </li><li> Para aspirar um volume definido de meio de cada poço, empiricamente ajustar o Z -Altura da anilha colector. Aspirar 30 ul de meio por poço e substitui-lo com 30 mL de meio fresco, pré-aquecido. NOTA: Defina a velocidade de distribuição e a velocidade com que a máquina de lavar colector viaja para baixonos poços, à taxa mais baixa para minimizar a turbulência nos poços. </li></ol> Imagem 4. Alto conteúdo de MCTS e Análise de Imagem semi-automatizado <ol><li> Imagem do MCTS em um sistema de imagem automatizado de alto conteúdo usando um objetivo ar 4X (NA 16). </li><li> Defina o tempo de exposição a 11 ms eo binning a 4 x 4. Ajuste o número e espaçamento dos -stacks z ea binning pixel como desejado para o experimento para capturar uma MCTS inteiras por poço. </li><li> Processar o passo a passo as imagens, conforme descrito no &quot;leia-me&quot;, usando uma rotina em casa escrito em linguagem de programação. Nota: O código .m e leia-me .txt arquivos estão disponíveis como arquivos de código suplementares (Figura 1B). As medidas de rotina área de MCTS, eixos maiores e menores, perímetro e solidez das imagens 2D. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55403/55403fig1.jpg" /> Figura 1:Preparação de tampas ambientais e um fluxograma da rotina de semi-automático. (A) A imagem de uma tampa ambiental de redução de evaporação preenchido com a correta (à esquerda) e excesso (direita) quantidade de enchimento líquido (neste caso, 5% DMSO). A seta indica a calha-lado curto para a adição de líquido. O asterisco indica o intervalo no meio da tampa, seguindo a adição do volume correcto de DMSO. (B) Um fluxo de trabalho que mostra os passos envolvidos na rotina de análise de imagem semi-automatizada. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55403/55403fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
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<li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li>
<li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids%3A+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Revestimento de 384 poços TC placas com filtrada Agarose A prática corrente no lote é a utilização de uma agarose de baixo ponto de fusão de 1-1,5% para revestir as placas, o que requer a agarose e / ou unidade de distribuição para ser mantido aquecido para impedir a gelificação da agarose 6. A gelificação da agarose é de interesse potencial ao preparar várias placas utilizando cassetes de distribuição de líquido com pequenas aberturas de tubos que variam entre 0,2 e 0,4...

As células cancerosas em tumores são fisiologicamente dispostos numa estrutura complexa, 3-dimensionais (3D) rodeado por matriz extracelular e células que interagem. Como quase todas as células em tecidos residir em um ambiente 3D, a necessidade de mais fisiologicamente relevante em modelos tumorais in vitro que imitam as características de tumor, resultou no desenvolvimento de várias técnicas de cultura 3D 1, 2, 3. Estes modelos estão agora a tornar-se ferramentas fundamentais de investigação para estudar o papel do microambiente do tumor em metástases de células e resposta a agentes terapêuticos em 3D 2. Além disso, em comparação com 2-dimensionais culturas de células (2d) 4, modelos 3D permitem uma melhor compreensão das interacções tumor do estroma, que afetam as vias de sinalização de células. esferóides multicelulares de tumores (MCTSes) de linhas celulares de cancro são frequentemente usados ​​na célula c 3Dmodelos ULTURA devido à sua proximidade em relação aos tumores in vivo. Dentre as diversas técnicas em uso, a técnica líquida de sobreposição (LOT) de geração de MCTS em placas revestidas de agarose ganhou um interesse significativo para a validação de otimização de chumbo e meta de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Isto é evidente a partir dos estudos recentes que foram capazes de executar telas piloto de bibliotecas de compostos em culturas MCTS usando LOT 6, 7 com sucesso. No entanto, a variabilidade de poço-a-poço na morfologia e crescimento MCTS devido à perda irregular induzida por evaporação do meio de barreiras são comuns que acompanham o lote utilizando placas de microtitulação (MPS). Consequentemente, a formação de MCTSes não uniforme compromete a importância e relevânciade dados de ensaios farmacológicos 8, 12, 13. Além dos problemas de reprodutibilidade, um outro problema prático que afecta ensaios de alto rendimento à base de lote é o revestimento das MPs com agarose quando se utiliza líquido automático unidades de fornecimento. Embora a unidade de distribuição pode ser mantido aquecido para evitar a gelificação de agarose, o entupimento da cassete de distribuição e tubagem é uma preocupação potencial para sistemas robóticos 6. Para superar alguns desses desafios, que recentemente inventou algumas modificações no lote de MCTS cultura 8. Estas modificações são baseadas principalmente em possíveis maneiras de evitar a perda de meio irregular das MPs, usando instrumentos que são comumente encontrados em laboratórios de rastreio de alto rendimento. Um procedimento pormenorizado do lote modificado para a geração de MCTSes de tamanho uniforme e reprodutível através trêsplacas de 84 poços (WPS) é aqui apresentado. O manuscrito apresenta também uma rotina semi-automatizado para a avaliação do tamanho de MCTS, particularmente em MCTSes parcialmente desintegradas, tratados com o fármaco que não têm um limite bem definido para a medição de área de secção transversal.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>McCOY's 5A Médio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8403</td><td></td></tr><tr><td>" rápido" Filtro Filtermax</td><td>TPP</td><td>99505</td><td>0.22 &mu; m, 500 mL</td></tr><tr><td>Multidrop&trade; Dispensador de Reagente Combi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>de Dispensação de Tubo Pequeno&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24073295</td><td>Ponta de metal&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa TC de 384 poços</td>Tipo <td>de placa de 6057308</td> <td>PerkinElmer</td><td>-</td></tr><tr><td>de distribuição de tubo padrão</td><td>CellCarrier Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>MicroClime Environmental Lid</td><td>Labcyte</td><td>LLS-0310</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora rotativa DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>(SteriStore)</td> <td>HighRes Biosolutions</td><td>23641</td><td>Nº de série: D00384</td></tr><tr><td>Dispensador de Máquina de Lavar Microplacas</td><td>BioTek</td><td>Modelo Não Especificado</td><td>: EL406&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de Imagem de Alto Conteúdo (CellVoyager)</td> <td>Yokogawa Electric Corporation</td><td>Não Especificado</td><td>Modelo: CV7000</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>New England Biolabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&trade; Reagente de dissociação celular recombinante expresso</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>Vermelho de fenol livre</td></tr></tbody></table>

a evaporação de redução de cultura condição aumenta a reprodutibilidade da formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Modelos de tumor que imitam de perto as condições in vivo estão a tornar-se cada vez mais popular na descoberta e desenvolvimento de medicamentos para o rastreio de potenciais drogas anti-cancro. Esferóides multicelulares (tumorais) MCTSes eficazmente imitar as condições fisiológicas de tumores sólidos, tornando-os excelentes em modelos in vitro para a optimização de chumbo e validação de alvos. Fora das várias técnicas disponíveis para a cultura de MCTS, o método líquida de sobreposição em agarose é um dos métodos mais barato para a produção de MCTS. No entanto, a transferência segura de culturas MCTS usando líquida de sobreposição para rastreio de alto rendimento podem ser comprometidas por um número de limitações, incluindo o revestimento de placas de microtitulação (MPs) com agarose e o irreproducibility de formação MCTS uniforme entre poços. MPs são significativamente propenso a efeitos de borda que resultam da evaporação excessiva de forma a partir do exterior da placa, evitando a utilização de toda a placa de drogatestes. Este manuscrito fornece melhorias técnicas detalhadas para a técnica líquida de sobreposição para aumentar a escalabilidade e reprodutibilidade da formação uniforme MCTS. Além disso, os pormenores sobre uma ferramenta de software simples, semi-automático, e universalmente aplicável para a avaliação das características de MCTS após o tratamento droga é apresentada.

A perda irregular de meio, principalmente a partir de poços periféricos, é uma questão frequentemente encontrada em MPs com volumes de cultura pequenas. Substancialmente melhores condições de cultura, tais como incubadoras com sistemas bem controlados temperatura / umidificação e deputados de redução de evaporação e tampas de placas, reduzir a perda significativa de meio através poços 8. Para medir a evaporação relativa, volumes iguais de Orange G (OG) foram adici...

A perda irregular do meio de placas de microtitulação afecta a reprodutibilidade de formação de esferóides de tumor multicelular uniforme. A melhoria das condições de cultura de forma a reduzir a perda significativa vai melhorar a reprodutibilidade de formação de esferóides e os resultados de ensaios baseados em esferóides utilizando a técnica de sobreposição de líquido.

A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

O objetivo geral deste procedimento é melhorar a escalabilidade e a reprodutibilidade da formação uniforme de esferoides utilizando uma técnica de sobreposição líquida em placas de 384 poços. A principal vantagem dessa técnica é a redução da manipulação excessiva do meio em múltiplas placas, melhorando assim a reprodutibilidade da formação de esferoides. Desenvolvemos e validamos no nosso laboratório o método de cultivo de esferoides tridimensionais para testes de triagem em artrópodes, e o nosso estudo teve como objetivo avaliar qual é o efeito de borda nas placas dos cultivos multicelulares.Hoje demonstrarei o procedimento junto com Sona, uma pesquisadora do laboratório. Inicie este procedimento pesando 0,75 gramas de agarose de ponto de fusão baixo e adicione-a a 100 mililitros de meio McCoy's 5a com ou sem vermelho de fenol e sem soro. Aqueça a solução em um micro-ondas e agite-a a cada um a dois minutos para dissolver completamente a agarose.Em seguida, autoclave a solução para esterilizá-la. Após deixar o agarose autoclavado esfriar até cerca de 70 graus Celsius, filtre-o através de um filtro de frasco de 500 mililitros com poro de zero vírgula dois dois micrômetros em uma ca

evaporation-reducing-culture-condition-increases-reproducibility

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Nós introduzimos um protocolo para a geração de um grande número (milhares a centenas de milhares) de tamanho-e esferóides uniformes tumor controlado por composição, usando placas de micropoços disponíveis no mercado.

Produção de grande número de controladas pelo tamanho Spheroids tumorais usando placas de micropoços

Aqui, descrevemos um protocolo rápido e flexível para a formação de esferoides de células 3D por meio da agregação celular. Isso é facilmente adaptado a vários tipos de células e é adequado para uso em uma variedade de aplicações, incluindo ensaios de migração celular, invasão ou anoikis, e para imagens e quantificação de interações célula-matriz.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Avaliação quantitativa do crescimento bacteriano é essencial para a fisiologia microbiana como um fenômeno de sistemas-nível de compreensão. Um protocolo para uma abordagem analítica e manipulação experimental são introduzidos, permitindo a análise precisa, elevado-throughput de crescimento bacteriano, que é um tema chave de interesse em biologia de sistemas.

Preciso, elevado-throughput análise do crescimento bacteriano

Aqui, nós apresentamos diversos métodos simples para avaliar a viabilidade e a morte em spheroids da pilha de cancro 3D, que imitam os gradientes physico-químicos de tumores in vivo muito melhor do que a cultura 2D. O modelo esferóide, portanto, permite a avaliação da eficácia do câncer de drogas com melhor tradução para as condições in vivo.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Apresentamos aqui um método que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem para gerar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sem a necessidade de transfecção genética ou vetores retrovirais. Essa estratégia é, portanto, promissora para a medicina translacional e representa um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco.

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.

Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

Esses protocolos ajudarão os usuários a sondar o metabolismo de energia mitocondrial em esferoides derivados de células cancerígenas 3D usando a análise de fluxo extracelular do Seahorse.

Explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3D únicos usando análise de fluxo extracelular

Este protocolo detalha um método para a produção de três tipos diferentes de esferoides de uma maneira que os torna adequados para triagem e análise de alto conteúdo em larga escala. Além disso, são apresentados exemplos mostrando como eles podem ser analisados nos níveis esferoide e células individuais.

Um método robusto para a produção em larga escala de spheroids para aplicativos de triagem e análise de alto conteúdo

O presente protocolo descreve uma técnica para produzir esferoides de tecido em larga escala de forma econômica usando um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D.

Geração de esferoides de tecido por meio de um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D

Apresentamos um protocolo para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade e sua caracterização fenotípica usando captura de imagens e proteômica.

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Aprenda a técnica de sobreposição líquida para formar esferoides multicelulares uniformes em placas de 384 poços. Este método reduz a perda de meio de cultura e melhora a reprodutibilidade em ensaios de biologia celular e oncologia.

A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação (Vídeo) | JoVE Journal

A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação

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