Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade
3 de abril de 2017
Este protocolo permite que um pesquisador isolar e caracterizar residente em tecido marca de macrófagos em vários tecidos inflamados, extraídos de modelos induzida por dieta de distúrbios metabólicos.
O objetivo geral deste procedimento é isolar e caracterizar de forma eficaz macrófagos de tecidos comumente afetados pela inflamação induzida pela dieta, como o fígado. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de imunologia e inflamação sobre como o fenótipo de macrófagos residentes em tecidos pode determinar a progressão de doenças inflamatórias crônicas. A principal vantagem deste método é que ele otimiza as etapas de isolamento necessárias para obter suspensões de células únicas derivadas de tecidos afetados pela inflamação crônica de baixo grau mediada pela obesidade.
Demonstrará o procedimento Joselyn Allen, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para isolar o fígado, posicione primeiro um camundongo embebido em etanol em posição supina sobre uma placa de dissecção de espuma de poliestireno e fixe as patas dianteiras e traseiras. Em seguida, use uma pinça de ponta média para segurar a pele abdominal próxima à abertura da uretra e utilize uma tesoura de dissecção afiada para fazer uma pequena incisão na pele levantada.
Insira a lâmina inferior da tesoura na incisão entre a pele e o peritônio e faça uma incisão lateral da virilha até o queixo. Puxe suavemente a pele para trás para expor a cavidade peritoneal intacta e a parede torácica e faça uma incisão lateral através do peritônio. Levante o esterno e incise cuidadosamente o diafragma.
Em seguida, mova os órgãos gastrointestinais para o lado e localize a veia cava inferior sub-hepática ou VCI. Usando pinças hemostáticas, prenda a VCI supra-hepática para manter uma perfusão localizada e conecte uma seringa cheia de tampão de perfusão pré-aquecido a um conjunto de coleta e infusão sanguínea de 23 gauge. Pressione suavemente o êmbolo até que a tubulação e a agulha estejam cheias de tampão de perfusão e insira a agulha paralelamente à VCI sub-hepática.
A canulação adequada da VCI garante que o tampão de dissociação seja distribuído localmente por todo o fígado e tecidos periféricos, otimizando a digestão do tecido. Utilize uma pinça hemostática de quatro centímetros para fixar a agulha no lugar e pressione suavemente o êmbolo para iniciar a perfusão. Se a agulha estiver posicionada corretamente, a cor será rapidamente eliminada do fígado e os lobos ficarão aumentados.
Corte imediatamente a veia porta para permitir que o tampão de perfusão flua livremente pelo fígado, massageando ocasionalmente os lobos suavemente entre o polegar e o indicador para facilitar a remoção do sangue. Quando restarem apenas cinco mililitros de tampão de perfusão, substitua a seringa de tampão de perfusão por uma seringa cheia de tampão de dissociação pré-aquecido, continuando a massagear suavemente os lobos e a perfundir o fígado até que esteja completamente digerido. Confirme uma digestão bem-sucedida pressionando suavemente a borda romba de uma pinça no lobo lateral esquerdo.
Uma reentrância deve aparecer na superfície, preenchendo-se lentamente após a remoção da pinça. Em seguida, remova a agulha e use uma lâmina reta curta de um par de tesouras de dissecação para cortar cuidadosamente os ligamentos conectores e excisar todo o fígado e a vesícula biliar. Transfira o fígado para uma placa de 10 centímetros contendo 10 mililitros de DMEM gelado e use pinças dentadas para segurar a VCI supra-hepática seccionada.
Usando pinças de ponta média, aplique um movimento rápido de escovação em cada lobo para liberar as células da Cápsula de Glisson e passe o DMEM saturado através de um filtro celular de 70 micrometros em um tubo cônico de 50 mililitros sobre gelo. Rendimentos elevados de células viáveis só podem ser obtidos mediante a dissociação adequada das células hepáticas da Cápsula de Glisson. Quando todas as células tiverem sido coletadas, inverta o tubo para misturar suavemente a suspensão celular e pelotize as células por centrifugação.
Transfira o sobrenatante para um novo tubo cônico de 50 mililitros para mais três centrifugações de baixa velocidade. Após a última centrifugação, transfira o sobrenatante para um novo tubo de 50 mililitros e centrifugue as células mais uma vez em velocidade mais alta. Em seguida, ressuspenda o pellet de células não parenquimatosas em tampão FACS para contagem e dilua as células hepáticas até a concentração apropriada de acordo com sua aplicação posterior em tubos de poliestireno redondos rotulados de cinco mililitros.
Camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura ou com uma dieta rica em gordura e colesterol apresentam uma infiltração aumentada de macrófagos M1 classicamente ativados em tecidos afetados, como a aorta. Macrófagos aórticos positivos para CD45 e positivos para F4/80 que expressam o receptor RON, os quais demonstram um fenótipo anti-inflamatório, estão reduzidos em camundongos alimentados com dieta rica em gordura e colesterol, enquanto macrófagos pró-inflamatórios positivos para CD45, positivos para F4/80 e positivos para CD11c são encontrados em números aumentados em aortas isoladas desses animais. Além disso, macrófagos classificados que expressam o receptor RON, derivados de aortas digeridas, exibem uma expressão aumentada do gene Arginase 1, um marcador bem estabelecido de macrófagos M2.
De fato, a caracterização dos macrófagos residentes no fígado revela o fenótipo predominante de subpopulações que expressam o receptor RON, com populações de macrófagos pró-inflamatórios positivos para CD11c demonstrando uma expressão reduzida de genes fortemente associados ao fenótipo anti-inflamatório M2. Tendências semelhantes são observadas nas populações de macrófagos isoladas do tecido adiposo branco digerido, nas quais populações de macrófagos com fenótipo pró-inflamatório exibem uma expressão reduzida na superfície celular do receptor RON. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 20 a 30 minutos por animal, se realizada corretamente.
Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, classificação fluorescente de células ativadas e/ou PCR quantitativa, podem ser realizados para caracterizar ainda mais o fenótipo dos macrófagos residentes no tecido derivados do fígado isolados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar adequadamente macrófagos residentes no tecido a partir de fígados doentes. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este protocolo permite aos pesquisadores isolar e caracterizar macrófagos residentes em tecidos a partir de tecidos inflamados afetados por distúrbios metabólicos induzidos pela dieta. O método concentra-se na otimização das etapas de isolamento para obtenção de suspensões de células únicas a partir de tecidos afetados pela inflamação mediada pela obesidade.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Inflamação
- Distúrbios Metabólicos
Antecedentes
- Os macrófagos residentes nos tecidos desempenham um papel crucial nas doenças inflamatórias crônicas.
- A inflamação induzida pela dieta afeta diversos tecidos, particularmente o fígado.
- Compreender os fenótipos dos macrófagos pode orientar estratégias de tratamento.
- Este protocolo aumenta a eficiência do isolamento de macrófagos para pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Isolar e caracterizar macrófagos de tecidos inflamados.
- Investigar o papel dos macrófagos na inflamação crônica.
- Fornecer um método confiável para obtenção de suspensões de células únicas.
Métodos Utilizados
- Isolamento de tecido hepático de modelos induzidos por dieta.
- Uso de camundongos imersos em etanol para extração de tecido.
- Técnicas de dissecação para obtenção de amostras de tecido.
- Caracterização dos fenótipos de macrófagos após o isolamento.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de macrófagos a partir de tecidos hepáticos.
- Caracterização dos fenótipos de macrófagos associados à inflamação.
- O protocolo otimizado melhora a eficiência do isolamento celular.
- Informações sobre o papel dos macrófagos em distúrbios metabólicos.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para o estudo de macrófagos residentes nos tecidos.
- Os achados contribuem para a compreensão das doenças inflamatórias crônicas.
- A pesquisa futura pode se basear nesta metodologia para obter novas descobertas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A heterogeneidade dos macrófagos na inflamação induzida pela obesidade é um determinante crítico da progressão da doença e do direcionamento terapêutico em distúrbios metabólicos e cardiovasculares. Este protocolo permite o isolamento robusto e a caracterização fenotípica de macrófagos residentes em tecidos provenientes de fígado, aorta e tecido adiposo inflamados, apoiando a confiança preditiva na descoberta inicial e na validação de alvos. O acesso confiável a populações bem caracterizadas de células imunes melhora a continuidade translacional e reduz os riscos associados a hipóteses mecanicistas ao longo do processo de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias inflamatórias mediadas por macrófagos em tecidos relevantes para a doença.
- Apoia a validação funcional de alvos ao distinguir fenótipos de macrófagos pró- e anti-inflamatórios.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio de análise fenotípica quantitativa de subpopulações de células imunes.
- Aprimora a confiança preditiva para triagem de portfólio em indicações metabólicas e cardiovasculares.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece suspensões padronizadas de células isoladas para fluxos de trabalho downstream de citometria de fluxo e FACS.
- Garante reprodutibilidade e saída quantitativa para ensaios de perfilagem de células imunes.
- Permite o preparo escalonável de sistemas biológicos validados para triagem de compostos.
- Apóia a avaliação confiável de agentes imunomoduladores em contextos relevantes para doenças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a fenotipagem de macrófagos com estratégias translacionais de biomarcadores em modelos de doenças metabólicas.
- Mantém a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de alvos imunológicos.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular fenótipos celulares à progressão da doença.
- Reduz riscos em modelos pré-clínicos ao permitir a caracterização precisa de células imunes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se na interface entre a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica, permitindo uma transição contínua entre a verificação de hipóteses, a identificação de compostos promissores e a validação translacional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a análise baseada em hipóteses da função de macrófagos em tecidos inflamados.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis de células imunes para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Oferece dados de citometria de fluxo e de expressão gênica para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos de células imunes a estratégias pré-clínicas de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável para o isolamento de células imunes em modelos de doenças metabólicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos imunológ游戏副本es.
- Valor Operacional: Padroniza e simplifica o isolamento de células imunes para fluxos de trabalho de P&D escaláveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir e gerenciamento eficiente de portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos terapêuticos moduladores do sistema imunológico.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos, digestão enzimática e análise por citometria de fluxo.
- Exige acesso a instrumentação de FACS e capacidade de PCR quantitativo para caracterização posterior.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de isolamento e marcação para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a múltiplos tipos de tecidos inflamados, incluindo fígado, aorta e tecido adiposo.
- Depende de um cuidadoso diagnóstico e solução de problemas para otimizar o rendimento celular e a viabilidade a partir de tecidos densos ou fibrosos.
