Triagens Genéticas
Telas genéticas são ferramentas críticas para definir a função genética e entender as interações genéticas. As telas normalmente envolvem genes mutant…
As telas genéticas são ferramentas importantes para identificar genes e mutações responsáveis por fenótipos de interesse, e para entender como os genes funcionam nos processos biológicos. As telas são realizadas em vários sistemas de modelos, incluindo moscas, vermes, plantas e cultura celular, e levaram à descoberta de novas vias celulares e potenciais alvos de drogas para doenças humanas.
Este vídeo fornecerá uma visão geral dos diferentes tipos de telas genéticas, explicará dois protocolos gerais para telas em vermes nematoides e mostrará algumas maneiras que as telas estão sendo aplicadas em laboratórios hoje.
Primeiro, vamos dar uma olhada no que são as telas genéticas e o que podemos aprender com elas.
As telas genéticas são baseadas na genética avançada ou reversa. Em uma tela genética avançada ou "clássica", mutações são geradas aleatoriamente no DNA de um organismo usando radiação ou produtos químicos conhecidos como mutagens. Bases adicionais também podem ser inseridas no DNA usando, por exemplo, sequências conhecidas como transposons, que podem se integrar em diferentes posições dentro do genoma e interromper a função dos genes nos quais eles inserirem. Esses tipos de inserções são frequentemente acopladas a repórteres fluorescentes para permitir a detecção direta de organismos mutantes. Quando um mutante é encontrado para exibir um fenótipo de interesse, o gene desconhecido que foi mutado pode então ser mapeado para um cromossomo e sequenciado.
A abordagem oposta ao rastreamento é uma tela genética reversa, onde os pesquisadores interrompem a expressão de muitos genes candidatos e, em seguida, procuram fenótipos mutantes resultantes dessas manipulações.
Além de mutações de "perda de função" que interrompem a atividade de um gene, as telas genéticas também podem ser baseadas em mutações de "ganho de função", que fazem com que a expressão ou funcionalidade de um gene aumente. Isso pode ser conseguido inserindo aleatoriamente elementos regulatórios genéticos no genoma, o que impulsionaria a superexpressão de um gene do qual o elemento insere a montante.
Alternativamente, em um método chamado "triagem de expressões", os pesquisadores fazem uso de bibliotecas de plasmídeos que contêm as sequências de codificação de proteínas de vários genes, e as introduzem em células onde os genes serão altamente expressos. Fenótipos resultantes podem então ser usados para entender a função genética.
Para descobrir mais informações sobre um gene ou mutação conhecido, telas modificadores podem ser usadas. Uma tela supressora começa com um mutante caracterizado, e identifica mutações adicionais que tornam o fenótipo mutante menos grave. Uma mutação supressora encontrada no mesmo gene da mutação original é referida como "intragênica", enquanto uma mutação supressora localizada em um gene diferente é considerada "extragênica".
Em contraste, as telas do intensificador identificam mutações adicionais que aumentam a gravidade de um fenótipo mutante. Estes podem ser úteis para determinar genes que são redundantes ou podem interagir funcionalmente. Se a combinação de duas ou mais mutações resultar em crescimento gravemente prejudicado ou até mesmo morte, a condição é chamada de "doença sintética ou letalidade". Uma tela para mutações sintéticas doentes ou letais revela genes que funcionam em caminhos biológicos redundantes, mas essenciais. Isso é especialmente útil, por exemplo, na identificação de múltiplos produtos genéticos que podem ser simultaneamente direcionados com drogas para matar células cancerígenas.
Agora que você entende algumas estratégias de triagem genética comuns, vamos olhar para um protocolo geral para uma tela para a frente em um organismo modelo popular, o verme nematode.
Neste exemplo, a mutagênese química será realizada com metanosetano etílico ou EMS, que funciona modificando quimicamente nucleotídeos de guanina, fazendo com que eles parem inapropriadamente com a timina em rodadas subsequentes de replicação de DNA. Como o EMS é um mutagênico e um possível cancerígeno, ele deve ser manipulado apenas quando usar uma camada dupla de luvas, e o trabalho deve ser conduzido em um capô de fumaça.
Para começar, um grande número de vermes na última fase larval são selecionados, lavados e coletados. O EMS é então adicionado aos vermes, e os vermes são incubados por várias horas para induzir mutações. Após mutagênese, o EMS deve ser removido dos vermes e inativado com hidróxido de sódio. Os vermes são então lavados várias vezes em meio de crescimento e banhados em placas de ágar.
Em seguida, vermes de aparência saudável são transferidos para novas placas recém-semeadas com bactérias como fonte de alimento e permitidas a reprodução. A prole de segunda geração pode ser exibida visualmente para fenótipos mutantes, como defeitos de locomotiva.
Agora, vamos passar por um protocolo para uma tela genética reversa em nematoides.
Uma abordagem comum para a realização de telas reversas em vermes é alimentar os animais de uma biblioteca de bactérias expressando RNAs de dupla encalhada, uma por cepa bacteriana, que derrubará a expressão de um gene candidato cada um nos vermes. Essas bibliotecas são frequentemente disponíveis comercialmente, e podem ser subculturadas para uso em telas.
Para começar, colônias únicas de bactérias contendo clones de bibliotecas individuais são cultivadas, e a produção de RNA de duplaridade é induzida. As culturas são então vistas em poços separados de uma placa com meio de crescimento nematoide e permitidas a secar em um capô de fumaça estéril.
Em seguida, os vermes são banhados nas bactérias e permitidos para se alimentar em uma câmara umidificada por três a quatro dias. Fenótipos mutantes podem ser observados rapidamente, seja nos vermes originais colocados nas placas de alimentação, ou na prole de primeira geração.
Agora que você viu como telas genéticas avançadas e reversas são realizadas, vamos discutir algumas de suas aplicações atuais.
Algumas telas genéticas são usadas para ajudar os cientistas a identificar proteínas que interagem fisicamente ou funcionam na mesma via molecular. Neste experimento, os cientistas criaram uma tela baseada em microscopia de alto rendimento para descobrir novos receptores transmembranos que ativam uma molécula de sinalização particular. Ao superexpressar uma variedade de genes em células renais embrionárias humanas contendo a proteína de sinalização fluorescente marcada, eles foram capazes de monitorar quais receptores afetam a localização subcelular da proteína.
Outra aplicação do rastreamento genético é a caracterização das interações gene-drogas. Aqui, uma biblioteca de leveduras mutantes foi gerada usando mutagênese aleatória em larga escala com inserções transposon. Cada cepa mutante foi então cultivada na presença de uma droga. O crescimento de cada cepa foi quantificado por meio de PCR seguido de microarrays ou análises de sequenciamento para determinar quais mutantes, em comparação com controles nãomutados, eram sensíveis ao tratamento medicamentoso.
Finalmente, as telas podem ser usadas para entender os genes e redes moleculares interrompidos em doenças humanas. Pesquisadores deste experimento cultivaram neurônios na presença de vírus codificadores de RNA para a expressão knockdown de muitos genes-alvo diferentes. A análise automatizada de células imunossuadas foi então usada para revelar genes que influenciam as propriedades físicas dos neurônios, como o crescimento do neurite. Essa abordagem identificou com sucesso genes envolvidos em doenças neurodegenerativas.
Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE em telas genéticas — uma técnica poderosa para descobrir os genes envolvidos nos principais processos biológicos. Neste vídeo, revisamos alguns dos principais tipos de telas genéticas, protocolos gerais para executar telas dianteiras e reversas, e discutimos como esses métodos são aplicados em laboratórios hoje. Obrigado por assistir!
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As telas genéticas são ferramentas importantes para identificar genes e mutações responsáveis por fenótipos de interesse, e para entender como os genes funcionam nos processos biológicos. As telas são realizadas em vários sistemas de modelos, incluindo moscas, vermes, plantas e cultura celular, e levaram à descoberta de novas vias celulares e potenciais alvos de drogas para doenças humanas.
Este vídeo fornecerá uma visão geral dos diferentes tipos de telas genéticas, explicará dois protocolos gerais para telas em vermes nematoides e mostrará algumas maneiras que as telas estão sendo aplicadas em laboratórios hoje.
Primeiro, vamos dar uma olhada no que são as telas genéticas e o que podemos aprender com elas.
As telas genéticas são baseadas na genética avançada ou reversa. Em uma tela genética avançada ou "clássica", mutações são geradas aleatoriamente no DNA de um organismo usando radiação ou produtos químicos conhecidos como mutagens. Bases adicionais também podem ser inseridas no DNA usando, por exemplo, sequências conhecidas como transposons, que podem se integrar em diferentes posições dentro do genoma e interromper a função dos genes nos quais eles inserirem. Esses tipos de inserções são frequentemente acopladas a repórteres fluorescentes para permitir a detecção direta de organismos mutantes. Quando um mutante é encontrado para exibir um fenótipo de interesse, o gene desconhecido que foi mutado pode então ser mapeado para um cromossomo e sequenciado.
A abordagem oposta ao rastreamento é uma tela genética reversa, onde os pesquisadores interrompem a expressão de muitos genes candidatos e, em seguida, procuram fenótipos mutantes resultantes dessas manipulações.
Além de mutações de "perda de função" que interrompem a atividade de um gene, as telas genéticas também podem ser baseadas em mutações de "ganho de função", que fazem com que a expressão ou funcionalidade de um gene aumente. Isso pode ser conseguido inserindo aleatoriamente elementos regulatórios genéticos no genoma, o que impulsionaria a superexpressão de um gene do qual o elemento insere a montante.
Alternativamente, em um método chamado "triagem de expressões", os pesquisadores fazem uso de bibliotecas de plasmídeos que contêm as sequências de codificação de proteínas de vários genes, e as introduzem em células onde os genes serão altamente expressos. Fenótipos resultantes podem então ser usados para entender a função genética.
Para descobrir mais informações sobre um gene ou mutação conhecido, telas modificadores podem ser usadas. Uma tela supressora começa com um mutante caracterizado, e identifica mutações adicionais que tornam o fenótipo mutante menos grave. Uma mutação supressora encontrada no mesmo gene da mutação original é referida como "intragênica", enquanto uma mutação supressora localizada em um gene diferente é considerada "extragênica".
Em contraste, as telas do intensificador identificam mutações adicionais que aumentam a gravidade de um fenótipo mutante. Estes podem ser úteis para determinar genes que são redundantes ou podem interagir funcionalmente. Se a combinação de duas ou mais mutações resultar em crescimento gravemente prejudicado ou até mesmo morte, a condição é chamada de "doença sintética ou letalidade". Uma tela para mutações sintéticas doentes ou letais revela genes que funcionam em caminhos biológicos redundantes, mas essenciais. Isso é especialmente útil, por exemplo, na identificação de múltiplos produtos genéticos que podem ser simultaneamente direcionados com drogas para matar células cancerígenas.
Agora que você entende algumas estratégias de triagem genética comuns, vamos olhar para um protocolo geral para uma tela para a frente em um organismo modelo popular, o verme nematode.
Neste exemplo, a mutagênese química será realizada com metanosetano etílico ou EMS, que funciona modificando quimicamente nucleotídeos de guanina, fazendo com que eles parem inapropriadamente com a timina em rodadas subsequentes de replicação de DNA. Como o EMS é um mutagênico e um possível cancerígeno, ele deve ser manipulado apenas quando usar uma camada dupla de luvas, e o trabalho deve ser conduzido em um capô de fumaça.
Para começar, um grande número de vermes na última fase larval são selecionados, lavados e coletados. O EMS é então adicionado aos vermes, e os vermes são incubados por várias horas para induzir mutações. Após mutagênese, o EMS deve ser removido dos vermes e inativado com hidróxido de sódio. Os vermes são então lavados várias vezes em meio de crescimento e banhados em placas de ágar.
Em seguida, vermes de aparência saudável são transferidos para novas placas recém-semeadas com bactérias como fonte de alimento e permitidas a reprodução. A prole de segunda geração pode ser exibida visualmente para fenótipos mutantes, como defeitos de locomotiva.
Agora, vamos passar por um protocolo para uma tela genética reversa em nematoides.
Uma abordagem comum para a realização de telas reversas em vermes é alimentar os animais de uma biblioteca de bactérias expressando RNAs de dupla encalhada, uma por cepa bacteriana, que derrubará a expressão de um gene candidato cada um nos vermes. Essas bibliotecas são frequentemente disponíveis comercialmente, e podem ser subculturadas para uso em telas.
Para começar, colônias únicas de bactérias contendo clones de bibliotecas individuais são cultivadas, e a produção de RNA de duplaridade é induzida. As culturas são então vistas em poços separados de uma placa com meio de crescimento nematoide e permitidas a secar em um capô de fumaça estéril.
Em seguida, os vermes são banhados nas bactérias e permitidos para se alimentar em uma câmara umidificada por três a quatro dias. Fenótipos mutantes podem ser observados rapidamente, seja nos vermes originais colocados nas placas de alimentação, ou na prole de primeira geração.
Agora que você viu como telas genéticas avançadas e reversas são realizadas, vamos discutir algumas de suas aplicações atuais.
Algumas telas genéticas são usadas para ajudar os cientistas a identificar proteínas que interagem fisicamente ou funcionam na mesma via molecular. Neste experimento, os cientistas criaram uma tela baseada em microscopia de alto rendimento para descobrir novos receptores transmembranos que ativam uma molécula de sinalização particular. Ao superexpressar uma variedade de genes em células renais embrionárias humanas contendo a proteína de sinalização fluorescente marcada, eles foram capazes de monitorar quais receptores afetam a localização subcelular da proteína.
Outra aplicação do rastreamento genético é a caracterização das interações gene-drogas. Aqui, uma biblioteca de leveduras mutantes foi gerada usando mutagênese aleatória em larga escala com inserções transposon. Cada cepa mutante foi então cultivada na presença de uma droga. O crescimento de cada cepa foi quantificado por meio de PCR seguido de microarrays ou análises de sequenciamento para determinar quais mutantes, em comparação com controles nãomutados, eram sensíveis ao tratamento medicamentoso.
Finalmente, as telas podem ser usadas para entender os genes e redes moleculares interrompidos em doenças humanas. Pesquisadores deste experimento cultivaram neurônios na presença de vírus codificadores de RNA para a expressão knockdown de muitos genes-alvo diferentes. A análise automatizada de células imunossuadas foi então usada para revelar genes que influenciam as propriedades físicas dos neurônios, como o crescimento do neurite. Essa abordagem identificou com sucesso genes envolvidos em doenças neurodegenerativas.
Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE em telas genéticas — uma técnica poderosa para descobrir os genes envolvidos nos principais processos biológicos. Neste vídeo, revisamos alguns dos principais tipos de telas genéticas, protocolos gerais para executar telas dianteiras e reversas, e discutimos como esses métodos são aplicados em laboratórios hoje. Obrigado por assistir!
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Q1: What is the difference between forward and reverse genetic screens?
Forward genetic screens randomly generate mutations in an organism's DNA using mutagens or transposons, then identify unknown genes responsible for phenotypes of interest. Reverse genetic screens take the opposite approach: researchers target specific candidate genes for disruption, then observe resulting mutant phenotypes. Both methods help uncover gene function and biological pathways.
Q2: How do loss-of-function and gain-of-function mutations differ in genetic screens?
Loss-of-function mutations disrupt a gene's activity, reducing its expression or function. Gain-of-function mutations increase a gene's expression or functionality, often by inserting regulatory elements that drive overexpression. Expression screening uses plasmid libraries containing protein-coding sequences to achieve gain-of-function effects and understand gene function.
Q3: What are suppressor and enhancer screens used for?
Suppressor screens identify mutations that reduce the severity of an existing mutant phenotype, revealing genes that interact or compensate for the original mutation. Enhancer screens find mutations that increase phenotype severity, helping determine redundant or functionally interacting genes. Synthetic lethality screens reveal genes in essential but redundant pathways, useful for identifying drug targets in cancer therapy.
Q4: How is chemical mutagenesis performed in nematode worms?
In forward screens using nematodes, worms at the last larval stage are exposed to ethyl methanesulfonate (EMS), a chemical mutagen that modifies guanine nucleotides, causing mispairing with thymine during DNA replication. After several hours of incubation, EMS is removed and inactivated with sodium hydroxide. Worms are then washed, plated on agar with bacterial food, and allowed to reproduce for screening.
Q5: What is the protocol for reverse genetic screening in nematodes?
Reverse screens in nematodes use bacterial libraries expressing double-stranded RNA targeting individual candidate genes. Bacteria are cultured, spotted onto plates with nematode growth medium, and allowed to dry. Worms feed on the bacteria for three to four days in a humidified chamber, and mutant phenotypes are observed in original worms or first-generation progeny.
Q6: How are genetic screens applied to identify protein interactions and drug targets?
Researchers use high-throughput microscopy-based screens to discover receptors affecting signaling protein localization by overexpressing genes in cultured cells. For drug interactions, mutant libraries are grown with drugs, and growth is quantified using detection and quantification of nucleic acids by real time PCR followed by microarray or sequencing analysis to identify drug-sensitive strains.
Q7: How can genetic screens help understand genes involved in neurodegenerative diseases?
Researchers culture neurons in the presence of RNA-encoding viruses to knock down expression of many target genes. Automated analysis of immunostained cells reveals genes influencing neuronal properties like neurite outgrowth. This approach has successfully identified genes involved in neurodegenerative diseases, demonstrating how screens uncover molecular networks disrupted in human disease.