Question 1

O que é RNA-seq e como isso difere dos microarrays?

Accepted Answer

RNA-seq é uma técnica de sequenciamento de alto rendimento que mede a sequência e a quantidade de todo o RNA expresso em uma população celular, chamado o transcriptoma. Diferentemente dos microarrays, que investigam sequências de RNA conhecidas, o RNA-seq pode criar perfis expressão gênica de organismos com genomas não sequenciados e medir com precisão uma gama maior de níveis de expressão de transcritos, especialmente em níveis muito baixos ou muito altos.

Question 2

Por que o rRNA é removido antes da preparação da biblioteca de RNA-seq?

Accepted Answer

A maioria do RNA nas células é RNA ribossomal (rRNA), que é o componente central da maquinaria de produção de proteínas da célula. Remover o rRNA facilita a recuperação de outros tipos de transcrição para medição precisa. O rRNA é tipicamente removido hibridizando a amostra com oligonucleotídeos complementares ligados a contas magnéticas, depois usando um ímã para separar o rRNA do resto da amostra.

Question 3

Como as amostras de RNA são convertidas em DNA para sequenciamento?

Accepted Answer

Porque o RNA é inerentemente propenso à degradação, é primeiro transcrito reversamente para DNA de fita dupla. Sequências de oligonucleotídeos chamadas adaptadores são então ligadas aos fragmentos de DNA. Esses adaptadores contêm regiões constantes que servem como locais de ligação de primers para amplificação por PCR e sequências únicas chamadas códigos de barras que identificam fragmentos de cada amostra.

Question 4

Que papel os códigos de barras desempenham na preparação da biblioteca de RNA-seq?

Accepted Answer

Os códigos de barras são sequências únicas de oligonucleotídeos contidas em adaptadores que identificam todos os fragmentos de DNA originários de uma única amostra. Isso permite que as bibliotecas de diferentes amostras sejam misturadas e sequenciadas simultaneamente. Após o sequenciamento, os códigos de barras permitem que os pesquisadores classifiquem e analisem as leituras por sua amostra de origem.

Question 5

Como é avaliada a qualidade dos dados de RNA-seq durante o sequenciamento?

Accepted Answer

A qualidade do sequenciamento é indicada pela pontuação Q, que reflete a probabilidade de uma base incorreta ser identificada. Pontuações Q maiores que 30 correspondem a menos de 1 chance em 1.000 de uma leitura incorreta. Além disso, sequências de DNA de referência adicionadas em baixa concentração servem como controle de qualidade, e sua recuperação na taxa esperada indica que todas as sequências da biblioteca estão uniformemente representadas.

Question 6

O que o RNA-seq pode revelar sobre as diferenças de expressão gênica entre amostras?

Accepted Answer

RNA-seq pode identificar genes que são diferencialmente expressos sob diferentes condições comparando transcriptomas entre amostras. Os pesquisadores podem contar o número de leituras por transcrito para medir a abundância de RNA. Mesmo para organismos sem genomas sequenciados, as informações do transcriptoma podem ser comparadas a outras espécies sequenciadas para identificar genes com níveis de expressão aumentados ou diminuídos.

Question 7

Como é que o RNA-seq é usado para estudar interações RNA-proteína?

Accepted Answer

RNA-seq pode ser adaptado para identificar os transcritos aos quais uma proteína de interesse se liga, imunoprecipitando a proteína com anticorpos e definindo os RNAs ligados através do sequenciamento. Quando os complexos RNA-proteína são cruzados no início, a análise de sequenciamento pode mapear o local da ligação cruzada e identificar o local de ligação da proteína no RNA até o nível do nucleotídeo.

Sequenciamento de RNA - Questionário de avaliação