Name: Impressão 3D de biomoleculares Modelos de Investigação e Pedagogia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a criar modelos biomoleculares em 3D acessíveis usando impressoras desktop de baixo custo. Este protocolo ensina a preparar arquivos PDB, otimizar estruturas e imprimir modelos físicos para pesquisa e educação em biologia estrutural.

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Os autores agradecem o apoio do Deis3D, do Brandeis 3D Printing Club e dos membros da Brandeis Library/LTS/Makerlab. Este trabalho foi financiado em parte por uma bolsa concedida a Pomeranz Krummel pela NSF, Prêmio nº 1157892; uma bolsa ESIT do BMBF, concedida à Universidade de Tübingen; e fundos federais dos EUA dos Institutos Nacionais de Saúde, Departamento de Saúde e Serviços Humanos, sob o Contrato nº. GS35F0373X. Gráficos moleculares e análises foram realizados com o pacote UCSF Chimera. O Chimera foi desenvolvido pelo Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics da Universidade da Califórnia, San Francisco (apoiado pelo NIGMS P41-GM103311).

1. Preparar 3D arquivos de modelo para impressão NOTA: arquivos de modelo em 3D de biomoléculas pode ser gerado através de dois métodos: (1) on-line utilizando as ferramentas automatizadas do NIH 3D impressão Troca 10, ou (2) localmente usando o software de modelagem molecular. Automaticamente modelos gerados usará os processos detalhados neste protocolo para criar representações de impressão, mas os detalhes da representação não pode ser escolhido pelo usuário. Em contraste, a geração de modelo personalizado permite ao usuário controle sobre as propriedades visuais do biomolécula. átomos individuais, resíduos, e títulos podem ser exibidos, ea escala de fitas, laços e suportes podem ser especificados. O NIH 3D impressão do Exchange ferramentas automatizadas e o protocolo abaixo ambos usam UCSF Chimera, uma modelagem molecular pacote de software livre e open source 11, que é bem adequado para a exportação de arquivos em 3D de biomoléculas. Todos os arquivos 3D exportados pelo angstroms uso Quimera paraa unidade de distância. Quando esses arquivos são importados para um software de corte na unidade mm / distância 1, os modelos serão escalonados em 10 milhões de vezes de ampliação. <ol><li> Gerar automaticamente um modelo de impressão 3D com a Bolsa de impressão NIH 3D NOTA: A Bolsa de impressão NIH 3D executa scripts Quimera, que são semelhantes às etapas descritas nos passos 1.2-1.3. <ol><li> Localize o arquivo de dados molecular da estrutura biomolecular para imprimir a partir de um banco de dados ou o PDB, EMDB, ou PubChem (suplemento 1.1). Grave o número de acesso para a biomolécula de interesse. </li><li> Navegue até a troca de impressão NIH 3D (3dprint.nih.gov) e criar uma nova conta de usuário, se um usuário de primeira vez. </li><li> Navegue até à funcionalidade &quot;Enviar Quick&quot;, digite o código de adesão de biomoléculas, e clique em enviar. </li><li> Depois de gerar o modelo da biomolécula, navegue até a página do modelo e baixar o arquivo STL biomolécula na &quot;fita&quot;Ou&quot; &quot;representação da superfície. Avance para a secção 2 do protocolo. </li></ol></li><li> Gerar um modelo personalizado molecular com UCSF Chimera NOTA: Maior detalhe sobre o uso Chimera para criação de modelos 3D, incluindo equivalentes de linha de comando para muitos passos, pode ser encontrada no suplemento 1.2. <ol><li> Baixe e instale UCSF Chimera (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). </li><li> Usando Chimera, recuperar o arquivo de dados molecular, efectuando um dos seguintes procedimentos: <ol><li> Usando o comando Arquivo barra de ferramentas&gt; Obter pelo ID, digite um código de adesão PubChem, PDB, ou EMDB para recuperar o arquivo diretamente do banco de dados. </li><li> Usando o arquivo de comando da barra de ferramentas&gt; Open, recuperar um arquivo de dados molecular local; por padrão, a molécula irá exibir fitas para proteínas e ácidos nucleicos, átomos e ligações para ligantes, e resíduos dentro de 5 Å de um ligand. </li><li> Usando a linha de comando Chimera, acessado indo a seus favoritos&gt; linha de comando, use o comando Abrir e digite o código de adesão. </li></ol></li></ol></li><li> Preparando uma representação 3D-imprimíveis de uma biomolécula NOTA: Existem várias maneiras que uma estrutura biomolecular podem ser exibidas ou representados. A seleção de uma representação específica para a impressão deve ser feita com base na melhor forma de proporcionar o maior conhecimento sobre a estrutura e função de biomoléculas. Comumente usado representações incluem &quot;fitas&quot;, &quot;superfície&quot; e &quot;átomos / obrigações.&quot; No entanto, é melhor para explorar usando uma combinação destas representações para exibir cadeias laterais seleccione ou ligandos. Além disso, a estrutura 3D-impresso deve ser suficientemente robusto para ser impresso e para não quebrar quando manuseado. Assim, é importante considerar quando se selecciona esta uma representação ou exibindo uma cadeia lateral. Also considerar a introdução de estruturas de apoio, ou &quot;escoras&quot;. Finalmente, ao imprimir o modelo, ele será importante para escalá-lo de modo a que todos os recursos serão impressos corretamente. Assim, por biomoléculas maiores, imprimindo inteiramente em fitas ou representações átomo pode não ser viável devido à escala em que estes teriam de ser impressa. <ol><li> Gerando uma representação 3D de impressão em &quot;fitas&quot; Nota: Mais detalhes podem ser encontrados no suplemento 1.2.1. <ol><li> Selecione a opção &quot;solvente&quot;, visível, que inclui íons, usando Select&gt; Estrutura&gt; solvente. </li><li> Ocultar o selecionado &quot;solvente&quot;, usando Ações&gt; Átomos / Títulos&gt; Ocultar. </li><li> Engrossar o diâmetro da fita de modo que ela pode ser impressa com sucesso. Utilize o menu Style Editor da fita em Ferramentas&gt; Representação. NOTA: Suparâmetros ggested para uma tentativa inicial: na guia Escala, alterar a altura de cada item para, pelo menos, 0,7 e a largura de cada configuração para, pelo menos, o seguinte: Bobina 0,7; Helix 1,4; Folha: 1,4; Arrow (base): 2,1; Arrow (ponta) 0,7; Nucleic 1,0. </li><li> Se um ácido nucleico está presente, alterar a representação de base com Ações&gt; Átomos / ligações&gt; objetos de nucleotídeos&gt; Configurações. Alterar a exibição açúcar / base de escada e o raio degrau para 0,6. </li><li> Opcional: Vá para a etapa 1.3.3 para introduzir estruturas de apoio. </li></ol></li><li> Gerar uma representação 3D-imprimíveis &quot;superfície&quot; da molécula NOTA: Mais detalhes podem ser encontrados no suplemento 1.2.2. <ol><li> Esconder todas as representações anteriores. Use Ações&gt; Átomos / ligações&gt; esconder, e Ações&gt; Ribbons&gt;ocultar. </li><li> Ao renderizar átomos como esferas, ajustar o raio selecionando o átomo (s) desejado e ir ao menu Ações&gt; Inspecionar. NOTA: A alteração do raio atómico padrão pode torná-lo mais fácil de distinguir diferentes tipos de átomos no modelo impresso. </li><li> Ocultar qualquer exibidas fitas, átomos, títulos e pseudobonds usando Ações&gt; Átomos / ligações&gt; Hide and Actions&gt; Ribbons&gt; Ocultar. </li><li> Se detalhe superfície é desejada, adicionar átomos de hidrogénio de modo que a superfície de cálculo é mais preciso. Usar Ferramentas&gt; Estrutura Edição&gt; TDAH. </li><li> Gerar uma superfície inserindo de surf # 0 grelha de 0,5 na linha de comando. </li></ol></li><li> Gerar uma representação 3D de impressão em &quot;átomos / obrigações.&quot; NOTA: Mais detalhes podem ser encontrados no suplemento 1.2.3. <ol><li> Esconder o solvente. UsarSelecione&gt; Estrutura&gt; solventes e, em seguida, em Ações&gt; Átomos / Títulos&gt; esconder. </li><li> Exibir resíduos específicos e / ou ligantes na representação como átomos e ligações, selecionando e mostrando-lhes com Ações&gt; Átomos / Títulos&gt; show. A forma como os átomos são representados podem ser alterados na Ações&gt; Átomos / suspensa Bonds, selecionando vara, bola e vara, ou esfera. </li><li> Depois de fazer uma seleção, aumentar o raio do pau ou bola e furar representações com as Ações&gt; menu de Inspecionar. </li><li> Opcional: Vá para a etapa 1.3.4 para introduzir estruturas de apoio. </li></ol></li></ol></li><li> Adicionando suporte estrutural para uma representação 3D-imprimíveis NOTA: Mais detalhes podem ser encontrados em suplementos 1.2.4 e 1.2.5. Nesta fase, suportes podem ser adicionadas ao modelo 3D. É recomendado para alfa-hélices e estruturas secundárias beta-folha para incluir ligações de hidrogênio de backbone para a estabilidade, apesar de pequenas proteínas (ou seja, menos de 50 resíduos) são muitas vezes representado como uma fita com uma espessura típica e pode imprimir bem sem esse apoio. No entanto, para as proteínas maiores, mesmo com a adição de ligações de hidrogénio, muitos modelos de fita ainda estão muito delicado para ser impresso com sucesso. Struts são conexões físicas dentro do modelo que não reflectem qualquer propriedade molecular, mas adicionar à resistência mecânica, facilitando, assim, a impressão e manuseio. Chimera oferece uma maneira rápida de adicionar automaticamente suportes para um modelo com o comando de braço através da linha de comando e escoras individuais podem também exibido ser manualmente utilizando a ferramenta distâncias. <ol><li> Mostrar ligações de hidrogênio para preparar uma impressão mais resistente. Utilize o menu Ferramentas&gt; Análise de estrutura&gt; FindHBond. </li><li> Usar Ferramentas&gt; Cont GeralROLS&gt; Painel de PseudoBond para modificar as ligações de hidrogênio. Selecione os pseudobonds &quot;ligação de hidrogênio&quot;, clique no botão atributos e verifique o &quot;Component PseudoBond Atributos&quot; caixa. No painel inferior, mudar o estilo de ligação de arame para manter o valor do raio e 0,2 a 0,6. </li><li> Opcional: Adicione estrutura de suporte (s), ou &quot;escoras&quot;, usando o comando struts. Para criar suportes azuis com um raio de 1,0 Å no alpha de carbono de cada 70 resíduos de não mais do que 8 Å de distância, use o comando: struts @ca comprimento 8 loop de 70 cor azul rad 1,0 fattenRibbon falsa. </li><li> Opcional: Para criar suportes individuais com a ferramenta distâncias, selecione dois átomos por shift-ctrl-clique em cada um deles, use Ferramentas&gt; Análise Estrutura&gt; Distâncias e clique em Criar para adicionar um pseudobond. Navigate para o Painel PseudoBond, selecione as pseudobonds &quot;monitor de distância&quot;, clique no botão atributos, e marque a caixa &quot;Componente PseudoBond Atributos&quot;. No painel inferior, mudar o estilo de títulos de fio de pau e o valor do raio 0,2-0,01. </li><li> Exportando a prestação Chimera como um arquivo de modelo 3D STL <ol><li> Uma vez que a representação desejada foi obtida, use Arquivo&gt; Cena Exportar para exportar o arquivo 3D. Selecione STL como o tipo de arquivo eo nome e salvar o modelo. Nota: Este arquivo STL pode ser reparado, orientado, e impresso como descrito na seção 2 do protocolo. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Arquivos do processo STL para impressão <ol><li> Arquivos de reparo STL com Autodesk Netfabb NOTA: Um modelo pode precisar de reparação quando este contém várias peças sobrepostas com intersecting geometrias, o que é geralmente o caso com os modelos de fita e modelos atômicos. Sobreposição de geometria pode causar erros quando o arquivo é lido por algum software de corte, como regiões de interseção pode ser interpretado como o exterior do modelo. Mais detalhes podem ser encontrados no suplemento 2.1. <ol><li> Baixe e instale a versão padrão do software. </li><li> Abra o programa e importar o arquivo STL de ser reparado. Se houver problemas com a malha, um sinal de alerta será exibida. </li><li> Use Extras&gt; Reparo automático de peça, selecione Repair estendida, e aguarde enquanto o arquivo é processado; para modelos pequenos, isso vai demorar alguns segundos, mas para modelos grandes, pode demorar minutos. </li><li> Clique com o botão direito do mouse sobre o modelo e selecione Exportar Parte&gt; Como STL ou usar o Project&gt; Project Exportar como STL para salvar o modelo reparado; o programa adicionará &quot;reparado&quot; aonome do arquivo para distingui-lo do arquivo original. </li></ol></li><li> Modelos Orient para imprimir com o Autodesk Meshmixer NOTA: orientação óptima de um modelo de prévia para o corte vai reduzir o número de saliências e, portanto, o número de suportes necessários durante o processo de impressão. Um modelo orientado de forma otimizada irá imprimir mais rápido, usar menos material, e ser menos propensos a falhar durante a impressão. Mais detalhes podem ser encontrados no suplemento 2.2. <ol><li> Baixe e instale o software </li><li> Importar o arquivo STL reparado no programa. </li><li> Escolha Análise&gt; Orientação. </li><li> Ajuste o valor Peso Força para 100, valor Suporte Vol Peso a 0, Suporte Área de peso para 0 e, em seguida, atualizar o modelo. Este vai rodar o modelo para minimizar o número de saliências. Aceitar a orientação resultante. </li><li> Use File&gt; Export e escolha o arquivo STL binário a partir do menu suspenso. Salve o arquivo. </li></ol></li></ol> 3. Cortando and Printing <ol><li> Selecione um material de filamento NOTA: A selecção de um material de impressão deve ser feito antes de usar um software de corte, como as configurações de impressão serão diferentes para o material selecionado. Os três materiais que são amplamente utilizados são o ácido poliláctico (PLA), elastómeros termoplásticos (TPE), e acrilonitrilo-butadieno-estireno (ABS). O PLA é geralmente o material mais eficaz para a impressão de modelos moleculares detalhados, à medida que arrefece rapidamente, adere bem à placa de construção, e raramente deforma. O TPE é um material semelhante a PLA e pode ser usada para produzir modelos flexíveis. É recomendado para modelos de superfície de proteínas complementares ou modelos de fita proteína. ABS é mais forte e mais flexível do que PLA, mas produz partículas potencialmente perigosas durante a impressão 12. geralmente não é recomendado para a impressão de modelos moleculares, como a temperatura resultados materiais mais elevados em lesé preciso produção de pequenos recursos. Mais detalhes podem ser encontrados no suplemento 3.1. <ol><li> Impressão com ácido poliláctico (PLA). <ol><li> Regule a temperatura do bocal de até 210 ° C. Para garantir a aderência da parte da cama, definir a temperatura do leito a 70 ° C. Se estiver usando uma cama sem aquecimento, cubra-a com fita adesiva dos pintores. Use arrefecimento activo. </li></ol></li><li> Impressão com elastômeros termoplásticos (TPE) <ol><li> Repita o passo 3.1.1.1. Defina a velocidade de impressão de 1.200 mm / min ou menos. </li></ol></li><li> Impressão com acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) <ol><li> Não use arrefecimento. Regule a temperatura do bico a 240 ° C. Para garantir a aderência da parte da cama, definir a temperatura do leito a 110 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Gerar G-code NOTA: O modelo será importado em 10 milhões de vezes de ampliação por padrão. modelos de fita deve ser dimensionado para 20 milhões de vezes (200%) ou maior. modelos de superfície print bem a 100% ou maior. Mais detalhes podem ser encontrados no suplemento 3.2. <ol><li> Baixe e instale o software de corte de impressão. </li><li> Use Arquivo&gt; Importar Modelo e selecione o arquivo STL reparado e orientado. </li><li> Dimensionar o modelo clicando duas vezes sobre o modelo e introduzir o factor de escala na janela do lado direito da tela. </li><li> Gerar estruturas de apoio para o modelo. Selecione o ícone de apoio e utilizar suportes normais, com uma resolução pilar de 1 e um ângulo de saliência máxima de 50 °. </li><li> Clique gerar todos os suportes. Adicionar ou remover recursos estrutura de apoio para personalizar colocação apoio. </li><li> Selecione um processo e clique em Editar configurações de processo. </li><li> Configure o perfil para a impressora e material que está sendo usado. NOTA: A jangada e brim devem ser incluídos, e os modelos de fita deve ser impresso em 100% de enchimento. configurações de perfil detalhado pode ser encontrado em supplemeNT 3,2. </li><li> Converter o modelo para um ficheiro de código G que pode ser lido pela impressora. Clique no botão &quot;preparar para imprimir&quot; e selecione o processo que contém o perfil de impressora / material. Observe o caminho do bico da impressora e inspecioná-lo para erros que podem causar uma impressão a falhar. Nota: Os erros que podem causar a impressão falhar incluem a ausência de suportes sob saliências, cavidades indesejados, camadas em falta, ou áreas que são muito finas para imprimir. </li><li> Salve o arquivo G-código para a área de trabalho ou diretamente para um cartão SD. </li></ol></li><li> Operar a impressora NOTA: Cada impressora marca ou modelo é único, e sua preparação e calibração para impressão varia de acordo. Consulte o manual da impressora. <ol><li> Certifique-se de que a estação de trabalho está conectada à impressora ou que o cartão SD com Gcode está na impressora. </li><li> Preparar a impressora carregando o filamento e para assegurar que o leito é nível;para obter instruções sobre esses procedimentos, consulte o manual da impressora. </li><li> Inicie a impressão a partir do computador ou localmente a partir de um cartão SD através do menu da impressora. </li><li> Assista a impressão até que uma primeira camada foi concluída com êxito. Se houver algum erro na primeira camada, interromper e reiniciar a impressão. </li></ol></li></ol> 4. Pós-produção de Processamento NOTA: Cuidado, claro, deve ser tomado com isso, a final, fase. estruturas de apoio sobre o modelo deve ser removido. Isto é geralmente feito manualmente, embora as abordagens alternativas, tais como a utilização de um suporte solúvel, pode ser utilizado; veja suplemento 4. <ol><li> Retire a impressão a partir da placa de construção puxando-o suavemente para o lado. Se a jangada adere fortemente à placa de construção, separá-lo através da inserção de uma ponta afiada entre eles. </li><li> Retirar as estruturas de suporte a partir do modelo. Muitos suportes podem ser removidos à mão, quebrando-los fora da peça e do raft. modelos flexíveis pode ser destacado, puxando-os para longe da parte. Para suportes que são de difícil acesso ou são ligados a estruturas delicadas, utilizar um alicate de corte para cortar o ponto em que o apoio se conecta à parte. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

modelos 3D físicas de biomoléculas fornecer um complemento poderoso para métodos baseados em computador mais comuns de visualização. As propriedades adicionais de uma representação 3D física contribuem para a compreensão intuitiva da estrutura biomolecular. A construção de modelos 3D físicas de biomoléculas pode facilitar o seu estudo através do uso de uma forma que tira partido de modos bem desenvolvida de sensação humana. Modelos 3D servem não apenas como uma ajuda para o pesquisador, mas pode ser usado para facilitar atividades pedagógicas e pode aumentar o alcance dos resultados de aprendizagem 13, 14, 15. Imans podem ser adicionados aos modelos de plástico para permitir a montagem e desmontagem, como se mostra com um modelo de polipéptidos 16. Além disso, objectos 3D-impressa pode ser usada em investigação, tanto na fabricação de equipamento de laboratório 17, bem como para fazer microfldispositivos uidic para células 18 e modelos de cristais 19 ou neurônios 20. A manipulação de modelos físicos podem servir para promover discussões colaborativas que podem inspirar novos insights. Os recentes desenvolvimentos em tecnologias de impressão 3D e reduções no custo de impressoras permite a criação de complexos modelos físicos 3D de biomoléculas por um usuário individual. Embora a tecnologia de impressão FFF é mais comum e menos caro do que outros métodos, que representa uma série de limitações. O processo de impressão em 3D é demorado, e falhas mecânicas que ocorrem. impressoras FFF normalmente só pode imprimir um material por parte, restringindo a exibição de informações de cor. A resolução dos modelos feitos em impressoras FFF é baixa, em torno de 100 mm por camada. Aconselhamos o leitor a trabalhar com essas limitações e desenvolver uma abordagem para a sua impressora e biomoléculas (s) de interesse. Nós apresentamos o processes necessários para um usuário desenvolver uma representação 3D costume de sua biomolécula de interesse que é preciso, informativo e de impressão. Tal como acontece com qualquer nova tecnologia, muitas vezes há &quot;dores de crescimento&quot; que devem ser superados durante o seu uso. Nós fornecemos vários exemplos onde os problemas podem ser encontradas no processo de biomoléculas de impressão 3D (ver suplemento 6). Finalmente, através deste artigo, é o nosso objectivo de contribuir para o crescimento de uma comunidade de usuários que se dedicam à impressão 3D de biomoléculas. Importante, o NIH estabeleceu uma base de dados para o público a compartilhar modelos 3D e os métodos utilizados para imprimi-los 10. Nós encorajamos fortemente a participação no presente recurso exclusivo (ver suplemento 7 para obter instruções sobre como carregar uma impressão modelo 3D e informações de fundo para a Bolsa de impressão NIH 3D).

Uma compreensão completa da função e actividade de uma biomolécula requer a determinação da sua estrutura tridimensional (3D). Isto é habitualmente conseguido utilizando cristalografia de raios-X, RMN, ou microscopia electrónica. Estruturas 3D pode ser compreendido através da percepção de modelos, ou objectos semelhantes às estruturas precisas que eles representam um. Historicamente, a construção de modelos 3D físicas era necessário para os investigadores para validar, explorar e comunicar as hipóteses resultantes quanto à função de biomoléculas. Estes modelos, como a dupla hélice do DNA de Watson-Crick e hélice alfa de Pauling, desde uma visão única sobre relações estrutura-função e foram fundamentais para o nosso entendimento inicial de ácido nucleico e proteína estrutura-função 2, 3, 4. Embora os modelos de ácidos nucleicos de proteínas complexo e pode ser criado, otempo e custo de construção de um modelo físico foi finalmente superado pela relativa facilidade de visualização molecular assistida por computador. O desenvolvimento de impressão 3D, também conhecido como aditivo de fabricação, mais uma vez permitiu a construção de modelos físicos de biomoléculas 5. impressão em 3D é o processo de fabrico, um objecto 3D física de um arquivo digital através da adição sequencial de camadas de um material (s). Uma variedade de mecanismos são usados ​​no presente processo. Até recentemente, as máquinas utilizadas para a produção de modelos físicos de biomoléculas eram demasiado caro para ser amplamente utilizado. No entanto, na última década, a tecnologia de impressão 3D, fundido a fabricação de filamentos (FFF), em particular, tem avançado significativamente, tornando-o acessível para uso do consumidor 6. impressoras FFF agora estão normalmente disponíveis em escolas, bibliotecas, universidades e laboratórios. A maior disponibilidade e acessibilidade da tecnologia de impressão 3Dtornou possível converter modelos biomoleculares 3D digitais em exatas, físicas modelos biomoleculares 3D 7, 8, 9. Tais modelos incluem não só representações simples de biomoléculas isoladamente, mas também conjuntos macromoleculares complexos, tais como as estruturas de cápside de ribossoma e de vírus. No entanto, o processo de impressão de biomoléculas individuais e montagens macromoleculares coloca vários desafios, particularmente quando se utiliza os métodos de extrusão de termoplásticos. Em particular, as representações de biomoléculas muitas vezes têm geometrias complexas que são difíceis para impressoras para produzir e criar e processar modelos digitais que serão impressos com sucesso requer habilidade com modelagem molecular, modelagem 3D e software da impressora 3D. O fluxo de trabalho 3D para imprimir uma biomolécula amplamente ocorre em quatro etapas: (1) preparar um modelo biomolecular de seu arquivo de coordenadas para impressão em 3D;(2) a importação do modelo biomolecular em um software &quot;fatiamento&quot; para segmentar o modelo para a impressora e para gerar uma estrutura de apoio que irá fisicamente sustentar o modelo biomolecular; (3) selecção correcta do filamento e a impressão do modelo 3D; e (4) passos de processamento pós-produção, incluindo a remoção de material de suporte a partir do modelo (Figuras 1 e 2). O primeiro passo neste processo, computacionalmente manipular o arquivo de coordenadas da biomolécula, é crítica. Nesta fase, o usuário pode construir reforços modelo na forma de suportes, bem como remover estruturas que são estranhos ao que o usuário optar por exibir. Além disso, a escolha da representação seja feita nesta fase: se pretende visualizar a totalidade ou parte da biomolécula como uma representação da superfície, fitas, e / ou átomos individuais. Uma vez que as adições e / ou subtrações de conteúdos necessários sejam feitos e a representação for selecionada, a estrutura é guardado como um mo 3Darquivo del. Em seguida, o arquivo é aberto em um segundo programa de software para converter o modelo em um arquivo de impressão 3D que pode ser impresso, camada por camada, em uma réplica de plástico da biomolécula. O objetivo do nosso protocolo é fazer com que a fabricação de modelos moleculares acessível para o grande número de usuários que têm acesso a impressoras FFF, mas tecnologias de impressão 3D para não mais caros. Aqui, nós fornecemos um guia para a impressão 3D de biomoléculas de dados moleculares em 3D, com métodos que são otimizadas para impressão FFF. Detalhamos como maximizar a capacidade de impressão de complexas estruturas biomoleculares e garantir a pós-processamento simples de modelos físicos. As propriedades de vários materiais de impressão comum ou filamentos são comparados e recomendações sobre seu uso para criar impressões flexíveis são fornecidos. Finalmente, nós apresentamos uma série de exemplos de modelos biomoleculares-impressos em 3D que demonstram a utilização de diferentes representações moleculares.

<table><tbody><tr><td><forte>Filamento</forte></td>Filamento de impressão 3D PLA (rolo de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,0 kg)</td><td>Impressão Quantum3D</td><td>http://quantum3dprinting.com/</td> <td>Filamento PLA de muito boa qualidade, fortemente recomendado</td></tr><tr><td>NinjaFlex Filamento de impressão 3D flexível</td><td>Ninjatek</td><td>https://ninjatek.com/</td> Filamentos <td>PLA de filamento flexível de alta qualidade</td></tr><tr><td>PrimaValue & PrimaSelect</td><td>3DPrima</td><td>http://3dprima.com/</td> <td>Fornecedor europeu de filamentos</td></tr><tr><td><forte>Impressoras</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prusa I3 MK2 Impressora 3D</td><td>Prusa Research</td><td>http://www.prusa3d.com/</td> <td>Uma impressora 3D popular</td></tr><tr><td>MakerGear M2 Revision E (M2e)</td><td>MakerGear</td><td>http://www.makergear.com/</td> <td>Impressora de código fechado, de altíssima qualidade</td></tr><tr><td>Ultimaker 2</td><td>Ultimaker</td><td>https://ultimaker.com/</td> <td>Impressora muito confiável e fácil de usar, classificação mais alta em 3Dhubs.com</td></tr><tr><td>Flashforge Creator Pro</td><td>Flashforge</td><td>http://www.flashforge-usa.com</td><td>Impressora de extrusão dupla confiável, classificação mais alta em</td></tr> <tr><td>3Dhubs.comSoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simplify3D Slicer</td><td>Simplify3D</td><td>https://www.simplify3d.com/</td> <td>Excelente software de fatiamento</td></tr><tr><td>Netfabb</td><td>Autodesk</td><td>http://www.autodesk.com/education/free-software/netfabb</td><td>software de reparo de malha, disponível gratuitamente para fins educacionais</td></tr><tr><td>Chimera</td><td>University of California, San Francisco</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td> <td>Chimera molecular vizualizer</td></tr><tr><td>Meshmixer</td><td>Autodesk</td><td>http://www.meshmixer.com/</td> <td>Usado para orientar modelos, mas tem outras características</td></tr></tbody></table>

impressão 3d de biomoleculares modelos de investigação e pedagogia

3D Printing of Biomolecular Models for Research and Pedagogy

A construção de modelos físicos tridimensionais (3D) de biomoléculas pode contribuir de forma única para o estudo da estrutura-função relationship. 3D estruturas são mais frequentemente percebidas usando o meio bidimensional e exclusivamente visual da tela do computador. A conversão de dados moleculares digitais 3D em objetos reais permite que as informações sejam percebidas por meio de uma ampla gama de sentidos humanos, incluindo visão estereoscópica direta, tato e interação. Esses modelos tangíveis facilitam novos insights, permitem o teste de hipóteses e servem como âncoras psicológicas ou sensoriais para informações conceituais sobre as funções das biomoléculas. Avanços recentes na tecnologia de impressão 3D do consumidor permitem, pela primeira vez, a fabricação econômica de modelos de biomoléculas de alta qualidade e cientificamente precisos em uma variedade de representações moleculares. No entanto, a otimização do modelo virtual e seus parâmetros de impressão é difícil e demorada sem orientação detalhada. Aqui, fornecemos um guia sobre o design digital e a fabricação física de modelos de biomoléculas para pesquisa e pedagogia usando software de código aberto ou de baixo custo e impressoras 3D de baixo custo que usam tecnologia de fabricação de filamentos fundidos.

Modelos para impressão em 3D estável e informativos de biomoléculas pode ser preparado por: (i) títulos de espessamento para fornecer estabilidade, (ii) seleccionar cuidadosamente o tipo de estrutura representação secundário ou estilo que iria proporcionar a maior discernimento e estabilidade, (iii) a impressão da biomolécula em mais do que uma representação molecular, (iv) utilizando um filamento que irá processar a totalidade ou parte de uma biomolécula flexível, ou (v) a geração de uma montagem complexa, que é modular (isto é, nas partes conectáveis). Para ilustrar como imprimir tais modelos informativos e estáveis, que incidiu sobre os componentes da cromatina e na produção de um modelo hipotético de cromatina. Cromatina é um conjunto de ADN-proteína altamente complexo. A subunidade de proteína fundamental da cromatina é a proteína histona. Há quatro proteínas histona, cada um consistindo de uma hélice-loop-hélice (a &quot;dobra de histona&quot;) seguido de uma hélice alfa e uma segunda estendida &quot;dobra de histona.&quot; Estrutura de proteína histona pode ser facilmente produzido usando uma representação de &quot;fita&quot; (Figura 3A). Em alternativa, a estrutura da proteína de histona pode ser exibida usando apenas a sua superfície (Figura 3B). Existem duas cópias de cada uma das quatro proteínas histona, que montam de modo a formar um octâmero histona globular. O octâmero histona é demasiado grande para imprimir integralmente como uma representação da fita ou da vara, devido à maior escala na qual estas características necessitam de ser impresso. Assim, um tal conjunto grande de proteínas é melhor visualizado usando representação da superfície (Figura 3C). DNA irá traçar um caminho em torno da octamer histonas para formar a 10 nm de diâmetro do núcleo nucleossomo partículas. O caminho de DNA pode ser melhor visualizado por imprimir dois modelos separados e utilizando um filamento flexível para o DNA (Figura 3D). partículas do núcleo nucleossomos empilharuns sobre os outros para formar um conjunto de ordem superior, uma &quot;fibra&quot;, de 30 nm de diâmetro, uma estrutura suprahelical canhoto. Para melhor ilustrar a forma como os 10 nm partículas de núcleo nucleossomos podem empilhar para formar a 30 nm de montagem da cromatina, individuais de impressão partículas &quot;di-nucleossomos&quot; (Figura 3E) e depois empilhá-los após a impressão (Figura 3F). Uma vez que domina o fluxo de trabalho e a superfície de extrusão única fita acima descrito, tornando explorar uma série de modelos atómicos, moleculares, e compostos, tal como ilustrado na Figura 4. Por exemplo, combina as representações da superfície e da fita para separar diferentes partes de um complexo (ver polimerase de ADN, Figura 4B). Criar modelos mais instrutivos e atraentes usando uma impressora dupla extrusão que pode derreter dois filamentos simultaneamente em um único objeto 3D (veja a Figura 4C). Alternativamente, peças pintura dos modelos (ver GuanINE e a hélice alfa, a Figura 4A). Imprimir e montar as subunidades de um complexo de proteínas, como o canal de sódio, ou levá-la ainda mais, imprimindo partes distintas de um complexo e montá-los mais tarde em um modelo maior, multi-color (veja os complexos de anticorpos HIV e ribossomais, Figura 4C). Tais modelos compostos são mais capazes de mostrar características funcionais em comparação com cópias de um único filamento. As cores diferentes pode-se destacar, por exemplo, glicosilação contra proteína (modelo HIV) ou RNA contra proteínas (ver modelo ribossomo, Figura 4C). Elas também permitem a criação de quebra-cabeças 3D educacionais, como a ligação do anticorpo à superfície do HIV (ver gp120 ligada por um anticorpo, a Figura 4C), onde apenas uma configuração 3D dá uma correlação muito próxima de ambas as partes. As instruções sobre a impressão estes modelos podem ser encontrados em suplemento 5. Além disso, nós fornecemos um vídeo suplementar que ilustra a construção de um modelo 3D de the Fo / F1 de protões do ATP sintase que foi impressa em pedaços e montada de uma tal maneira de modo que ele pode recapitular o mecanismo rotativo que ocorre durante esta enzimas mecanismo catalítico. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55427/55427fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxo de trabalho para preparar e imprimir um modelo 3D. Ilustrado são as fases de produção de uma cópia física 3D biomolecular: (i) preparação do modelo, incluindo a selecção de representação; (Ii) abertura de um arquivo .stl salvo do modelo e processar o arquivo usando o software de corte; (Iii) a impressão do modelo e da escolha do material ou de filamentos; e, finalmente, (iv) executar as etapas de pós-produção.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55427/55427fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55427/55427fig2.jpg" /> Figura 2. Visuals de diferentes representações de modelos em vários estágios de preparação. Linha superior: representações comuns de dois modelos (ubiquitina (PDB 1UBQ) e arginina) visualizada usando o programa de Chimera. Linha do meio: O percurso de impressão gerada a partir dos modelos STL Quimera, colorido pelo tipo de recurso de ubiquitina e arginina (laranja: padrão de enchimento; azul escuro: casca exterior; luz azul: interior shell). Linha inferior: impressões finais de ubiquitina e arginina. Superficiais e dois fita modelos de ubiquitina impressa em 300% do padrão Chimera saída STL (Chimera padrão é 1 nm no modelo e 1 cm de impressão), enquanto o modelo de arginina wcomo impresso em 1.000%. A fita padrão ou vara modelos Quimera são muito finos para imprimir corretamente, mas as versões espessas irá imprimir de forma confiável. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55427/55427fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55427/55427fig3.jpg" /> Figura 3. estudo de caso Nucleosome. (A) proteína H3 Single-histona proferida pelo espessamento &quot;fitas&quot;, impressa em 300%. (B) histona H3 proteína representação &quot;superfície&quot;, impressa em 200%. (C) proteína histona octâmero impressa a 100%. Octâmero (D) proteína histona (cor de laranja) em complexo com ADN flexível (branco) impressa a 100%. Modelo de superfície (E) Dinucleosome impresso com um raio da sonda padrão e impressos em escala de 100%. (F) Um mOdel da cromatina &quot;fibra de 30 nm&quot; criado pelo empilhamento manualmente modelos impressos individualmente do dinucleosome &quot;10 nm&quot;, em que a superfície foi processado com um raio da sonda de 3 A, impressas em tamanhos de 50% e 25%, e mantido juntamente com Play-Doh. gravuras 3D foram gerados a partir de um modelo do dinucleosome (APO 1ZBB). Todos os modelos estão disponíveis gratuitamente para download no NIH 3D impressão Troca 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55427/55427fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55427/55427fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplos de modelos impressos em 3D produzido usando impressoras de filamentos. (A) Esquerda, um modelo de bolas e varetas de moléculas de água em cristais de gelo hexagonais (impressão dual-filamento). Oriente, modelo de um nucleótido (guanina). Direita, uma proteína alfa h<html> Elix backbone-único modelo que mostra ligações de hidrogênio (preto). A guanina e a hélice alfa foram coloridas manualmente com canetas. (B) Esquerda, canal de sódio, composto de 4 subunidades que podem ser unidas (PDB 3E89). Médio, Plasmodium falciparum L-lactato desidrogenase (PDB 1T2D) impresso como fitas. Direita, modelo do local activo da ADN-polimerase (APO 1KLN), que mostra como o ADN e proteínas de superfície como fitas. (C) Esquerda, envelope lipídico HIV com glicoproteína (PDB 5FUU) vinculadas por anticorpos (PDB 1IGT), impressos em 15%. Oriente, detalhe da superfície do antigénio da glicoproteína a 150%, com a região variável do anticorpo como fitas (APO 5FYJ). Imediatamente, os modelos do bacteriana 70S Ribossoma (APO 4V5D) a 40% e 20%. As percentagens referem-se a quimera de saída padrão, em que 100% significa 1 nm na molécula impressões quanto 1 mm. Todos os modelos estão disponíveis gratuitamente para download no NIH 3D impressão Troca 11.oad / 55427 / 55427fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Modelos físicos de biomoléculas podem facilitar a compreensão de sua estrutura-função para o pesquisador, auxiliar na comunicação entre pesquisadores e servir como uma ferramenta educacional em empreendimentos pedagógicos. Aqui, fornecemos orientação detalhada para a impressão 3D de modelos precisos de biomoléculas usando impressoras 3D de mesa de fabricação de filamentos fundidos.

Impressão 3D de biomoleculares Modelos de Investigação e Pedagogia

The construction of physical three-dimensional (3D) models of biomolecules can uniquely contribute to the study of the structure-function relationship. 3D ...

O objetivo deste protocolo é criar e imprimir em 3D modelos biomoleculares estruturalmente precisos utilizando uma impressora 3D de mesa acessível. Este método é utilizado para projetar modelos impressos em 3D de biomoléculas, partindo dos dados estruturais e fabricando-os com impressoras 3D de baixo custo. A impressão 3D dos modelos físicos facilita a interação e a discussão sobre a estrutura e função molecular.A interação com os modelos proporciona uma percepção intuitiva que supera em muito o possível com um computador. Para começar, busque primeiro o arquivo de estrutura PDB da molécula de interesse inserindo o código PDB no UCSF Chimera. Em seguida, aumente o diâmetro da fita, para que ela possa ser impressa com sucesso.Utilize o menu do editor de estilo de fita em Ferramentas e Representação. Na guia Escala, altere a altura de cada item para pelo menos 0,7, de acordo com o tipo de estrutura. Para obter um modelo mais resistente, exiba as ligações de hidrogênio.Em seguida, altere o estilo de PseudoBond para cilindro e modifique o raio para 0,6. Agora, exporte a representação exibida como um arquivo 3D. Selecione STL como o tipo de arquivo e salve o modelo.É necessário um processamento adicional antes da impressão. É preciso realizar um reparo devido à sobreposição de objetos, o que é muito comum em modelos complexos. Para corrigir isso, abra o Autodesk NetFabb e importe o arquivo STL que foi exportado do Chimera.No NetFabb, abra o menu Extras e selecione Reparo Automático de Peça, depois selecione Reparo Estendido e aguarde enquanto o arquivo é processado. Para modelos pequenos, isso levará segundos, mas para modelos grandes pode levar minutos. Após o modelo ter sido processado, salve o resultado.Clique com o botão direito no modelo e selecione Exportar Peça e Como STL, ou use Projeto e Exportar Projeto como STL. O programa adiciona "reparado" ao nome do arquivo para distingui-lo do arquivo original. O modelo STL pode ser orientado automaticamente usando o Autodesk Meshmixer ou orientado manualmente no simplified 3D.A orientação ideal resultará em menor uso de material e reduzirá as chances de falha durante a impressão. Para orientação automática, abra o Meshmixer e importe o arquivo STL reparado. Em seguida, selecione Análise e Orientação.Ajuste o valor do Peso da Força para 100. Ajuste o valor do Peso do Volume de Suporte para zero. Ajuste o Peso da Área de Suporte para zero e, em seguida, clique em Atualizar.O modelo é então girado para minimizar o número de saliências. Para aceitar a orientação resultante, abra o menu suspenso e exporte o resultado como um arquivo STL binário. Abra o software de fatiamento e selecione o arquivo STL.Clique duas vezes no modelo e insira o fator de escala. O valor padrão é 10 milhões, o que significa que um centímetro no modelo impresso equivale a um nanômetro na molécula. Em seguida, redimensione as representações em fita e em bastão para pelo menos 300%, para que fiquem grandes o suficiente para impressão.As superfícies podem ser dimensionadas conforme desejado. Ajuste a orientação do modelo, se necessário, e então, gere as estruturas de suporte para o modelo. Clique no ícone Suporte e selecione suportes normais.Especifique um ângulo máximo de saliência de 50 graus e uma resolução de pilar adequada ao tamanho das características do seu modelo, como três milímetros neste exemplo. Em seguida, clique em Gerar Suportes Automáticos. Essas estruturas manterão separadas e fixas as partes salientes do modelo durante a impressão.Em seguida, edite os suportes gerados automaticamente para adicionar suportes ausentes e remover os supérfluos. Primeiro, use a ferramenta Adicionar Suportes para garantir que todas as estruturas salientes sejam adequadamente sustentadas e que nenhuma estrutura fique suspensa no ar. Segundo, use a ferramenta Remover Suportes para excluir suportes e cavidades internas, como o interior de hélices alfa ou bolsos de ligação.Agora, adicione um processo de impressão para preparar o código G do modelo para uma impressora e material de impressão específicos. Edite as configurações do processo de impressão conforme a seguir. Selecione o tipo de filamento com o qual você irá imprimir.Recomenda-se o uso de PLA. Em seguida, adicione uma saia para garantir um bom fluxo inicial do material. Depois, adicione uma base para fixar o modelo e os suportes.Utilize um preenchimento de 50% para modelos em fita e de 20% para modelos de superfície. Existem inúmeros outros parâmetros que podem ser ajustados para o sucesso da impressão. Consulte a documentação do programa no site para obter detalhes.Em seguida, clique em Preparar para Impressão e selecione o processo apropriado. Isso dividirá o modelo em camadas e construirá um trajeto para o bico da impressora seguir. Problemas no modelo que poderiam causar falha na impressão geralmente podem ser identificados na impressão da trajetória.É importante sempre inspecionar a trajetória gerada e, se necessário, refazer o seu modelo. Por fim, verifique a trajetória em código G quanto a erros. Procure ausência de suportes sob saliências, estruturas isoladas altas que poderiam ser derrubadas, cavidades indesejadas ou áreas muito finas para serem impressas.Se a trajetória de impressão parecer satisfatória, salve-a como um arquivo G-code. Caso contrário, edite o modelo, a orientação ou as configurações do processo e tente novamente. Para começar, prepare a impressora carregando o filamento e garantindo que a plataforma esteja nivelada.Em seguida, execute o G-Code na impressora, transmitindo-o de um computador ou de um cartão SD conectado à impressora. Observe a impressão até que a primeira camada tenha sido concluída com sucesso, e interrompa o processo se houver quaisquer erros. As impressoras 3D de mesa são propensas a falhas, o que pode ser desencorajador para usuários iniciantes.Listamos problemas e soluções comuns no apêndice e incentivamos o leitor a utilizar recursos on-line para solucionar problemas na impressora. Quando a impressão estiver concluída, deixe o modelo esfriar até a temperatura ambiente e, em seguida, solte-o da placa de construção puxando-o suavemente para o lado. Se a base aderir fortemente à placa de construção, retire-a cuidadosamente usando uma borda afiada.Em seguida, remova as estruturas de suporte do modelo usando alicate comum. Muitas delas podem ser removidas com alicate comum, e aquelas de difícil acesso ou conectadas a estruturas delicadas podem ser removidas usando alicate de corte. Um modelo em fita da ubiquitina revela a estrutura das hélices alfa e das folhas beta, bem como a localização das ligações de hidrogênio.Por comparação, também poderia ser feito um modelo de superfície da ubiquitina. Um modelo de uma hélice alfa com representação atômica mostra como os resíduos de aminoácidos se conectam por ligações de hidrogênio para formar uma estrutura secundária helicoidal. Um modelo da proteína histona H3 pode ser feito nas representações em fita e de superfície.Esses modelos revelam como múltiplas histonas podem interagir entre si para formar complexos maiores. Um octâmero de proteínas histonas forma o núcleo de um nucleossomo, revelando a estrutura quaternária das subunidades de histonas. O DNA que se enrola ao redor do octâmero de histonas, formando a partícula central do nucleossomo, é impresso com um filamento flexível, permitindo que seja removido, torcido e enrolado.Por fim, um modelo físico de dinucleossomo mostra como as partículas do núcleo nucleossômico se formam como contas em um fio. Múltiplos dinucleossomos podem ser empilhados para revelar a estrutura helicoidal da fibra de cromatina. Modelos físicos de biomoléculas apresentam vantagens em relação aos modelos digitais.Eles podem ser manipulados, apontados ou transferidos entre pesquisadores e estudantes. Essas ações podem melhorar a comunicação de ideias ou ajudar a destacar características da molécula. Como os modelos moleculares possuem geometria 3D complexa, podem ser difíceis de imprimir e podem exigir algumas tentativas e ajustes.O nosso protocolo ajudará o usuário a superar alguns dos problemas mais comuns com o processo. Ao seguir este protocolo, você será capaz de criar um modelo digital tridimensional de uma biomolécula, processar o arquivo 3D e criar um modelo físico utilizando uma impressora 3D de fabricação por filamento fundido.

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Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

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