Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

O objetivo geral deste método é orientar de forma rápida e confiável a quantificação de fibras musculares em músculos inteiros de ratos de maneira automática e independente do usuário, utilizando uma plataforma de código aberto. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área neuromuscular sobre defeitos provocados pelo envelhecimento, doenças ou traumas nos músculos esqueléticos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para analisar de maneira confiável populações de fibras musculares e gerar imagens de alta qualidade de cortes transversais musculares.

Após descongelamento suficiente, enxágue cuidadosamente os espécimes em PBS suplementado com Triton X, ou PBST, realizando uma lavagem de 10 minutos e outra de cinco minutos. Após a segunda lavagem, seque as seções ao ar por dois minutos. Em seguida, use uma caneta hidrofóbica para delimitar os contornos de cada seção transversal individual.

Após mais 15 minutos de secagem ao ar, bloqueie ligações inespecíficas com PBST suplementado com soro de cabra durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, lave as lâminas e adicione a mistura apropriada de anticorpos primários a cada amostra para uma coloração de uma hora à temperatura ambiente, protegida da luz. Ao final da incubação, enxágue as lâminas com uma lavagem de 10 minutos e outra de cinco minutos com PBST.

Em seguida, marque as seções musculares com o coquetel apropriado de anticorpos secundários por uma hora, protegidas da luz. Após lavar as lâminas duas vezes em PBST, conforme demonstrado, seque as lâminas e, então, contra-estaine os núcleos com um kit de coloração nuclear DAPI de acordo com as instruções do fabricante. Remova o excesso de DAPI com uma lavagem de um minuto em PBST, seguida por breve secagem ao ar.

Em seguida, cubra as amostras com meio de montagem fluorescente e lamínulas, e armazene as lâminas a quatro graus Celsius, protegidas da luz. Entre 24 e 48 horas após a coloração, carregue as lâminas em um escâner de lâminas e abra um novo projeto no software do programa. Para a pré-visualização da lâmina, selecione o canal DAPI e a objetiva de 2,5x, e foque manualmente no primeiro espécime.

Delimite cada corte transversal que deve ser incluído no processo detalhado de aquisição e defina os tempos de exposição para cada canal. Agora, execute a aquisição automática de imagens, verificando a correta aquisição do primeiro campo de visão, para evitar uma aquisição incorreta no início do processo automatizado. Quando a aquisição de imagens estiver concluída, verifique manualmente se o foco automático dos cortes transversais está correto e se as fibras individuais são claramente distinguíveis.

É fundamental que o foco automático seja verificado e corrigido manualmente para cada imagem, conforme necessário. O processo automatizado de quantificação das fibras musculares exige imagens de alta qualidade para obter resultados ideais. Em seguida, para cada corte transversal que deva ser incluído nas análises finais, exporte cada canal, exceto DAPI, separadamente como arquivos JPEG, e nomeie e organize os arquivos nas pastas devidamente nomeadas de acordo com os canais expostos.

Antes de iniciar o processo de quantificação das fibras musculares, visualize cada imagem no software apropriado de edição de imagens para confirmar um contraste suficiente entre as fibras coradas e o fundo. Em seguida, no ImageJ, utilize o comando Plugins>Macros>Edit para revelar o código-fonte da macro e altere o diretório da pasta para cada canal no código-fonte da macro. Agora, utilize o comando Run para iniciar a macro.

Todas as imagens na pasta serão carregadas no macro e quantificadas em ordem consecutiva. Ao final da quantificação, exporte os resultados para o software apropriado de planilha eletrônica e identifique os valores das fibras lentas, intermediárias e rápidas positivamente contadas. O número total de fibras poderá então ser calculado.

A coloração imunofluorescente de fibras musculares é rápida e apresenta baixa reatividade cruzada, e as imagens resultantes demonstram alto contraste entre as fibras coradas e o tecido circundante, bem como uma forte distinção entre os diferentes tipos de fibras. A análise automática permite a detecção das populações relativas de fibras musculares com uma precisão de mais ou menos 4% em comparação com a análise manual, sendo as contagens absolutas totais superiores em relação à análise manual. As contagens relativas, no entanto, permanecem semelhantes, dentro de uma faixa de mais ou menos 4%.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar este método para automatizar a quantificação de fibras musculares. Não se esqueça de que o trabalho com DAPI pode ser perigoso. Portanto, use os equipamentos de proteção adequados ao realizar a coloração.