Name: Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a quantificar a motilidade de vesículas em neurônios cultivados usando análise de imagem e sondas fluorescentes. Este método simplifica o estudo do tráfego de membranas em neurociência celular.

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Agradecemos ao Dr. Ricardo Dolmetsch (Faculdade de Medicina da Universidade de Stanford, afiliação atual: Novartis Institutes for Biomedical Research) por ajudar a desenvolver essa análise e ao Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara e Dongsook Kim por sua leitura crítica do manuscrito.

Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Tsukuba (IACUC). 1. Dissecção <ol><li> Para preparar os fetos embrionários do dia 13-14 ICR ou C57BL / 6, eutanásia camundongos grávidas por deslocamento cervical. Remova o útero e coloque-o em uma placa de Petri com Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Enxaguar bem para remover o sangue. </li><li> Usando fórceps, transferir o útero para uma nova placa de Petri com etanol a 70% para esterilizar. </li><li> Transferir o útero para uma nova placa de Petri com HBSS. Remova os fetos do útero usando fórceps de dissecação esterilizados e tesoura cirúrgica. </li><li> Decapitar os fetos usando tesoura cirúrgica. Coloque-os em uma nova placa de Petri com HBSS. </li><li> Remova a pele eo crânio e tire os cérebros usando fórceps de dissecação esterilizados. Colocá-los em uma placa de Petri com HBSS. NOTA: A partir desta etapa, é melhor realizar o procedimento emBanco. </li><li> Remova as meninges usando fórceps de dissecação esterilizados sob um microscópio estéreo. Corte os gânglios basais, hipocampo e cerebelo usando fórceps. Usando fórceps de ponta curvada, transfira os cortices para uma nova placa de Petri com HBSS. </li><li> Recolher todos os cortices usando um conta-gotas descartable ou uma pipeta de 25 mL. Coloque-os em um tubo de 15 mL e, em seguida, remova o HBSS por pipetagem. </li><li> Adicione 3 mL de solução de enzima cortical cerebral ao tubo contendo os cortices. Coloque este tubo em banho-maria e incuba a 37 ° C durante 5 min. NOTA: Prepare uma enzima de cultura cortical cerebral que consiste em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,25% de tripsina e 1 mM de EDTA. Esterilize com um filtro de 0,22 μm. </li><li> Adicionar mais 3 mL de solução de enzima cortical cerebral no tubo que contém os cortices e incubar a 37 ° C num banho de água durante 5 minutos adicionais. </li><li> Remova a solução de enzima cortical cerebral usando uma pipeta de 5 mL e adicione 5 mL de DulbeCco de Eagle Modificado (DMEM) contendo 10% de Soro Bovino Fetal (FBS). </li><li> Dissociar os córtices pipetando suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta de 5 mL com uma ponta P1000 estéril. Pipetar novamente usando uma pipeta de 5 mL com uma ponta P200. </li><li> Coloque um filtro de nylon de 40 μm em um tubo de 50 mL e filtre a suspensão para remover os detritos. </li><li> Centrifugar a 420 xg durante 5 min à TA e em seguida remover o meio DMEM. </li><li> Adicionar 5 mL de meio de cultura cortical cerebral e ressuspender suavemente o sedimento celular. NOTA: Preparar um meio de cultura cortical cerebral constituído por meio basal de neurônio suplementado com 1x suplementos de B-27, 2 mM de L-glutamina e 100 U / mL de penicilina estreptomicina. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro e ajustar a concentração celular (como desejado) usando o meio de cultura cortical cerebral. </li><li> Placa 3,0 × 10 6 neurónios corticais em 2,0 ml por placas de vidro revestidas de 35 mm. NOTA: Antes do revestimento,Placas de fundo de vidro de 35 mm com 0,1 mg / mL de bromidrato de poli-D-lisina (PDL) ou 0,01% de poli-L-ornitina (PLO). Incubar por 3 h - O / N a 37 ° C e lavar com PBS pelo menos 3x. </li></ol> 2. Motilidade da vesícula de imagem <ol><li> Preparar os plasmídeos que rotularão cada tipo de vesícula. Por exemplo, use EGFP-Rab5 para endossomas precoces, EGFP-Rab7 para endossomos tardios, LAMP-EGFP para lisossomas e EGFP-LC3 para autofagosomas 8,13. NOTA: Estes plasmídeos estão disponíveis a pedido de tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Tipicamente, os neurónios de 3 a 5 dias in vitro (DIV) podem ser transfectados com estes plasmídeos utilizando reagentes de transfecção. </li><li> Misturar 4,0 μg de plasmídeos com 200 μL de meio isento de soro por pipetagem. Num tubo separado, diluir 8 μL de reagente de transfecção (ver Tabela de Materiais ) em 200 μL de meio isento de soro. Incubar durante 5 min à RT. </li><li> Misturar a solução de plasmídeo e a solução regente de transfecção no passo 2.2 por pipetagem. Incubar durante 20 min à TA. </li><li> Adicionar meio isento de soro e 400 μL da solução de plasmídeo do passo 2.3 a cada placa de fundo de vidro revestido. Incubar os neurônios a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5% por 30 min. Substituir o meio por 2 mL de meio de cultura cortical cerebral. Incubar os neurônios a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5% por 1-2 dias. </li><li> Após 1 - 2 d de transfecção, seleccionar as células transfectadas para aquisição de imagem. NOTA: Os neurï¿½ios prematuros com menos de 7 DIV tï¿½ uma tendï¿½cia para exibir motilidade dinï¿½ica das vesï¿½ulas. Selecione os neurônios que moderadamente expressam a sonda de fluorescência porque imagens claras não podem ser obtidas quando um neurônio altamente expressivo é selecionado. Além disso, selecione uma forma neuronal típica, como neurônios piramidais, que têm axônios longos e intrincados dendrites, para facilitar a identificação do axônio e dendrites (ver Figura 1A). </li><li> Aquisição de imagens usando um sistema de geração de imagens de lapso de tempo: Para imagens, use um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD (Charge-Coupled Device) com lentes objetivas Plan Apo 0.95NA 40X ou 100X Plan Apo VC NA1.4. Controlar a temperatura a 37 ° C utilizando um sistema de incubação. Adquirir imagens de neurônios em um frame / 5 s durante um período de 100 s controlado pelo software de aquisição de imagem. Alternativamente, adquira imagens em intervalos mais curtos e por períodos de tempo mais longos, como em uma moldura por 2 s ao longo de um período de 300 s. NOTA: Uma variedade de aplicações está disponível para tirar imagens seqüenciais, muitas das quais seriam adequadas para este método. Portanto, nenhuma aplicação específica é recomendada; Em vez disso, cada pesquisador deve usar qualquer aplicação disponível. </li></ol> 3. Análise de Imagem <ol><li> Abra todas as imagens sequenciais no software ImageJ com Tracking manual 14 . NOTA: Até à data, o rastreamento manual foiDely usado nos experimentos de rastreamento 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Manual Tracking foi desenvolvido pelo Dr. Fabrice Cordelières. Instruções pormenorizadas por escrito estão disponíveis online 20 . Para a análise, a qualidade dos dados de imagem é melhorada com um número suficiente de imagens. Recomenda-se a utilização de mais de 20 imagens. </li><li> Para combinar as imagens seqüenciais, escolha &lt;Image&gt; → &lt;Stacks&gt; → &lt;Images to Stack&gt;. Clique em &lt;OK&gt;. </li><li> Escolha &lt;Plugins&gt; → &lt;Manual Tracking&gt;; Uma janela de acompanhamento aparecerá. </li><li> Clique na caixa de seleção de &lt;Show Parameters?&gt; E defina os parâmetros de rastreamento na seção de parâmetros. NOTA: Vários parâmetros podem ser definidos, incluindo intervalo de tempo, calibração x / y, calibração z, tamanho quadrado de pesquisa para centroTamanho do ponto, largura da linha e tamanho da fonte. Neste ensaio simplificado, foram definidos tanto o intervalo de tempo como a calibração x / y. Sob outras circunstâncias experimentais, pode ser necessário definir outros parâmetros também. Os parâmetros utilizados aqui são os seguintes: o &lt;Intervalo de tempo&gt; é 5 s ea calibração &lt;x / y&gt; é de 0,26642 μm para uma lente objectiva Plan Apo 0,95NA 40X ou 0,10657 μm para um plano 100X Apo VC NA1.4 lentes objetivas. </li><li> Após a definição dos parâmetros, clique em &lt;adicionar faixa&gt; para iniciar uma nova faixa. </li><li> Após a determinação das vesículas de interesse ( por exemplo, as vesículas indicadas por setas azuis e vermelhas na Figura 1A (painel direito)), clique no centro dos sinais nas imagens sequenciais para registar as coordenadas xy. Os resultados das coordenadas xy registradas, distância e velocidade aparecem em uma nova janela. NOTA: No caso de lisossomas, sinais luminosos fluorescentes grandes ( por exemplo, FigUre 1A (painel direito), seta alaranjada) são freqüentemente observados nos neurônios. Como estes sinais ocasionalmente exibem vesículas acumuladas ou varicosidades patológicas, estes sinais devem ser evitados para quantificar a motilidade. </li><li> Repita o passo 3.6 para coletar as coordenadas xy de vesículas de todas as imagens seqüenciais; Cada imagem avança automaticamente para a imagem sucessiva após a selecção do ponto de referência. </li><li> Exporte esses dados para uma nova tabela ( por exemplo, uma planilha). Use um software adequado para criar um gráfico adequado (consulte a Tabela de Materiais ). NOTA: Para analisar os dados, selecione a coluna &lt;Distância&gt;, resuma todos os valores dessa coluna e mostre uma distância de motilidade como um gráfico de barras, como na Figura 1B . Além disso, repita este passo, calcule a média da distância total da motilidade e mostre como um gráfico de barras, como na Figura 1C . O software para criar um gráfico de barras e dados de forma de ondaA Tabela de Materiais. </li></ol>

<ol><li>Nicot, A. S., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+phosphoinositides+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endosomal phosphoinositides and human diseases.</a> Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).</li>
<li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra0910494">Mendelian disorders of membrane trafficking.</a> N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+endosome+motility+depends+on+lipids+via+the+small+GTPase+Rab7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7.</a> EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).</li>
<li>Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+transport+along+the+lysosomal+pathway+in+mucolipidosis%2C+type+IV+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).</li>
<li>Venugopal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurologic%2C+gastric%2C+and+opthalmologic+pathologies+in+a+murine+model+of+mucolipidosis+type+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV.</a> Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+mechanism+to+regulate+lysosome+motility+for+lysosome+positioning+and+tubulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation.</a> Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).</li>
<li>Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIKfyve+regulates+CaV1.2+degradation+and+prevents+excitotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death.</a> J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).</li>
<li>Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIKfyve+mediates+the+motility+of+late+endosomes+and+lysosomes+in+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites.</a> Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).</li>
<li>McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+3%2C5-bisphosphate%3A+low+abundance%2C+high+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance.</a> Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).</li>
<li>Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plentiful+PtdIns5P+from+scanty+PtdIns%283%2C5%29P2+or+from+ample+PtdIns%3F+PIKfyve-dependent+models%3A+Evidence+and+speculation+%28response+to%3A+DOI+10.1002%2Fbies.201300012%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012).</a> Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).</li>
<li>Chow, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+FIG4+causes+neurodegeneration+in+the+pale+tremor+mouse+and+patients+with+CMT4J%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J.</a> Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Vac14%2C+a+regulator+of+the+signaling+lipid+phosphatidylinositol+3%2C5-bisphosphate%2C+results+in+neurodegeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li>
<li>Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> (2017).</li>
<li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide-independent+social+motility+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 6 (1), e16102(2011).</li>
<li>Tan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+four+type+IV+pilin+homologues+in+Stigmatella+aurantiaca+DSM17044+by+heterologous+expression+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 8 (9), e75105(2013).</li>
<li>Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+variant+of+cortactin+linked+to+acute+lung+injury+impairs+lamellipodia+dynamics+and+endothelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).</li>
<li>Dahirel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+propensity+and+ability+correlate+with+ecological+specialization+in+European+land+snails%3A+comparative+analysis+of+a+dispersal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Ecol%22%5BJournal%5D)">Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome.</a> J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).</li>
<li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+type+IV+pili+activity+and+exopolysaccharides+secretion+controls+motility+patterns+in+single+cells+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus.</a> Sci Rep. 6, 17790(2016).</li>
<li>Cordelières, F. P. Manual Tracking [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf</a> (2017).</li>
<li>ImageJ Tracking plug-in [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/Category:Tracking">https://imagej.net/Category:Tracking</a> (2017).</li>
<li>Tinevez, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , (2016).</li>
<li>Ekvall, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+small+aquatic+organisms+using+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles.</a> PLoS One. 8 (11), e78498(2013).</li>
<li>Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+solutions%3A+treating+lysosomal+disorders+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo introduz o procedimento para quantificar a motilidade vesicular. Nos neurônios primários, os endossomos e os lisossomos tendem a apresentar alta motilidade em neurônios mais jovens (4-6 DIV). Dado que os neurônios devem fornecer alguns componentes para os bordos de ataque para alongar os processos neurais, o tráfico de membranas deve ocorrer dinamicamente durante esta fase. Assim, é importante usar neurônios mais jovens para observar a motilidade dinâmica em dendritos neuronais. Além disso, vesículas maio...

O controle preciso do tráfico de endossomas-lisossomos é indispensável para a regulação da função neuronal. Notavelmente, os movimentos dinâmicos destas vesículas são um factor chave subjacente à regulação da morfologia neuronal, desenvolvimento e sobrevivência. Defeitos neste sistema causam graves distúrbios neuronais 1 , 2 . Os mecanismos moleculares que ligam o tráfico de vesículas a doenças neuronais são considerados complicados, e vários grupos têm procurado examinar essa relevância. Por exemplo, foi relatado que a motilidade endosómica tardia perturbada está significativamente associada com a doença 3 de Niemann-Pick C, uma doença neurodegenerativa hereditária causada por defeitos de lisossoma. Outro exemplo é uma mutação num canal de Ca 2+ lisossómico , trpml 1, que prejudica a motilidade lisossómica, resultando em doenças de armazenamento lisossomal 4 , 5 , </Sup&gt; 6 . Nosso grupo relatou que a desregulação do PtdIns (3,5) P 2 volume de negócios suprime endosome e motilidade lisossomo nos neurônios, levando a um aumento da vulnerabilidade à resposta ao estresse 7 , 8 . A regulação metabólica de PtdIns (3,5) P 2 , que localiza principalmente os endossomas e os lisossomas tardios, desempenha um papel importante em uma ampla variedade de funções celulares, incluindo o tráfico de vesículas e os processos de fusão-fissão 9,10. Uma vez que o PtdIns (3,5) P 2 alterado provoca neurodegeneração grave 11,12, a regulação aberrante da motilidade endosoma-lisossoma pode ser um fator chave para a compreensão da patogênese da neurodegeneração. Uma investigação dos mecanismos moleculares subjacentes à motilidade vesicular pode assim fornecer pistas promissoras que podem aprofundar a nossaVários distúrbios neuronais. Neste artigo, introduzimos um valioso método para quantificar a motilidade vesicular em neurônios usando um pacote de software livre chamado Manual Tracking. O objetivo foi desenvolver um método de quantificação rápida para analisar a motilidade vesicular. Esta quantificação é dirigida através de uma abordagem padrão de clicar em um ponto de referência em cada quadro de um filme de lapso de tempo. O uso do software de rastreamento manual torna essa abordagem bastante simples e de ampla utilidade, ao contrário de outras aplicações. Além disso, esta abordagem é também aplicável a outras células, tais como células gliais. Embora este método seja primitivo, pode ser aplicado a várias análises, incluindo a motilidade celular ea alteração morfológica. Por exemplo, depois de definir um ponto de referência em uma seqüência de imagens, informações sobre as posições dos pontos de referência eo tempo em cada posição podem ser extraídos de imagens seqüenciais usando a análise de dados e softwares de processamento de imagenslouça. Tomados em conjunto, este método é simples, mas poderoso e contribui para o desenvolvimento de maior eficiência em estudos baseados no tráfico de membranas, como aqueles que examinam a função do endossoma-lisossoma.

<table><tbody><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td>Meio livre</td></tr><tr><td>de soro Solução salina balanceada de Hank (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptmicina</td><td>Thermo</td><td>Fisher 15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplementos</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>2,5% de tripsina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>bromidrato de poli-D-lisina (PDL)</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina (PLO)</td><td>Filtro</td> de células <td></td> de nylon Sigma P4957 <td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Polietilenoimina "Max" (PEI)</td> <td>policiências</td><td>24765</td><td>Reagente de transfecção. Como alternativa ao Lipofectamine2000, está disponível 0,1 mg / mL de polietilenoimina dissolvida em água esterilizada. Mas é baixa eficiência e alta toxicidade.</td></tr><tr><td>BIOREVO BZ-9000</td><td>Keyence</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de incubação INUG2-K13</td><td>Tokay Hit</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism versão 6.0</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Excel versão 15</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ verion 1.47</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de endosome e moosidades de lisosoma em neurônios cultivados usando sondas fluorescentes

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

No cérebro, os sistemas de tráfico de membrana desempenham papéis importantes na regulação de funções neuronais, como morfologia neuronal, plasticidade sináptica, sobrevivência e comunicações gliais. Até à data, numerosos estudos têm relatado que defeitos nestes sistemas causam várias doenças neuronais. Assim, a compreensão dos mecanismos subjacentes à dinâmica das vesículas pode fornecer pistas influentes que poderiam auxiliar no tratamento de vários distúrbios neuronais. Aqui, descrevemos um método para quantificar motilidades de vesículas, tais como a distância de motilidade e a velocidade de movimento, utilizando um plug-in de software para a plataforma ImageJ. Para obter imagens para quantificação, marcamos estruturas de endossomas neuronais-lisossomas com proteínas marcadoras de vesículas marcadas com EGFP e observamos o movimento de vesículas usando uma microscopia de lapso de tempo. Este método é altamente útil e simplifica a medição da motilidade vesicular em neurites, tais como axônios e dendritos, bem como no soma de ambos os neurônios e células gliais. MaismoRe, este mï¿½odo pode ser aplicado a outras linhas celulares, tais como fibroblastos e cï¿½ulas endoteliais. Esta abordagem poderia fornecer um avanço valioso da nossa compreensão do tráfico de membrana.

Este ensaio foi concebido para medir a dinâmica das vesículas em culturas in vitro . Este ensaio foi utilizado para determinar a motilidade vesicular associada com morfologia neuronal e sobrevivência. As Figuras 1A e B apresentam dados representativos que mostram a motilidade dos lisossomas nos neurónios. Os neurï¿½ios corticos foram transfectados com o marcador de lisossoma, LAMP-EGFP, e observados utilizando um microscï¿½io de fluores...

A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

O objetivo geral desta análise de imagem é observar a motilidade de vesículas em neurônios e quantificá-la de forma fácil. Esta abordagem permite analisar o tráfego de membranas em neurônios de maneira simples e eficiente em termos de tempo. Para iniciar este procedimento, transfira o útero para um novo recipiente de Petri com etanol a 70%.Em seguida, transfira o útero para outro recipiente de Petri com HBSS. Depois, remova os fetos do útero utilizando pinças de dissecação e tesoura cirúrgica esterilizadas. Após isso, coloque-os em um novo recipiente de Petri com HBSS.Sob um microscópio estereoscópico, remova a pele e os crânios e retire os cérebros utilizando pinças de dissecação esterilizadas. Em seguida, transfira-os para outra placa de Petri com HBSS. Remova as meninges utilizando pinças de dissecação esterilizadas.Em seguida, corte as regiões extras. Depois, transfira os córtices para um novo recipiente de Petri com HBSS. Colete todos os córtices utilizando um conta-gotas descartável ou uma pipeta de 25 mililitros e coloque-os em um tubo de 15 mililitros.Em seguida, remova o HBSS por pipetagem. Então, adicione três mililitros de solução enzimática do córtex cerebral ao tubo co

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A técnica de imagem ao vivo de fluorescência para quantificar o reabastecimento e mobilização de vesículas sinápticas específicas (SV) piscinas de terminais nervosos central é descrito. Duas rodadas de SV reciclagem são monitorados nos terminais nervosos mesmo fornecendo um controle interno.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

Este relatório descreve a utilização de imagens de células vivas e técnicas photobleach para determinar a expressão de superfície, as vias de transporte e de cinética de tráfico de exogenamente expressa, GFP sensível ao pH proteínas na membrana plasmática dos neurónios.

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução...

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Este vídeo demonstra como as vesículas neuronais são marcadas com proteínas fluorescentes específicas para visualizar seu movimento. Primeiro, um plasmídeo que codifica uma proteína fluorescente é incubado com um agente de transfecção e, em seguida, introduzido em uma cultura de neurônios. Posteriormente, imagens dos neurônios são adquiridas e analisadas para rastrear o movimento das vesículas.

Visualização da Motilidade da Vesícula em Neurônios Usando Imagem de Fluorescência

O transporte intracelular de cargas, como vesículas ou organelas, é realizado por proteínas motoras moleculares que rastreiam microtúbulos polarizados. Este protocolo descreve a correlação da direcionalidade do transporte de partículas de carga individuais que se movem dentro dos neurônios, com a quantidade relativa e o tipo de proteínas motoras associadas.

Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise &quot;Mapeamento Cargo&quot;

Este artigo fornece um método para investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma, usando uma construção de sinaptobrevin2-pHluorina e Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total. A estratégia desenvolvida para processamento de imagens e análise de dados também é relatada.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Este protocolo descreve um método para medir sensivelmente a taxa de transporte nucleocitoplasmático dentro de células NSC-34 do tipo neurônio motor, quantificando a mudança em tempo real na importação nuclear de uma proteína NLS-NES-GFP.

Ensaio para Medir o Transporte Nucleocitoplasmático em Tempo Real dentro de Células NSC-34 do tipo Motor-Neuron

Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

O artigo descreve a otimização dos parâmetros de aquisição da microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas marcadas endógenas com resolução de neurônio único em um nematóide vivo.

Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

Aprenda a quantificar a motilidade de vesículas em neurônios cultivados usando análise de imagem e sondas fluorescentes. Este método simplifica o estudo do tráfego de membranas em neurociência celular.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

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