Name: Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprenda a isolar e caracterizar macrófagos residentes em tecidos afetados por inflamação induzida por dieta, como o fígado. Este método otimiza a obtenção de suspensões de células únicas para estudos em imunologia e doenças inflamatórias crônicas.

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Gostaríamos de agradecer a facilidade do núcleo citometria de fluxo para a Universidade de Pensilvânia estado Millennium ciência complexa.

<ol><li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+Then+and+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li>
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<li>Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+Application+of+Magnetic+Particles+in+Cell+Isolation+and+Enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment.</a> Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).</li>
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Autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

Modelos de desordem metabólica induzida por dieta que imitam co-morbidades, tais como aterosclerose, simples esteatose, esteatohepatite e diabetes tipo 2 são usados extensivamente para melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes de progressão da doença. Digestão dependente de colagenase é muitas vezes usado para dissociar os tecidos para libertar as células da matriz extracelular (ECM)16,27. Enzimas como a colagenase perturbam o colágeno que fornece ...

Modelos de mouse têm sido extensivamente usados para estudar a dinâmica de doenças humanas. Isolamento adequado, residente de células de tecidos de ratos em um estado doente pode fornecer uma plataforma para a compreensão das contribuições moleculares e celulares para a patogênese de uma doença1. Uma doença que é de importância crucial é a obesidade. A incidência de obesidade continua a aumentar em todo o mundo em paralelo com a resistência à insulina e o tipo 2 diabetes mellitus, doença cardiovascular e esteatose hepática2,3. Consumo excessivo de nutrientes é ainda mais distorcido pela diminuição da atividade física, desencadeando alterados sinais provenientes do tecido adiposo, o que pode alterar o meio celular de outros tecidos periféricos como a aorta e fígado4. Tal rompimento da homeostase metabólica resulta em uma crônica de baixo grau de inflamação sistêmica5.
Clássica ativação de macrófagos residentes para a aorta e fígado, bem como o recrutamento para o tecido adiposo branco (WAT) tem demonstrada não só iniciar dysregulation do metabólicos sinais mas também sustentar inflamação6,7. A heterogeneidade fenotípica e funcional de macrófagos é fortemente associada com a patogênese da obesidade relacionada co-morbidades7. A plasticidade dinâmica na polarização do macrófago permite que estas células que exibem uma variedade de fenótipos registrados que coordenam a progressão e a resolução da inflamação8. Enquanto classicamente ativados macrófagos (M1) estão implicados na propagação da inflamação, alternativamente ativados macrófagos (M2) foram associados com resolução e tecido reparação9,10.
Como o corpo sofre estresse metabólico, o tecido adiposo branco anormalmente acumula. O tecido adiposo expandido atrai e retém células inflamatórias que alterar profundamente a função normal dos adipócitos para promover a resistência à insulina, hiperglicemia e, finalmente, diabetes mellitus tipo 2, resistência à insulina ou hiperglicemia11, 12. Em paralelo, tecido adiposo branco remodela em resposta a sinais inflamatórios lançado pela infiltrou-se classicamente registrados (M1) tecido adiposo macrófagos (ATMs)13,14. Este órgão multicelular exerce uma cascata de sinais que desvia a função normal de outros órgãos do corpo tais como a aorta e hepática4.
O fígado é uma potência metabólica que adapta-se em resposta aos estímulos provenientes da vizinha desregulação WAT15. Hepáticos macrófagos ou células de Kupffer, em resposta a alterações metabólicas, secretam citocinas inflamatórias que transformam ambos parenquimatosa e fenótipo de células não-parenquimatosas e promovem a remodelação do tecido. Acúmulo de lipídios hepático, inflamação, depósitos excessivos de matriz extracelular, necrose e função eventual perda segue os insultos inflamatórios, contribuindo para o amplo espectro de danos no fígado associados com doença hepática gordurosa não-alcoólica 16,17,18.
Em paralelo a WAT comprometido e função hepática, grandes artérias acumulam lipídios dentro da parede arterial como o corpo sofre de estresse metabólico crônico19. Acúmulo de lipídios arterial desencadeia a secreção de quimiocinas pelas células endoteliais ativadas e subsequente recrutamento de monócitos20. Uma vez recrutados, monócitos proliferam, diferenciam, ingerem lipoproteínas e tornar-se células de espuma. Atherogenesis é iniciada e sustentada pela atividade pró-inflamatória dos recrutados e macrófagos residentes tecido de lipídios-carregados. Sucumbir a sinais de estresse extracelular e intracelular, retransmitidos neste microambiente aterogênico, esses macrófagos então se envolver em uma cascata de sinalização de apoptotic. Como essas células espuma morrem, eles contribuem seu conteúdo lipídico preenchido para o núcleo necrótico da lesão, que então leva a ruptura da placa, infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral.
Coletivamente, a heterogeneidade dos fenótipos de macrófagos em parte organiza a obesidade induzida por alterações inflamatórias observadas nos tecidos de desregulação como WAT, fígado e aorta8,21. Caracterização de recrutados e macrófagos residentes tecido poderiam fornecer insights sobre potenciais alvos moleculares que manipulam o macrófago fenótipo1. Para efetivamente caracterizar os macrófagos dos tecidos inflamados induzida pela obesidade, uma suspensão de célula única pode ser obtida através de digestão enzimática. Esses protocolos de dissociação devem ser eficazes em suficientemente degradante do tecido conjuntivo, minimizando a morte celular imune e oferece um rendimento de célula ideal. A mistura de enzima é dependente do tipo de tecido e seu tornar-se estrutural. Tecidos resistentes, tais como a aorta requer mais forte atividade enzimática, em comparação com o fígado e o WAT, para alcançar a dissociação de tecido. Da suspensão de célula única, macrófagos residentes de tecido podem ser inequivocamente caracterizados ou isolados para ainda mais a jusante análises tais como criação de perfil transcricional.
Aqui um protocolo específico de tecido é descrito que usa tecido dependente de colagenase digestão e citometria de fluxo policromático efetivamente isolar e caracterizar macrófagos residentes tecido obtidos de obesidade dieta tradicional induzida, aterosclerose, simples esteatose e esteatohepatite mouse modelos. Simultânea de coloração de marcadores de superfície celular com anticorpos contra leucócitos-(CD45 e/ou CD11b) e macrófago - antígenos específicos (F4/80) é frequentemente usado para identificar as populações de macrófagos22. Fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é uma poderosa estratégia usada para classificar essas populações identificadas em elevado grau de pureza. População classificada, então, pode ser avaliada para perfis de fenótipo gene específico usando a jusante análise molecular (tais como a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa)23. Apesar de citometria de fluxo padrão e classificação de celulares baseados em citometria de fluxo são ferramentas poderosas na distinção entre macrófagos dentro de uma suspensão de células vastamente heterogêneos, os antigos protocolos devem ser otimizados para garantir uma saída bem sucedida. Neste estudo, são descritos os protocolos que efetivamente isolar e caracterizam os macrófagos específicos do tecido viável; mais importante, este estudo fornece insight crucial sobre questões técnicas que muitas vezes surgem, bem como estratégias proativas e resolução de problemas para prevenir e/ou resolvê-los.

<table><tbody><tr><td>26 G x 5/8 in Agulhas</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 0.75 in agulha x tubo de 12 in. Conjunto de Coleta de Sangue</td><td>BD</td><td>367297</td><td>Usado para canulação de VCI sub-hepática durante a perfusão hepática</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 pol. Agulhas</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL com batentes de borracha</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 Fc Block&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Pacific Blue</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE Rato IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Hamster Armênio IgG</td><td>Biolegend</td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 Rato IgG2b</td><td>Biolegend</td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>Rato Azul Pacífico IgG2c</td><td>Biolegend</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtros de células m</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL&nbsp;</td>Solução Aquosa Paraformaldeído <td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>-16x</td><td>Microscopia Eletrônica</td><td>Sciences CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Micro Dissecante, 3.5 polegadas, Reta, 23 mm, Afiada&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>Usado para fins gerais de dissecação</td></tr><tr><td>Micro Fórceps, 4 polegadas, curva completa, 0.8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&nbsp;</td><td>Usado para fins gerais de dissecação</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecção de mola - 3 mm de corte&nbsp;</td><td>Ferramenta Fine Science</td><td>15000-10</td><td>Usada para dissecção da aorta Passos 1.3.3.17 a 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Curvado 0.07 mm x 0.04&nbsp; mm Ponta Fórceps</td><td>Fine Science Tool</td><td>11297-10</td><td>Usado para dissecção da aorta Passos 1.3.3.17 a 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Fórceps Hemostático (Curvo)</td><td>Fine Science</td><td>Tool 13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sódica Sal</td><td>Fischer Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Cultura de Células/Placas de Petri</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de Poliestireno (10 cm) c/tampa</td><td>Tubos</td> de Centrífuga Cônicos de 15 mL da Fischer Scientific <td>08-757-100D</td><td></td></tr> (Polipropileno)Tubos de Centrífuga Cônicos de 50 mL da <tr><td></td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;( Polipropileno)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Poliestireno de Fundo Redondo de 5 mL&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (Estoque de Álcool Etílico Desnaturado, Anidro)</td> <td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Copo de 500 mL&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm Grampo hemostático</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>Pinça dentada</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m Filtros descartáveis</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo IV</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Amônio Potássio (ACK)</td><td>ThermoFischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>Lâminas de barbear (0,22 mm (0,009"))VWR</td> <td>International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Mancha viva/morta Mancha</td><td></td><td></td><td>vermelha de viabilidade (em <forte>Figura 1A</forte>)</td></tr></tbody></table>

isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

A obesidade promove um estado inflamatório crônico que em grande parte é mediado por macrófagos de tecido-residente, bem como macrófagos derivados de monócitos. Obesidade induzida por dieta (DIO) é um modelo valioso em estudar o papel da heterogeneidade de macrófagos; no entanto, os isolamentos adequados macrófago são difíceis de adquirir de tecidos inflamados. Neste protocolo, descrevem as etapas de isolamento e necessárias diretrizes de solução de problemas derivadas de nossos estudos para a obtenção de uma população adequada de tecido-residente de macrófagos de ratos após 18 semanas de alto teor de gordura (HFD) ou gordura/alta-colesterol ( Intervenção de dieta HFHCD). Este protocolo incide sobre três tecidos de hallmark estudados na obesidade e aterosclerose, incluindo o fígado, os tecidos de adiposo brancos (WAT) e a aorta. Destacamos o uso como dualista de fluxo cytometry pode alcançar uma nova dimensão de isolamento e caracterização de macrófagos de tecido-residente. Uma seção fundamental do presente protocolo aborda a complexidade subjacente digestões enzimáticas de tecido-específica e isolamento do macrófago e subsequente da pilha-superfície anticorpo mancha para análise de fluxo cytometric. Este protocolo aborda existentes complexidades subjacentes fluorescente-ativado da pilha (FACS) de classificação e apresenta esclarecimentos para essas complexidades a fim de obter a caracterização de ampla gama de populações de células adequadamente classificada. Métodos alternativos de enriquecimento estão incluídos para classificação de células, tais como o fígado densa, permitindo a gestão de tempo e flexibilidade quando se trabalha com FACS. Em breve, este protocolo auxilia o pesquisador para avaliar a heterogeneidade de macrófagos de uma infinidade de tecidos inflamados em um determinado estudo e fornece dicas de solução de problemas perspicazes que foram bem sucedidas para caracterização e isolamento celular favorável de células do sistema imunológico em inflamação mediada por DIO.

Ao usar o apolipoprotein E deficientes camundongos C57BL/6 (ApoE KO) (BL6) mantidos em uma dieta de alta gordura colesterol elevado (HCHFD ou HCD) por 18 semanas, 1 x 104 - 2 x 104 CD45++ de F4/80 macrófagos aórtico podem ser isolados quando duas amostras são em pool. Fígados dissecados de ratos alimentados com HFHCD KO ApoE, produziu maior que 5 x 105 classificados células de Kupffer (que depende do tempo de classificação disponível)...

Este protocolo permite que um pesquisador isolar e caracterizar residente em tecido marca de macrófagos em vários tecidos inflamados, extraídos de modelos induzida por dieta de distúrbios metabólicos.

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e caracterizar de forma eficaz macrófagos de tecidos comumente afetados pela inflamação induzida pela dieta, como o fígado. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de imunologia e inflamação sobre como o fenótipo de macrófagos residentes em tecidos pode determinar a progressão de doenças inflamatórias crônicas. A principal vantagem deste método é que ele otimiza as etapas de isolamento necessárias para obter suspensões de células únicas derivadas de tecidos afetados pela inflamação crônica de baixo grau mediada pela obesidade.Demonstrará o procedimento Joselyn Allen, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para isolar o fígado, posicione primeiro um camundongo embebido em etanol em posição supina sobre uma placa de dissecção de espuma de poliestireno e fixe as patas dianteiras e traseiras. Em seguida, use uma pinça de ponta média para segurar a pele abdominal próxima à abertura da uretra e utilize uma tesoura de dissecção afiada para fazer uma pequena incisão na pele levantada.Insira a lâmina inferior da tesoura na incisão entre a pele e o peritônio e faça uma incisão lateral da virilha até o queix

isolation-characterization-purification-macrophages-from-tissues

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um novo método para obter macrófagos de cultura primária de células de fígado de rato é descrito. Este método utiliza a proliferação de macrófagos na cultura, seguido por agitação de frascos de cultura e purificação pelo apego seletivo para pratos de plástico. Esta técnica proporciona eficiente macrófagos do fígado, sem equipamentos complexos e habilidades.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

Aqui, nós detalhe uma metodologia para o isolamento rápido de células de ratinho intestinais dendríticas (DC) e macrófagos. Caracterização fenotípica de DCs intestinais e macrófagos é realizada utilizando várias cores análise de fluxo citométrico enquanto enriquecimento grânulo magnético seguido por separação de células é usado para produzir populações altamente puros para estudos funcionais.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

O artigo descreve a adaptação prontamente...

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

O tecido adiposo (TA) é um site de ativação imune celular intensa e interação. Quase todas as células do sistema imune estão presentes em AT e as suas proporções são alteradas pela obesidade. Isolamento adequado, quantificação e caracterização de populações de células imunes são fundamentais para a compreensão do seu papel na doença immunometabolic.

Isolamento de tecido adiposo de células imunes

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Descrevemos aqui um protocolo simples para isolar macrófagos peritoneais murinos. Este procedimento é seguido pela extração de RNA para realizar a análise da expressão gênica após a estimulação de receptores do tipo Toll.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

Este artigo descreve um método para analisar o conteúdo da célula imune do tecido adiposo por isolamento de células do sistema imunológico de tecido adiposo e posterior análise utilizando a citometria de fluxo.

Caracterização de células imunes no tecido adiposo humano usando citometria de fluxo

Apresentamos um protocolo para obter assinaturas de proteomic de macrófagos humanos e aplicar isso a determinação do impacto de um ambiente de baixo oxigênio na polarização do macrófago.

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Aprenda a isolar e caracterizar macrófagos residentes em tecidos afetados por inflamação induzida por dieta, como o fígado. Este método otimiza a obtenção de suspensões de células únicas para estudos em imunologia e doenças inflamatórias crônicas.

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

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