A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação

O objetivo geral deste procedimento é melhorar a escalabilidade e a reprodutibilidade da formação uniforme de esferoides usando uma técnica de sobreposição líquida em placas de 384 poços. A principal vantagem desta técnica é que ela reduz a reoperação excessiva do meio de várias placas e, assim, melhora a reprodutibilidade da formação de esferoides. Desenvolvemos e validamos o método de cultura de esferoides 3D para testes de triagem de artrópodes em nosso laboratório e nosso estudo foi avaliar qual é o efeito de borda nas placas das culturas multicelulares.

Hoje vou demonstrar o procedimento junto com Sona, um pôster do laboratório. Comece este procedimento pesando zero vírgula sete cinco gramas de agarose de baixo ponto de fusão e adicione-o a 100 mililitros de meio mccoy's 5a com ou sem vermelho de fenol e sem soro. Aqueça a solução no micro-ondas e agite a cada um ou dois minutos para dissolver completamente a agarose.

Em seguida, autoclave a solução para esterilizá-la. Depois de permitir que a agarose autoclavada esfrie a cerca de 70 graus Celsius, filtre-a através de um filtro superior de garrafa de 500 mililitros e dois micrômetros em uma caixa de fluxo laminar. Em seguida, se a solução inteira não for usada de uma só vez, aliquota-a.

Armazene esta solução de agarose pronta para uso assepticamente em uma câmara fria ou geladeira de quatro graus Celsius por até quatro semanas. Trabalhando em uma caixa de fluxo, instale um de distribuição com ponta de plástico ou metal em um dispensador de reagente combinado. Coloque o peso da tubulação em um recipiente de etanol a 70% e, em seguida, prepare o.

Em seguida, mova o peso da tubulação para um recipiente de PBS e prepare-o novamente. Em seguida, aqueça uma alíquota armazenada de solução de agarose filtrada no micro-ondas para derretê-la. Prepare o de distribuição com solução de agarose e, em seguida, inicie o protocolo para revestir microplacas tratadas com cultura de tecidos de 384 poços com 15 microlitros de solução de agarose filtrada.

Deixe a agarose na placa esfriar por 15 a 20 minutos antes de semear as células conforme descrito na próxima seção do vídeo ou armazená-las a quatro graus Celsius e longe da luz direta. Finalmente, para limpar o de distribuição, coloque o peso da tubulação em água estéril de 70 a 80 graus Celsius e pressione o botão principal no dispensador. Isso removerá qualquer agarose restante nas pontas do e nos tubos.

O seguinte processo de semeadura celular deve ser realizado em condições estéreis e em uma caixa de fluxo laminar. Comece removendo o número necessário de microplacas tratadas com cultura de tecidos de 384 poços revestidas com agarose do armazenamento refrigerado e permitindo que elas se equilibrem à temperatura ambiente por 15 minutos. Enquanto isso, prepare o dispensador de reagente combinado para visualização de células preparando um de distribuição de tubo padrão com 70% de etanol e PBS estéril.

Em seguida, usando os botões de configuração manual no dispensador, ajuste o volume de visualização para o microlitro necessário e a velocidade de distribuição para média. Use a enzima de dissociação celular recombinante para remover as células HCT116 de carcinoma colorretal humano aderente de um frasco de cultura de tecidos. Em um béquer estéril, faça um estoque de suspensão celular com células a uma densidade de 2,5 vezes 10 elevado ao quarto células por mililitro por poço em 50 microlitros de meio de crescimento completo.

Se mais de uma placa de 384 poços for semeada, use um agitador magnético para evitar que se depositem no fundo do copo. Usando um dispensador, adicione as 25 centenas de células a cada poço de uma placa de 384 poços. Deixe as placas descansarem por 30 minutos em temperatura ambiente.

Enquanto isso, pegue uma tampa de microplaca ambiental redutora de evaporação e, usando uma pipeta de cinco mililitros, dispense quatro mililitros de dimetilsulfóxido a cinco por cento na calha do lado esquerdo, varrendo lentamente para cima e para baixo. Repita este processo com a calha do lado direito. Certifique-se de que o líquido adicionado às calhas laterais não se funda no centro da tampa e deixe um espaço para a troca gasosa.

Se muito líquido for adicionado, ele penetrará no exterior da tampa e, posteriormente, entrará no poço externo da placa de cultura de tecidos 384. Após 30 minutos, examine as células ao microscópio. O repouso das placas por 30 minutos permite que as células se estabeleçam completamente no fundo do poço e próximas umas das outras, o que é importante para a formação de esferóides únicos por poço.

Centrifugue as placas semeadas por 15 minutos quatro vezes G. Após a centrifugação, encha o reservatório de líquido da placa de cultura de tecidos 384 com água estéril e substitua as tampas das placas regulares pelas tampas ambientais cheias de líquido. Coloque as placas em uma incubadora rotativa de 37 graus Celsius com 95% de umidade, cinco por cento de CO2 e 20% de oxigênio e permita que as células se agreguem em esferoides tumorais multicelulares ou MCTs por quatro dias. Evite abrir a porta da incubadora por muito tempo nos dias subsequentes para que o nível de umidade não caia abruptamente.

No quarto dia após a formação do NCTS, use um dispensador automatizado de lavadora de microplacas para adicionar 30 microlitros de meio pré-aquecido a cada poço. Coloque os MCTSs de volta na incubadora e permita que os MCTSs cresçam até atingirem o tamanho desejado para experimentação. A cada três dias, para substituir o meio, ajuste empiricamente a altura Z do coletor de lavagem e defina a velocidade de distribuição e a velocidade na qual o coletor de lavagem desce para dentro dos poços na taxa mais baixa para minimizar a turbulência nos poços.

Aspire 30 microlitros de meio por poço e substitua-o por 30 microlitros de meio fresco pré-aquecido. Em seguida, retorne as células para a incubadora. Visualize os MCTSs em um sistema de imagem automatizado de alto conteúdo usando uma objetiva de ar de quatro X com uma abertura numérica de 16.

Usando o software de imagem, defina o tempo de exposição para 11 milissegundos e o binning para quatro por quatro. Ajuste o número e o espaçamento das pilhas z e do compartimento de pixels conforme desejado para que o experimento capture um MCTS inteiro em cada poço. Processe as imagens 2D passo a passo para medir a área MCTS, o eixo maior e menor, o perímetro e a solidez.

Consulte o código m e os arquivos de texto leia-me para obter instruções específicas. Para determinar a potencial aplicabilidade da rotina, MCTSs de sete dias de idade foram tratados com diferentes concentrações dos medicamentos anticâncer, Paclitaxel, PTX, Vincristina, VCR, Oxaliplatina, OXA, Doxirrubicina, DOX, e cinco flurouracil, 5-FU, em três concentrações diferentes por quatro dias. Imagens dos MCTSs são mostradas aqui.

Essas imagens foram analisadas para determinar a área, eixos maior e menor, perímetro e solidez dos MCTSs tratados com medicamentos em comparação com os controles, CTLs. Os eixos maior e menor foram utilizados para calcular o volume geométrico. Houve uma diminuição dependente da concentração na área e no volume do MCTS após o tratamento medicamentoso.

Embora o ponto zero um micrograma por mililitro de Vincrystine e zero vírgula quatro microgramas por mililitro de Doxirubicina e cinco Fluorouracil tenham resultado em um aumento na área de MCTS, o volume foi significativamente aumentado apenas após o ponto zero zero um microgramas por mililitros de Vincrystine. O perímetro do MCTS foi significativamente diferente apenas nas concentrações mais altas de Packlitaxel, Doxirrubicina e Cinco Fleurouracil, o que afetou completamente o tamanho do MCTS. O tratamento com Packlitaxel e Vincrystine a zero vírgula dois cinco microgramas por mililitro e zero vírgula zero seis microgramas por mililitro e Doxirrubicina e Cinco Fleurouracil a 100 microgramas por mililitro, resultou em uma diminuição significativa da solidez, indicando uma desintegração completa a parcial dos MCTSs.

Tomados em conjunto, esses dados demonstram a utilidade desse método na investigação de potenciais medicamentos anticâncer. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante observar que nem todas as linhagens celulares são adequadas para um método de cultura 3D específico e diferentes linhagens celulares formam esferoides que mostram diferenças nas formas, tamanho, histologia e cinética de crescimento dos esferoides.

A rotina estimulatória que desenvolvemos permite a avaliação eficaz do tamanho do esferóide, particularmente em esferoides parcialmente desintegrados tratados com drogas que não têm um limite claramente definido para a medição da área da seção transversal. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão do fato de que a modificação presente aqui não requer nenhum equipamento ou consumível adicional e pode ser implementada rotineiramente em seu laboratório de triagem de artrópodes.