Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting
2 de julho de 2017
Este protocolo descreve a bioprinção 3D do tecido cardíaco sem o uso de biomateriais. Os remendos cardíacos bioprinted 3D apresentam integração mecânica de esferóides componentes e são altamente promissores na regeneração do tecido cardíaco e como modelos 3D de doenças cardíacas.
O objetivo deste vídeo é demonstrar a bioimpressão 3D do tecido cardíaco sem o uso de biomateriais, usando apenas células. Em primeiro lugar, cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos são isolados, contados e misturados nas proporções celulares desejadas. Eles são então distribuídos usando uma pipeta multicanal e para poços individuais em placas de 96 poços de fixação ultrabaixa.
As células nas placas de 96 poços são incubadas por três dias, após três dias, formam esferóides que batem espontaneamente. A microscopia confocal revela a expressão de conexões em 43, que é marcada com fluorescência em verde em cardiomiócitos positivos para troponina T, que são marcados com fluorescência em vermelho distante dentro dos esferoides. As placas de 96 poços contendo os esferoides são então carregadas na bio-impressora 3D.
A bioimpressora 3D começa transferindo a placa de 96 poços para um local ao lado do conjunto de agulhas usando uma plataforma móvel. A bioimpressora 3D inspeciona todos os esferoides na placa de 96 poços para obter dados relevantes sobre cada esferoide, como seu diâmetro e sua forma. Esta é uma visão de perto do processo de bioimpressão 3D.
O esferóide é recolhido da placa de 96 poços à esquerda por um bico usando sucção a vácuo e colocado em um local específico em um conjunto de agulhas à direita. Este processo é repetido até que o processo de bioimpressão 3D seja concluído. Até que todos os esferóides e a placa de 96 poços tenham sido bioimpressos, a bioimpressora 3D armazenará a placa existente de 96 poços e carregará uma nova placa, usando a plataforma móvel.
Este é um vídeo em timelapse que mostra uma vista aérea da bioimpressão 3D de um adesivo de nove por nove a uma velocidade de 100 vezes, as agulhas na matriz de agulhas são dispostas em uma formação de grupo e os esferóides são carregados em cada agulha de cima. Após três dias em condições estéreis, o adesivo cardíaco da bioimpressora 3D é removido com muito cuidado do conjunto de agulhas, deslizando suavemente o pedaço de plástico rígido no conjunto de agulhas sob o adesivo para cima. Lubrificação com solução salina tamponada com fosfato ou PBS, pode ser aplicada às agulhas durante esta etapa, conforme necessário, para uma remoção mais suave e fácil.
O adesivo cardíaco bioimpresso em 3D é muito frágil, imediatamente após a remoção do conjunto de agulhas, portanto, deve-se tomar os devidos cuidados para não danificá-lo. O adesivo cardíaco bioimpresso em 3D é então transferido para uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo meios celulares apropriados. Imediatamente após a remoção do conjunto de agulhas, nota-se que o adesivo já está batendo, com os orifícios das agulhas mudando de tamanho a cada batida.
O adesivo cardíaco bioimpresso em 3D pode amadurecer, durante o qual os vazios de tecido causados pelo conjunto de agulhas são preenchidos pelo tecido circundante. O adesivo cardíaco de bioimpressão 3D continua a bater espontaneamente. Em conclusão, é viável bioimprimir tecido cardíaco em 3D sem o uso de biomateriais.
Adesivos cardíacos bioimpressos em 3D exibem integração mecânica de componentes spheroids. 3D bioimpressão de tecido cardíaco tem aplicações clínicas promissoras e regeneração de tecido cardíaco e possui modelos 3D de tecido cardíaco, replicação em farmacologia preditiva e toxicologia e desenvolvimento de terapias direcionadas a células e genoma.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a bioimpressão 3D de tecido cardíaco utilizando apenas células, sem biomateriais. Os remendos cardíacos resultantes demonstram integração mecânica e mostram potencial para regeneração do tecido cardíaco e como modelos para doenças cardíacas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioprintagem 3D
- Engenharia de Tecidos Cardíacos
- Medicina Regenerativa
Contexto
- A regeneração do tecido cardíaco é essencial para o tratamento de doenças cardíacas.
- Os métodos tradicionais muitas vezes dependem de biomateriais, o que pode limitar a integração.
- O uso exclusivo de células pode melhorar a funcionalidade dos tecidos bioimpressos.
- Compreender as interações celulares é fundamental para o sucesso da engenharia de tecidos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para bioprintagem 3D de tecido cardíaco sem biomateriais.
- Avaliar a integração mecânica de enxertos cardíacos bioprintados.
- Criar um modelo para o estudo de doenças cardíacas.
Métodos Utilizados
- Isolamento e contagem de cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos.
- Mistura de células em proporções desejadas e distribuição em placas de 96 poços com aderência ultrabaixa.
- Incubação das células para formação de esferoides que batem espontaneamente.
- Microscopia confocal para avaliar a expressão e integração celulares.
Resultados Principais
- Os esferoides formados por células mistas exibiram batimento espontâneo.
- A microscopia confocal confirmou a expressão de proteínas-chave em cardiomiócitos.
- A bioplotadora 3D integrou com sucesso os esferoides em retalhos cardíacos.
- A integração mecânica dos retalhos foi demonstrada.
Conclusões
- A bioprintagem 3D sem biomateriais é viável e eficaz.
- A abordagem mostra potencial para a regeneração de tecido cardíaco.
- Este método pode servir como um modelo valioso para a pesquisa de doenças cardíacas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a bioimpressão 3D de tecido cardíaco funcional sem o uso de biomateriais, oferecendo uma abordagem escalonável para gerar retalhos de tecido mecanicamente integrados para modelagem pré-clínica de doenças e medicina regenerativa. Ao utilizar apenas células, reduz a variabilidade proveniente de scaffolds exógenos e aumenta a relevância fisiológica nos testes de resposta a fármacos e toxicidade. Os retalhos resultantes, que apresentam batimento espontâneo, apoiam a validação precoce de alvos terapêuticos e a redução de riscos mecanicistas em pipelines de descoberta cardiovascular.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar as interações multicelulares na formação e função do tecido cardíaco.
- Valor Operacional: Oferece uma plataforma reprodutível para avaliar os efeitos de compostos sobre redes integradas de cardiomiócitos, endoteliais e fibroblastos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera esferoides cardíacos contráteis que se fundem em enxertos mecanicamente integrados, permitindo leituras funcionais da contratilidade.
- Valor Operacional: Permite a padronização da arquitetura do tecido por meio do posicionamento preciso de esferoides por bioprintagem, melhorando a consistência do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Cria modelos tridimensionais de tecido cardíaco relevantes para doenças, para o estudo da fisiopatologia e da resposta terapêutica.
- Valor Operacional: Permite a maturação de retalhos bioprintados em cultura, apoiando a avaliação longitudinal da integração e estabilidade do tecido.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O fluxo de trabalho posiciona a geração de esferoides e a bioprintagem como uma ponte entre a descoberta inicial e a validação pré-clínica, permitindo a criação de tecidos cardíacos complexos para avaliação funcional posterior.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses sobre interações célula-célula e integração mecânica em nível tecidual em um sistema multicelular definido.
- Triagem: Fornece fragmentos cardíacos padronizados com atividade contrátil mensurável para triagem de compostos.
- Análises: Permite a medição da contração espontânea e da integração estrutural por meio de imageamento e leituras funcionais.
- Pesquisa Translacional: Oferece uma sequência contínua desde a formação de esferoides até fragmentos teciduais maduros, modelando a remodelação tecidual relacionada ao desenvolvimento e a doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um processo de bioprintagem reutilizável para gerar modelos de tecidos cardíacos em múltiplos alvos e indicações.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao modelar a mecânica do tecido cardíaco e a integração celular semelhantes às condições naturais.
- Valor Operacional: Elimina a variabilidade relacionada aos biomateriais, melhorando a reprodutibilidade entre experimentos e locais.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de falhas em estágios avançados ao permitir a detecção precoce de efeitos cardiotoxícicos ou terapêuticos em um sistema relevante ao ser humano.
- Impacto no Portfólio: Orienta decisões ajustadas ao risco em programas cardiovasculares por meio de maior fidelidade do modelo e translatabilidade dos dados.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em isolamento de células primárias, cultura de esferoides e operação de bioprinter 3D.
- Depende do acesso a um bioprinter com capacidade de sucção a vácuo e matrizes de agulhas compatíveis.
- Necessita de proporções padronizadas de mistura celular e placas com aderência ultrabaixa para formação consistente de esferoides.
- Envolve a otimização do tempo de maturação e das condições do meio para o desenvolvimento de tecidos funcionais.
- Limitado pela escala atual dos retalhos bioprintados e pela necessidade de manipulação cuidadosa após a impressão devido à fragilidade.
