Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes
22 de maio de 2017
A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.
O objetivo geral desta análise de imagem é observar a motilidade da vesícula nos neurônios e quantificá-la facilmente. Essa abordagem permite analisar o tráfego de membrana em neurônios de maneira direta e eficaz em termos de tempo. Para iniciar este procedimento, transfira o útero para uma nova placa de Petri com 70% de etanol.
Em seguida, transfira o útero para outra placa de Petri com HBSS. Em seguida, remova os fetos do útero usando pinças de dissecação esterilizadas e tesouras cirúrgicas. Depois disso, coloque-os em uma nova placa de Petri com HBSS.
Sob um microscópio estéreo, remova a pele e os crânios e retire os cérebros usando a pinça de dissecação esterilizada. Em seguida, transfira-os para outra placa de Petri com HBSS. Remova as meninges usando uma pinça de dissecação esterilizada.
Em seguida, corte as regiões extras. Em seguida, transfira os córtices para uma nova placa de Petri com HBSS. Colete todos os córtices usando um conta-gotas descartável ou uma pipeta de 25 mililitros e coloque-os em um tubo de 15 mililitros.
Em seguida, remova o HBSS pipetando. Em seguida, adicione três mililitros de solução de enzima cortical cerebral ao tubo que contém os córtices. Coloque o tubo em banho-maria e incube-o a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Depois disso, adicione mais três mililitros de solução de enzima cortical cerebral no tubo que contém os córtices e incube-os a 37 graus Celsius em banho-maria por mais cinco minutos. Após cinco minutos, remova a solução de enzima cortical cerebral e adicione cinco mililitros de DMEM contendo 10% de soro fetal bovino. Dissocie os córtices pipetando suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta de cinco mililitros com uma ponta P1000 estéril.
Em seguida, pipete novamente os córtices usando uma pipeta de cinco mililitros com uma ponta P200. Coloque um filtro de células de náilon de 40 micrômetros em um tubo de 50 mililitros e filtre a suspensão para remover os detritos. Em seguida, centrifugar a suspensão a 420 vezes g durante cinco minutos à temperatura ambiente e, em seguida, retirar o meio DMEM.
Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de cultura cortical cerebral e ressuspenda suavemente o pellet celular. Em seguida, conte as células usando um hemocitômetro e ajuste a concentração celular usando o meio de cultura cortical cerebral. Em seguida, coloque três vezes 10 para os seis neurônios corticais em dois mililitros de suspensão celular para cada prato de fundo de vidro codificado de 35 mililitros.
Neste procedimento, misture quatro microgramas de plasmídeo com 200 microlitros de meio isento de soro. Em um tubo separado, diluir oito microlitros do reagente de transfecção em 200 microlitros de meio sem soro. Em seguida, incube a solução por cinco minutos em temperatura ambiente.
Após cinco minutos, misture a solução de plasmídeo e a solução reagente de transfecção e incube a mistura por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a mistura aos pratos de fundo de vidro codificados. Incube os neurônios a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, substitua o meio por dois mililitros de meio de cultura cortical cerebral e incube os neurônios a 37 graus Celsius por um a dois dias. Para imagens, use um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD com lentes objetivas de 40X. Mantenha a temperatura em 37 graus Celsius usando um sistema de incubação.
Adquira imagens de neurônios em um quadro a cada cinco segundos durante um período de 100 segundos controlado pelo software de aquisição de imagem. Para analisar as imagens, abra todas as imagens sequenciais no software ImageJ com Rastreamento Manual. Para combinar as imagens sequenciais, escolha Imagem, depois Pilhas, seguida por Imagens a serem empilhadas e clique em OK. Depois disso, escolha Plugins e Rastreamento manual.
Uma janela de rastreamento será exibida. Clique na caixa de seleção Mostrar parâmetros e defina os parâmetros de rastreamento na seção Parâmetros. Em seguida, clique em Adicionar faixa para iniciar uma nova faixa.
Depois de determinar as vesículas de interesse, clique no centro dos sinais nas imagens sequenciais para registrar as coordenadas xy. Repita este procedimento para coletar as coordenadas xy das vesículas de todas as imagens sequenciais, cada imagem avança automaticamente para a imagem sucessiva após a seleção do ponto de referência. Esta imagem mostra a motilidade de vesículas contendo LAMP-EGFP nos dendritos dos neurônios corticais de camundongos após dois dias de transfecção, iniciada em quatro DIV.
A inserção mostra a imagem de lapso de tempo das vesículas positivas para LAMP-EGFP. A ponta da seta vermelha indica uma vesícula em movimento e a ponta da seta azul indica uma vesícula em repouso. As pontas das setas laranja indicam sinais fluorescentes mais altos.
Aqui está a posição do eixo X dependente do tempo das vesículas positivas LAMP-EGFP. A vesícula no círculo vermelho, rotulada como b, está se movendo e a vesícula no círculo azul, rotulada como a, está descansando. Este gráfico de barras indica a distância total do movimento LAMP-EGFP.
E este gráfico de barras indica a distância média de motilidade de um LAMP-EGFP contendo vesículas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para quantificar a motilidade de vesículas em neurônios, o que é essencial para compreender as funções neuronais. A abordagem permite uma análise direta do tráfego de membranas no sistema nervoso.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Tráfego de Membrana
Contexto
- O tráfego de membranas é essencial para a função neuronal.
- A motilidade de vesículas desempenha um papel fundamental nesse processo.
- Compreender esses mecanismos pode fornecer insights sobre a saúde neuronal.
- Os métodos atuais para quantificar o movimento de vesículas são frequentemente complexos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método prático para quantificar a motilidade de vesículas.
- Facilitar a análise do tráfego de membranas em neurônios.
- Aprimorar a compreensão das funções neuronais por meio de metodologias aperfeiçoadas.
Métodos Utilizados
- Análise de imagem para observar a motilidade de vesículas.
- Transferência de amostras biológicas para meios apropriados para análise.
- Uso de ferramentas esterilizadas para manipulação de amostras.
- Procedimentos eficientes em tempo para quantificação.
Resultados Principais
- O método permite a quantificação fácil da motilidade de vesículas.
- Oferece uma abordagem direta para analisar o tráfego de membranas.
- Os resultados podem contribuir para uma melhor compreensão das funções neuronais.
- Aplicações potenciais em diversas áreas de pesquisa em neurociência.
Conclusões
- Este método simplifica o estudo da motilidade de vesículas em neurônios.
- Pode ser adaptado para diversas aplicações em neurociência.
- Pesquisas futuras podem se basear nesta abordagem para explorar a saúde neuronal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da motilidade de vesículas fornece informações essenciais sobre os mecanismos de tráfego de membranas que influenciam a saúde neuronal e os fenótipos de doenças. Este método permite a validação precoce de alvos ao associar dinâmicas subcelulares a resultados funcionais em modelos de neurodegeneração. A abordagem reforça a confiança preditiva em triagens pré-clínicas ao fornecer leituras quantitativas e reprodutíveis do transporte vesicular em sistemas neuronais relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição da motilidade de endossomos e lisossomos como indicadores funcionais da saúde neuronal.
- Valor Operacional: Apoia a desconsideração de riscos biológicos por meio da quantificação padronizada do movimento de vesículas em modelos celulares relevantes para doenças.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao correlacionar defeitos de motilidade com vias mecanicistas em distúrbios neuronais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece medidas quantitativas de distância e taxa de motilidade para triagem de compostos em neuritos e soma.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade do ensaio por meio de rastreamento baseado no ImageJ com parâmetros definidos e imagens de lapso de tempo.
- Escalabilidade: Compatível com múltiplos tipos celulares, incluindo fibroblastos e células endoteliais, permitindo reutilização em diferentes plataformas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao vincular a dinâmica de vesículas à sobrevivência neuronal e à função sináptica.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio de leituras consistentes de motilidade em diferentes modelos.
- Mitigação de Riscos: Orienta decisões de avanço ajustadas ao risco ao identificar compostos que resgatam defeitos no tráfego intracelular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer dados quantitativos de motilidade que informam o engajamento do alvo e a modulação da via em sistemas neuronais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação do movimento de vesículas como indicador funcional da integridade do tráfego de membranas.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio por meio de protocolos padronizados de imageamento e rastreamento para análise de vesículas dependente do tempo.
- Análises: Gera métricas de distância de mobilidade e movimento médio que permitem análise comparativa entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Estabelece conexão com a continuidade pré-clínica ao associar defeitos no transporte vesicular a mecanismos de doenças neurodegenerativas.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma de imageamento reutilizável, aplicável a diversas linhagens celulares neuronais e não neuronais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade nos vínculos mecanicistas entre defeitos de tráfego e fenótipos neuronais.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e reprodutibilidade por meio de análises baseadas em plug-ins e parâmetros de rastreamento definidos.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer dados objetivos e quantitativos sobre o engajamento do alvo nas vias de motilidade de vesículas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao identificar compostos que modulam a dinâmica endossomo-lisossomo em modelos de doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura neuronal, transfeção e microscopia de fluorescência para marcação e imagem precisa de vesículas.
- Depende da plataforma ImageJ com o plugin Manual Tracking e capacidades de processamento sequencial de imagens.
- Necessita padronização da eficiência de transfeção, intervalos de aquisição de imagens e parâmetros de rastreamento entre experimentos.
- A adaptação a diferentes linhagens celulares pode exigir otimização da expressão do marcador e das medidas basais de motilidade.
- As limitações práticas incluem a dependência da eficiência de transfeção e a possível fototoxicidade durante a aquisição prolongada de imagens em lapso de tempo.
