Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes
22 de maio de 2017
A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.
O objetivo geral desta análise de imagem é observar a motilidade de vesículas em neurônios e quantificá-la de forma fácil. Esta abordagem permite analisar o tráfego de membranas em neurônios de maneira simples e eficiente em termos de tempo. Para iniciar este procedimento, transfira o útero para um novo recipiente de Petri com etanol a 70%.
Em seguida, transfira o útero para outro recipiente de Petri com HBSS. Depois, remova os fetos do útero utilizando pinças de dissecação e tesoura cirúrgica esterilizadas. Após isso, coloque-os em um novo recipiente de Petri com HBSS.
Sob um microscópio estereoscópico, remova a pele e os crânios e retire os cérebros utilizando pinças de dissecação esterilizadas. Em seguida, transfira-os para outra placa de Petri com HBSS. Remova as meninges utilizando pinças de dissecação esterilizadas.
Em seguida, corte as regiões extras. Depois, transfira os córtices para um novo recipiente de Petri com HBSS. Colete todos os córtices utilizando um conta-gotas descartável ou uma pipeta de 25 mililitros e coloque-os em um tubo de 15 mililitros.
Em seguida, remova o HBSS por pipetagem. Então, adicione três mililitros de solução enzimática do córtex cerebral ao tubo contendo os córtices. Coloque o tubo em banho-maria e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, adicione mais três mililitros de solução enzimática do córtex cerebral ao tubo contendo os córtices e incube-os a 37 °C em banho-maria por mais cinco minutos. Após cinco minutos, remova a solução enzimática do córtex cerebral e adicione cinco mililitros de DMEM contendo 10% de soro bovino fetal. Dissocie os córtices pipetando suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta de cinco mililitros com ponteira estéril P1000.
Em seguida, pipete novamente os córtices usando uma pipeta de cinco mililitros com ponteira P200. Coloque um filtro de células de náilon de 40 micrômetros sobre um tubo de 50 mililitros e filtre a suspensão para remover os detritos. Posteriormente, centrifugue a suspensão a 420 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente e, então, remova o meio DMEM.
Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de cultura cortical cerebral e ressuspenda suavemente o pellet celular. Em seguida, conte as células utilizando um hemocitômetro e ajuste a concentração celular usando o meio de cultura cortical cerebral. A seguir, plaque três vezes 10 elevado a seis neurônios corticais em dois mililitros de suspensão celular em cada placa de vidro de fundo plano de 35 mililitros codificada.
Neste procedimento, misture quatro microgramas de plasmídeo com 200 microlitros de meio livre de soro. Em um tubo separado, dilua oito microlitros do reagente de transfeção em 200 microlitros de meio livre de soro. Em seguida, incube a solução por cinco minutos à temperatura ambiente.
Após cinco minutos, misture a solução de plasmídeo e a solução do reagente de transfeção e incube a mistura por 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione a mistura aos discos codificados com fundo de vidro. Incube os neurônios a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Posteriormente, substitua o meio por dois mililitros de meio de cultura de córtex cerebral e incube os neurônios a 37 graus Celsius por um a dois dias. Para a aquisição de imagens, utilize um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD e objetivas de 40X. Mantenha a temperatura a 37 graus Celsius utilizando um sistema de incubação.
Adquira imagens de neurônios a cada cinco segundos durante um período de 100 segundos, controlado pelo software de aquisição de imagens. Para analisar as imagens, abra todas as imagens sequenciais no software ImageJ com Rastreamento Manual. Para combinar as imagens sequenciais, escolha Imagem, depois Pilhas, seguido por Imagens para Pilha e clique em OK. Em seguida, escolha Plugins e depois Rastreamento Manual.
Uma janela de rastreamento será exibida. Clique na caixa de seleção Mostrar Parâmetros e defina os parâmetros de rastreamento na seção Parâmetros. Em seguida, clique em Adicionar rastreamento para iniciar um novo rastreamento.
Após determinar as vesículas de interesse, clique no centro dos sinais nas imagens sequenciais para registrar as coordenadas xy. Repita este procedimento para coletar as coordenadas xy das vesículas em todas as imagens sequenciais; cada imagem avança automaticamente para a imagem seguinte após o ponto de referência ser selecionado. Esta imagem mostra a motilidade de vesículas contendo LAMP-EGFP nos dendritos de neurônios corticais de camundongo após dois dias de transfeção, iniciada aos quatro DIV.
O quadro mostra a imagem em lapso de tempo das vesículas positivas para LAMP-EGFP. A seta vermelha indica uma vesícula em movimento e a seta azul indica uma vesícula em repouso. As setas laranja indicam sinais fluorescentes mais intensos.
Aqui está a posição no eixo X dependente do tempo das vesículas positivas para LAMP-EGFP. A vesícula no círculo vermelho, identificada como b, está em movimento, e a vesícula no círculo azul, identificada como a, está em repouso. Este gráfico de barras indica a distância total do deslocamento de LAMP-EGFP.
E este gráfico de barras indica a distância média de motilidade de vesículas contendo LAMP-EGFP.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para quantificar a motilidade de vesículas em neurônios, o que é essencial para compreender as funções neuronais. A abordagem permite uma análise direta do tráfego de membranas no sistema nervoso.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Tráfego de Membrana
Contexto
- O tráfego de membranas é essencial para a função neuronal.
- A motilidade de vesículas desempenha um papel fundamental nesse processo.
- Compreender esses mecanismos pode fornecer insights sobre a saúde neuronal.
- Os métodos atuais para quantificar o movimento de vesículas são frequentemente complexos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método prático para quantificar a motilidade de vesículas.
- Facilitar a análise do tráfego de membranas em neurônios.
- Aprimorar a compreensão das funções neuronais por meio de metodologias aperfeiçoadas.
Métodos Utilizados
- Análise de imagem para observar a motilidade de vesículas.
- Transferência de amostras biológicas para meios apropriados para análise.
- Uso de ferramentas esterilizadas para manipulação de amostras.
- Procedimentos eficientes em tempo para quantificação.
Resultados Principais
- O método permite a quantificação fácil da motilidade de vesículas.
- Oferece uma abordagem direta para analisar o tráfego de membranas.
- Os resultados podem contribuir para uma melhor compreensão das funções neuronais.
- Aplicações potenciais em diversas áreas de pesquisa em neurociência.
Conclusões
- Este método simplifica o estudo da motilidade de vesículas em neurônios.
- Pode ser adaptado para diversas aplicações em neurociência.
- Pesquisas futuras podem se basear nesta abordagem para explorar a saúde neuronal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da motilidade de vesículas fornece informações essenciais sobre os mecanismos de tráfego de membranas que influenciam a saúde neuronal e os fenótipos de doenças. Este método permite a validação precoce de alvos ao associar dinâmicas subcelulares a resultados funcionais em modelos de neurodegeneração. A abordagem reforça a confiança preditiva em triagens pré-clínicas ao fornecer leituras quantitativas e reprodutíveis do transporte vesicular em sistemas neuronais relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição da motilidade de endossomos e lisossomos como indicadores funcionais da saúde neuronal.
- Valor Operacional: Apoia a desconsideração de riscos biológicos por meio da quantificação padronizada do movimento de vesículas em modelos celulares relevantes para doenças.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao correlacionar defeitos de motilidade com vias mecanicistas em distúrbios neuronais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece medidas quantitativas de distância e taxa de motilidade para triagem de compostos em neuritos e soma.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade do ensaio por meio de rastreamento baseado no ImageJ com parâmetros definidos e imagens de lapso de tempo.
- Escalabilidade: Compatível com múltiplos tipos celulares, incluindo fibroblastos e células endoteliais, permitindo reutilização em diferentes plataformas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao vincular a dinâmica de vesículas à sobrevivência neuronal e à função sináptica.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio de leituras consistentes de motilidade em diferentes modelos.
- Mitigação de Riscos: Orienta decisões de avanço ajustadas ao risco ao identificar compostos que resgatam defeitos no tráfego intracelular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer dados quantitativos de motilidade que informam o engajamento do alvo e a modulação da via em sistemas neuronais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação do movimento de vesículas como indicador funcional da integridade do tráfego de membranas.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio por meio de protocolos padronizados de imageamento e rastreamento para análise de vesículas dependente do tempo.
- Análises: Gera métricas de distância de mobilidade e movimento médio que permitem análise comparativa entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Estabelece conexão com a continuidade pré-clínica ao associar defeitos no transporte vesicular a mecanismos de doenças neurodegenerativas.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma de imageamento reutilizável, aplicável a diversas linhagens celulares neuronais e não neuronais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade nos vínculos mecanicistas entre defeitos de tráfego e fenótipos neuronais.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e reprodutibilidade por meio de análises baseadas em plug-ins e parâmetros de rastreamento definidos.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer dados objetivos e quantitativos sobre o engajamento do alvo nas vias de motilidade de vesículas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao identificar compostos que modulam a dinâmica endossomo-lisossomo em modelos de doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura neuronal, transfeção e microscopia de fluorescência para marcação e imagem precisa de vesículas.
- Depende da plataforma ImageJ com o plugin Manual Tracking e capacidades de processamento sequencial de imagens.
- Necessita padronização da eficiência de transfeção, intervalos de aquisição de imagens e parâmetros de rastreamento entre experimentos.
- A adaptação a diferentes linhagens celulares pode exigir otimização da expressão do marcador e das medidas basais de motilidade.
- As limitações práticas incluem a dependência da eficiência de transfeção e a possível fototoxicidade durante a aquisição prolongada de imagens em lapso de tempo.
