Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

O objetivo geral deste procedimento é isolar e caracterizar efetivamente os macrófagos de tecidos comumente afetados pela inflamação induzida pela dieta, como o fígado. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunologia e inflamação sobre como o fenótipo de macrófagos residentes no tecido pode ditar a progressão de doenças inflamatórias crônicas. A principal vantagem disso é que o procedimento otimiza as etapas de isolamento necessárias para a obtenção de suspensões unicelulares derivadas de tecidos afetados pela inflamação crônica de baixo grau mediada pela obesidade.

Demonstrando o procedimento estará Joselyn Allen, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para isolar o fígado, primeiro coloque um camundongo embebido em etanol em decúbito dorsal em uma placa de dissecação de espuma de poliestireno e prenda as patas dianteiras e traseiras. Em seguida, use uma pinça de ponta média para agarrar a pele abdominal perto da abertura da uretra e use uma tesoura de dissecação afiada para criar uma pequena incisão na pele levantada.

Insira a lâmina inferior da tesoura na incisão entre a pele e o peritônio e faça uma incisão lateral da virilha ao queixo. Puxe suavemente a pele para trás para expor a cavidade peritoneal intacta e a parede torácica e faça uma incisão lateral através do peritônio. Levante o esterno e faça uma incisão cuidadosa no diafragma.

Em seguida, mova os órgãos gastrointestinais para o lado e localize a veia cava inferior sub-hepática ou VCI. Usando uma pinça hemostática, clampeie a VCI supra-hepática para manter uma perfusão localizada e conecte uma seringa cheia de tampão de perfusão pré-aquecido a um conjunto de coleta e infusão de sangue de calibre 23. Pressione suavemente o êmbolo até que o tubo e a agulha estejam cheios de tampão de perfusão e insira a agulha paralelamente à VCI sub-hepática.

A canulação adequada da VCI garante que o tampão de dissociação seja distribuído localmente por todo o fígado e tecidos periféricos, otimizando a digestão do tecido. Use uma pinça hemostática de quatro centímetros para prender a agulha no lugar e pressione suavemente o êmbolo para iniciar a perfusão. Se a agulha estiver posicionada adequadamente, a cor sairá rapidamente do fígado e os lóbulos aumentarão.

Corte imediatamente a veia porta para permitir que o tampão de perfusão flua livremente pelo fígado, ocasionalmente massageando suavemente os lobos entre o polegar e o indicador para facilitar a remoção do sangue. Quando restarem apenas cinco mililitros de tampão de perfusão, substitua a seringa de tampão de perfusão por uma seringa cheia de tampão de dissociação pré-aquecido, continuando a massagear suavemente os lóbulos e perfundir o fígado até que seja totalmente digerido. Confirme uma digestão bem-sucedida pressionando suavemente a borda romba de um par de pinças no lobo lateral esquerdo.

Um recuo deve aparecer na superfície que se enche lentamente quando a pinça é removida. Em seguida, remova a agulha e use uma lâmina reta curta de uma tesoura de dissecação para cortar cuidadosamente os ligamentos de conexão para extirpar todo o fígado e a vesícula biliar. Transfira o fígado para um prato de 10 centímetros contendo 10 mililitros de DMEM gelado e use uma pinça dentada para segurar a VCI supra-hepática cortada.

Usando uma pinça de ponta média, aplique um movimento rápido de acariciar cada lobo para liberar as células da cápsula de Glisson e passe o DMEM saturado por um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Altos rendimentos de células viáveis só podem ser alcançados dissociando adequadamente as células do fígado da cápsula de Glisson. Quando todas as células tiverem sido coletadas, inverta o tubo para misturar suavemente a suspensão celular e pellet as células por centrifugação.

Transferir o sobrenadante para um novo tubo cónico de 50 mililitros para mais três centrifugações de baixa rotação. Após a última centrifugação, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 50 ml e centrifugar as células mais uma vez a uma velocidade mais elevada. Em seguida, ressuspenda o pellet de células não parenquimatosas em tampão FACS para contagem e dilua as células hepáticas até a concentração apropriada de acordo com sua aplicação a jusante em tubos de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros rotulados.

Camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura ou rica em gordura exibem uma infiltração aumentada de macrófagos M1 classicamente ativados nos tecidos afetados, como a aorta. Os macrófagos positivos para CD45 / 80 positivos para receptor RON que demonstram um fenótipo anti-inflamatório estão diminuídos em camundongos alimentados com dieta rica em gordura e colesterol, enquanto macrófagos pró-inflamatórios CD45 positivos para F4 / 80 positivos para CD11c são encontrados em número aumentado em aortas isoladas desses animais. Além disso, os macrófagos que expressam o receptor RON classificado derivados de aortas digeridas exibem uma expressão aumentada do gene da arginase 1, um marcador de macrófagos M2 bem estabelecido.

De fato, a caracterização de macrófagos residentes no fígado revela o fenótipo predominante de subpopulações que expressam o receptor RON com populações de macrófagos pró-inflamatórios CD11c positivos, demonstrando uma expressão diminuída de genes fortemente associados ao fenótipo M2 anti-inflamatório. Tendências semelhantes são observadas nas populações de macrófagos isoladas de tecido adiposo branco digerido com populações de macrófagos de fenótipo pró-inflamatório exibindo uma expressão de superfície diminuída do receptor RON. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 20 a 30 minutos por animal, se for executada corretamente.

Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, classificação de células ativadas por fluorescência e/ou PCR quantitativo, podem ser realizados para caracterizar ainda mais o fenótipo dos macrófagos isolados residentes no tecido derivado do fígado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar adequadamente macrófagos residentes em tecidos de fígados doentes. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.