resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

A flexibilidade conformacional desempenha um papel crítico na função da proteína e o objetivo geral da Espectrometria de Massa de Troca de Hidrogênio-deutério de Ionização por ElectroSpray Resolvida no Tempo é investigar mudanças estruturais rápidas que impulsionam a função em proteínas ordenadas e desordenadas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia estrutural, como a craterização de confirmações de proteínas transitórias, que não é mínima para as técnicas clássicas de alta resolução, como eletrocistografia e RMN. A principal vantagem dessa técnica é que as reações podem ser monitoradas na escala de tempo de milissegundos, o que é importante para caracterizar cristas de loop, Moltinglobyals e proteínas intrinsecamente desordenadas.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia de distúrbios neurodegenerativos. Como muitas vezes envolvem o desdobramento ou agregação de regiões proteicas intrinsecamente desordenadas. Embora esse método possa fornecer informações sobre proteínas estruturadas semanais, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como enzimas submetidas a renovação catalítica ou a caracterização de proteínas, proteínas e proteínas, liganas, interações.

Para iniciar este procedimento, laser uma placa através de um canal de entrada para introduzir os reagentes, uma câmara de pró-diálise e um canal de saída, em um bloco PMM8 padrão, usando um gravador a laser. Em seguida, corte um capilar de metal de aço inoxidável de calibre 30 em dois pedaços de 10 centímetros usando uma ferramenta rotativa para o disco de corte de 164 polegadas de espessura. Use lixa para alisar a extremidade dos capilares, o que pode ser facilitado pela visualização sob um microscópio de luz.

Agora, derreta esses capilares no bloco PMM8 gravado usando um ferro passeante. Para construir um misturador cinético de fluxo contínuo, resolvido no tempo, insira um capilar de vidro cilica fundido de 40 centímetros em um capilar de metal de aço de calibre 28 de aproximadamente 15 centímetros. Em seguida, produza um entalhe de dois milímetros, usando configurações de gravador a laser de baixa potência em uma extremidade do capilar de vidro interno e sele essa extremidade do capilar de vidro interno.

Esta é uma etapa crítica que garante a mistura ortogonal e eficiente da proteína, que sai pelo entalhe que se deteriora em comum. O espaço intercapilar de dois milímetros entre o entalhe e a extremidade do capilar é a mistura e o volume. Conecte conexões de tamanho apropriado e mangas de tubulação e incorpore um conector T, que será usado para fornecer deterium.

Em seguida, alinhe o capilar de vidro interno com a extremidade do capilar de metal, o que pode ser facilitado pela visualização sob um microscópio de luz. Marque isso como a posição de zero milímetro. Conecte este misturador cinético a uma extremidade da mistura T.Em seguida, conecte um capilar de vidro de sílica fundido de 40 centímetros à extremidade oposta do misturador cinético na mistura T.Para ativação da pepsina, suspenda 20 miligramas de pepsina da mucosa gássica de Porsena em um mililitro de tampão de acoplamento.

Adicione 50 miligramas de velocidades agrícolas ativadas pelo NHS aos protiens ressuspensos e gire suavemente durante a noite, a quatro graus Celsius. No dia seguinte, gire a mistura mil vezes G por dois minutos em temperatura ambiente para coletar a resina. Em seguida, aspire os protiyes não ligados.

Em seguida, incube os agros em um mililitro de tampão de bloqueio e gire suavemente em temperatura ambiente por uma hora. Depois de coletar a resina e aspirar o tampão de bloqueio, incubar os agguros de pepsina com um mililitro de ácido acédico a cinco por cento por cinco minutos. Gire a mistura a 1.000 vezes G, por dois minutos em temperatura ambiente, para coletar a resina e, em seguida, aspire o super natente.

Depois de repetir as etapas anteriores, para um total de três lavagens, armazene as contas em um mililitro de ácido acédico a quatro graus Celsius para uso a longo prazo. Para montar o dispositivo, encha uma câmara de protiálise com uma pasta de esferas de agguros de pepsina ativada em ácido acédico a cinco por cento usando uma espátula estéril. Coloque a plataforma micro falítica de PMMA entre dois blocos de PMMA em branco como uma tampa para selar o dispositivo, forrada com borracha de silicone para criar uma vedação à prova de líquidos.

Use placas de fixação metálicas para selar o dispositivo com pressão. Em seguida, conecte o T de mistura à entrada do dispositivo usando acessórios apropriados. Agora flua cinco por cento de ácido acédico através da linha ácida a uma taxa de dez microlitros por minuto.

Em seguida, flua 50 milímetros de tampão de ácido de amônia através da linha de proteína a uma taxa de um microlitro por minuto. Acople o dispositivo à extremidade frontal de um tempo de voo quadrapolo modificado ou espectrômetro de massa Qtof, usando um estágio isolado ajustável para obter condições ideais de eletropulverização. Depois de definir as condições ESI-MS, adquira um espectro apenas de pepsina.

Em seguida, introduza 50 a 100 micromoler de tau, ou proteína fosfo-tau a uma taxa de um microlitro por minuto, onde o tampão de acitato de amônio de 50 milímetros estava fluindo anteriormente. Depois de permitir que o sistema se equilibre por pelo menos 10 minutos, antes da aquisição, adquira apenas o espectro da proteína. Enquanto a proteína Tao, ou fosfotao, está fluindo, introduza óxido de dutério a uma taxa de três microlitros por minuto, através do conector T, e permita reagir no misturador cinético.

Para aumentar o tempo de rotulagem, recue manualmente a posição do capilar de vidro interno para obter tempos de mistura de 42 milissegundos a oito segundos, permitindo que o sistema se equilibre por pelo menos 10 segundos entre cada recuo. Esta animação descreve o fluxo de trabalho para um experimento típico. A proteína sai pelo entalhe e se mistura com o dutério que se aproxima.

Os hidrogênios M8 da estrutura são trocados durante o tempo de reação alocado, que pode ser variado puxando para trás o capilar da proteína. A reação é então extinta e digerida em uma plataforma microfluídica contendo uma agulha ESI de saída. O espectro resultante contém proteína digerida.

A porcentagem de captação de deutério é calculada para peptídeos individuais e, em seguida, mapeada na estrutura da proteína 3D. Os perfis de digestão de nativo e fosfo-tau foram semelhantes, produzindo uma cobertura de sequência de 77,1 e 71,7 por cento, respectivamente, as distribuições isotópicas mais adequadas e os valores de captação de deutério associados para quatro peptídeos simples são mostrados aqui. O gráfico cinético observado de porcentagem de captação de deutério, versus tempo, para cada peptídeo é usado para extrair a taxa experimental observada.

Os perfis quale aleatórios calculados são mostrados para comparação e são usados para extrair o grau teórico intrínseco. Como esperado, nenhum fator de proteção foi observado na faixa, normalmente associado a elementos de estrutura secundária, confirmando que a tau nativa exibe ligações internas de hidrogênio fracas. Proteção significativa é observada nos terminais N e C, no domínio central e nas regiões propensas à agregação.

Na tau relacionada ao hiperfosfo, foi observado um aumento geral na captação de deutério através da proteína. Há aumentos significativos nos terminais N e C e na região do hexapeptídeo dois. Os fatores de grau de proteção são coloridos como um esquema de arco-íris, conforme mostrado aqui.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em poucas horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante usar regiões de grau HPC, ou superior, para minimizar os contaminantes, pois eles podem interferir na análise. Após este procedimento, outros métodos, como marcação covalente, reticulação química, modelagem computacional e estudos documentais podem ser realizados para combinar estruturas proteicas tridimensionais ou confirmar áreas de proteína proteína e interação proteína legin.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia estrutural, explorarem proteínas e domínios intrinsecamente desordenados, mais comuns em doenças nuerodegenerativas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a ionização por eletrospray resolvida no tempo, troca de deutério de hidrogênio, espectrometria de massa, para o estudo da estrutura e dinâmica da proteína.