Name: Imagem de bioluminescência de Neuroinflammation em Ratinhos Transgénicos Após inoculação periférica de alfa-sinucleína fibrilas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a quantificar neuroinflamação em modelo murino de doença de Parkinson usando imagem de bioluminescência após injeção periférica de fibrilas de alfa-sinucleína. Este método permite monitoramento não invasivo e repetido da neuroinflamação.

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Os autores agradecem Olga Sharma, Theresa Hundt, e os funcionários das microscopia e animais instalações DZNE para suporte técnico.

Todos os procedimentos, incluindo animais foram realizados com a aprovação da comissão de proteção animal de Rhine-Westphalia Agência Norte Estadual do Meio Ambiente (LANUV). Os animais foram alojados e tratados de acordo com condições padrão com um 12 h ciclo de luz / escuro e acesso livre a alimento e água. 1. Modelo Animal <ol><li> Intercross hemizigótica Tg (GFAP -Luc +/-) ratinhos com ratinhos hemizigótica Tg (M83 +/-) para gerar hemizigótica bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos 15, 16. </li><li> Genótipo a descendência com PCR em tempo real para a presença do transgene que codifica alfa-sinucleína humana e com a PCR padrão para a luciferase de pirilampo 12, 17. </li><li> Inocular os animais em uma idade de seis a oito semanas. </li></ol> 2. Preparação do inóculo <ol><li> Prepare monomeric alfa-sinucleína recombinante humana com a mutação A53T em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 150 mM de NaCl em Tris-HCl 20 (pH 7,2) como foi anteriormente descrito 14. </li><li> Prepare fibrilar alfa-sinucleína para inoculações, por agitação de 3? G /? L de alfa-sinucleína monomérica humana recombinante num agitador orbital a 800 rpm e 37 ° C durante 5 dias. </li><li> Dilui-se conjuntos de fibrilas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para atingir uma concentração final de 1 ug / mL para intraperitoneal ou 2 ug / mL para inoculações intraglossal. </li><li> Fragmentar as fibrilas-sinucleína alfa com um sonicador de haste durante 1 min (40 impulsos de duração de 0,5 s com uma pausa de um segundo entre cada pulso e uma amplitude definida como 50%) em gelo. Para evitar a contaminação por cross-sementeira. Utilizar sondas de sonicação limpas para preparar inoculo diferente. </li></ol> 3. Injeções Intraglossal <ol><li> Anestesiar os animais com uma intraperitoneal injecção de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina. Beliscar dedo do pé do animal e confirmar que ele não retirar a pata traseira para garantir anestesia adequada. Use vet pomada sobre os olhos do animal para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Fix animais narcotizados cuidadosamente com fita adesiva sobre uma placa de aquecimento numa posição de decúbito dorsal com as cabeças viradas para o investigador. </li><li> Encher uma seringa hipodérmica descartável 27 G com 5 mL de fibrilas-sinucleína alfa sonicadas ou PBS. </li><li> Use uma pinça polegar sem corte de nariz com pontas serrilhadas para manter a boca do animal aberta, e um par segunda menor de pinça para retirar cuidadosamente a língua para fazer a parte de baixo da língua acessível para injeção. </li><li> Injectar a agulha da seringa no lado inferior direito ou esquerdo da língua em proximidade com o nervo hipoglosso. Lentamente injectar o inoculo após 5 s. Lentamente retrair a agulha depois de 5 segundos para assegurar que o inoculotenha penetrado no tecido e não é perdida durante a retracção da agulha. </li><li> Solte o animal de suas fixações e deixá-lo na placa de aquecimento sob monitoramento constante até a recuperação completa. </li></ol> 4. injeção intraperitoneal <ol><li> Para injecções intraperitoneais, narcotizar os animais em breve numa câmara de anestesia por inalao com isoflurano / oxigénio utilizando um caudal de 2 L / min e o vaporizador ajustado para 2%. Beliscar dedo do pé do animal e confirmar que ele não retirar a pata traseira para garantir anestesia adequada. </li><li> Encher uma seringa hipodérmica descartável 27 G com 50 uL de fibrilas-sinucleína alfa sonicadas ou PBS. </li><li> Injectar directamente no peritoneu do rato e evitar a penetração do intestino delgado ou ceco localizado por trás da parede abdominal, mantendo o animal numa posição dorsal, com a cabeça virada para longe do investigador e para baixo a cerca de 45 °. Monitorar os animais até que tenham recuperadoda anestesia. </li></ol> 5. A bioluminescência imagem <ol><li> Imagem Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos cada 2-4 semanas, utilizando um sistema de imagem de bioluminescência. </li><li> Antes da imagiologia, pouco anestesiar os ratos numa câmara de isoflurano / oxigénio com uma taxa de fluxo de 2 L / min e o vaporizador ajustado para 2%. Beliscar dedo do pé do animal e confirmar que ele não retirar a pata traseira para garantir anestesia adequada. </li><li> Raspar e depilar as cabeças dos ratinhos com um creme depilatório. Colorir as orelhas em preto com um marcador não irritante para bloquear a bioluminescência inespecífica. </li><li> Dilui-se o sal de potássio de D-luciferina, o substrato da luciferase, em PBS a uma solução estoque de 30 mg / mL. Conserva-se a em aliquotas de 1 ml a -20 ° C. Proteger o D-luciferina dissolvido da exposição à luz. </li><li> Pesar os animais antes da injecção. Calcular o volume exacto de D-luciferina para injecção de 150 mg / kg de peso corporal. Intraperitonealmente injectar D-luciferin e retornar o animal à câmara de anestesia. </li><li> Inicie o software de imagem. Depois que o sistema de imagem atingiu sua temperatura de funcionamento inicializar o sistema, clicando no botão &#39;Inicializar&#39; no painel de controle. </li><li> Selecione os botões &#39;luminescentes&#39; e &#39;Photograph&#39;. Defina o tempo de exposição a 60 s, o binning de &#39;Medium&#39;, o F / Stop para &#39;1&#39;, e o ganho EM para &#39;Off&#39;. </li><li> Confirme se o filtro de excitação é definido como &#39;bloco&#39; eo filtro de emissão para &#39;Open&#39; e definir a altura sujeita a 1,50 cm. </li><li> Dez minutos após a injecção com D-luciferina, colocar os animais sobre a placa de aquecimento na câmara de imagiologia e assegurar que os focinhos estão correctamente colocados na saída de anestesia. Fechar o fluxo de isoflurano / oxigénio a partir da câmara de inalação e abrir o fluxo para a câmara de imagem com um caudal de 0,25 L / min e uma evaporação de 2%. Feche a porta do pr câmara de imagemoperly. </li><li> Clique no botão &#39;Adquirir&#39; para medir a bioluminescência, que leva 60 s. Parar o fluxo de isoflurano e monitorar os animais até que tenham recuperado completamente depois devolvê-los de volta às suas gaiolas. </li><li> Use o software de imagem para quantificar a bioluminescência. Dentro do &#39;Tool Palette&#39; selecionar &#39;Ferramentas de ROI&#39;. Em &#39;Tipo&#39; dentro &#39;Ferramentas de ROI&#39; selecionar &#39;Medição ROI&#39;. </li><li> Dentro das ferramentas de ROI &#39;clique na ferramenta &quot;círculo&quot; e selecione o número de ROIs para desenhar a partir do menu suspenso - idealmente &#39;3&#39; por três ratos. </li><li> Na imagem, clique com o botão direito em cada ROI e sob &#39;Propriedades&#39; ajustar a largura e altura para 1,25 cm. Posicionar cada ROI sobre a área do cérebro que é quantificado. </li><li> No canto superior esquerdo da imagem, definir o painel de unidades de &#39;radiância (fotões)&#39;. </li><li> Dentro do &#39;Tool Palette&#39;, selecione &#39;Ajuste de Imagem&#39; e ajustar o mínimo ea máxima do &#39;escala de cores&#39;, por exemplo, a partir 0.20e6 para 1.00E6. </li><li> Em &#39;File&#39; salvar os dados com &#39;Save&#39;. </li></ol> 6. A análise bioquímica <ol><li> Isolar os cérebros e medulas espinhais de acordo com protocolos estabelecidos 18, 19. </li><li> Homogeneizar o cérebro inteiro e amostras da medula espinal inteiros separadamente em PBS na presença de inibidores de protease e fosfatase (diluídos até 1x em PBS) em dois ciclos de 30 s com a 6000 rpm num homogeneizador de tecidos. Assegure-se que o cérebro e na medula espinhal amostras são homogeneizados a uma concentração final de 20% (peso / vol). </li><li> Sonicar as amostras duas vezes, mantendo-os em gelo com um impulso constante de 10 s e uma amplitude definida como 50%. </li><li> Ajustar os homogenatos a 10% em PBS e NaCl 750 mM, por diluição com 1: 1 com NaCl 1,5 M em PBS. </li><li> Para separar os detritos celulares, centrifugar os homogenatos a 1000 xg durante 5 min a4 ° C. Mantenha os sobrenadantes para os próximos passos e descartar os pellets. </li><li> Medir a concentração da proteína nos homogeneizados usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante. Incubar 1,0 mg de proteína total a partir de homogenatos de cérebro ou de 0,8 mg a partir de homogenatos de medula espinhal de N-laurylsarcosyl a uma concentração final de 10% (p / vol) durante 15 min em gelo. </li><li> Sobrepor os homogeneizados numa almofada de sacarose a 3 mL de 10% (p / vol) em água destilada e ultracentrífuga-los em 465.000 xg durante 1 h a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as pastilhas numa solução tampão contendo 4% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 2% β-mercaptoetanol, glicina 192 mM, Tris 25 mM, e 5% (p / v) de sacarose. </li><li> Ferver as amostras a 100 ° C durante 5 min e carregá-los no géis de SDS-poliacrilamida para electroforese em um sistema tampão de ácido morpholineethanesulfonic (MES). </li><li> Transferir as proteínas separadas para difluoreto de polivinilideno (PVDF) em membranas de uma SEMiDry sistema de mata-borrão. </li><li> Incubar as membranas em 0,4% (vol / vol) de solução de formalina em PBS durante 30 min à temperatura ambiente em um rotor com 35 rpm para reticular as proteínas com a membrana. </li><li> Bloquear as membranas em tampão TBS contendo 0,05% (vol / vol) de Tween 20 e 5% (p / v) de leite durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as manchas com o anticorpo primário em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as membranas três vezes em tampão de TBS e incube-as com anticorpos secundários peroxidase ou fluoróforos em TBS durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Visualizar os anticorpos secundários ligados por quimioluminesccia ou fluorescência de acordo com protocolos estabelecidos 20. </li></ol> Análise 7. Imunofluorescência <ol><li> Desidratar os cérebros dissecados e medulas espinhais de uma estação de processamento de tecidos e incorporá-los em parafina usando um banho de parafina. </li><li> Cortar o tis embebidos em parafinasues com um micrótomo em 8 mm cortes coronais de espessura e montar as secções sobre lâminas de vidro. </li><li> Desparafinar as secções de tecido, incubando-as em dois banhos separados xilol durante 5 a 10 minutos e re-hidratar-los através de uma série de banhos de etanol graduadas (100%, 90%, 70%, 50%) e finalmente com H 2 O. </li><li> Incubar as secções em 0,01 M de tampão de citrato (pH 6,0) durante 5 min à temperatura ambiente e, adicionalmente, ferve-las durante 10 min num forno de microondas. </li><li> Deixe as secções de arrefecer até à temperatura ambiente e incube-as com uma solução de peróxido de hidrogénio a 3% durante 30 minutos para inibir as peroxidases endógenas. </li><li> Bloquear as secções de tecido, por incubação com 20% (vol / vol) de soro de cabra normal a 1% (vol / vol) de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as secções com o anticorpo primário diluído em 1% (vol / vol) de soro de cabra normal a 1% (vol / vol) de BSA, e 0,25% de Triton X-100 em PBS durante a noite a 4 ° C. </li> &lt;li&gt; Lavar as secções duas vezes com 0,25% (vol / vol) Triton X-100 em PBS e uma vez com PBS. </li><li> Corar as secções com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo correspondentes e o corante nuclear DAPI diluída em 1% (vol / vol) de soro de cabra normal a 1% (vol / vol) de BSA e PBS durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Depois de lavar duas vezes com 0,25% (vol / vol) Triton X-100 em PBS e uma vez com PBS, as lâminas com lamela meios de embebimento e visualizar a coloração com um microscópio confocal de varrimento laser. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Injecção periférica de fibrilas-sinucleína alfa no peritoneu de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos representa um método fácil para induzir a doença neurológica acompanhada por neuroinflamao recapitular características importantes de sinucleinopatias. Da mesma forma, a injecção língua representa uma outra via para neuroinvasão por prionoids alfa-sinucleína em ratinhos transgénicos, mas é menos eficiente. Escolhemos para terminar nossas experiências em 420 dias após a injecção e não podemo...

Existe evidência crescente de que o alfa-sinucleína tem características que são semelhantes às da proteína prião, em particular na sua capacidade de se auto-propagam semente e enrolamento incorrecto entre as células e ao longo de caminhos neuronais. Esta propriedade de alfa-sinucleína é também referido como &#39;prião de tipo&#39; ou &#39;prionoid&#39;, e é suportada por observações em experiências de transplantação, o que sugere a transmissibilidade do enrolamento incorrecto alfa-sinucleína a partir de neurónios doentes para recém-transplantados neurónios saudáveis 1, 2 , 3, 4. Também injecção directa de enrolamento incorrecto alfa-sinucleína no cérebro ou da periferia, por exemplo, o músculo do membro posterior ou parede intestinal, resulta numa disseminação da patologia alfa-sinucleína a partes distais do SNC 5, 6, 7, &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Analisou-se a transmissão de prionoids alfa-sinucleína por vias periféricas em mais detalhe e dirigiu-se à questão de saber se misfolded alfa-sinucleína pode neuroinvade do SNC após uma única injecção intraperitoneal ou intraglossal, uma característica que tinha sido previamente demonstrado para priões, mas não para alfa- misfolded sinucleína. Após a injecção de priões para a língua, neuroinvasão do SNC é alcançada através de propagação ao longo do nervo hipoglosso da lingueta que conduz para o núcleo do nervo hipoglosso, que está localizado no tronco cerebral 11. Como um modelo de ratinho que escolheu Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos que sobre-expressam o mutante A53T de alfa-sinucleína humano a partir do promotor do prião, e luciferase de pirilampo sob o controlo de um promotor GFAP para monitorizar a activação de astrócitos pela bioluminescência, como mostrado anteriormente no cérebro deprião-infectados ratinhos 12. Em nossas mãos bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos não desenvolveram a doença até 23 meses de idade, como tem sido demonstrado por outros 13. Uma única injecção de fibrilas-sinucleína alfa humanos através da rota ou intraglossal induzida doença neurológica intraperitoneal com patologia nos cérebros e medulas espinhais de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos que suportam a hipótese de que prionoids alfa-sinucleína compartilham características importantes com priões 14.

<table><tbody><tr><td>anticorpo anti-actina</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>anti-alfa-sinucleína, anticorpo fosfo-S129 [pSyn#64]</td><td>Wako</td><td>015-25191</td><td></td></tr><tr><td>anti-alfa-sinucleína, anticorpo fosfo-S129 [EP1536Y]</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334 01</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-IBA-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Sequestossomo-1 (p62) Anticorpo</td> anti-ubiquitina <td>Proteintech</td><td>18420-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>[Ubi-1]</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1510</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina&nbsp;</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Seringa Ratiopharm</td><td></td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>27 G</td><td>VWR</td><td>613-4900</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td>PZN&nbsp; 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Creme Depilatório</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secureline marcador de laboratório</td><td>Neolab</td><td>25040</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina sal de potássio</td><td>Acris</td><td>LK10000</td><td>30 mg/mL solução estoque</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5776671</td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls Mini20 sonicator</td><td>Bandelin</td><td>3648</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem IVIS Lumina II</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.0 Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camundongos Tg(M83+/-) ou B6; Camundongos C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>004479</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de padrão padrão</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de padrão estreito</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>N-laurylasarcosyl</td><td>Sigma</td><td>L5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP ultracentrífuga&nbsp;</td><td>Rotor Beckman Coulter</td><td></td><td>TLA-110</td></tr><tr><td>Tubos de policarbonato de parede espessa</td><td>Beckman Coulter</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>WG1401BOX</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo conjugado HRP Cayman</td><td>Cay10004301-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR Dye 680 anticorpo&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Substrato de Duração Estendida</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Stella 3200 sistema de imagem</td><td>Raytest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey sistema de imagem infravermelha&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SA/T8787</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Membrana PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>Roth</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma</td><td>SA/00216763/000500</td><td>solução de trabalho 3%</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3294-100G</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>diluição de trabalho 1:50,000</td></tr><tr><td>Mídia de montagem fluorada&nbsp;</td><td>Microscópio</td> confocal de varredura a laser <td>Omnilab SA/F4680/000025</td><td></td></tr><tr><td>LSM700</td> Inibidores de protease e fosfatase <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HALT</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10516495</tr><tr><td>Precellys 24-Dual homogeneizador&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS24D</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31619</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticorpo conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; BCA&nbsp; Proteína&nbsp; Ensaio&nbsp; Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de bioluminescência de neuroinflammation em ratinhos transgénicos após inoculação periférica de alfa-sinucleína fibrilas

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Para estudar o comportamento de prião de tipo de enrolamento incorrecto alfa-sinucleína, são necessários modelos de murganho que permite a transmissão rápida e simples de prionoids alfa-sinucleína, que causam neuropatologia no interior do sistema nervoso central (SNC). Aqui descrevemos que intraglossal ou injecção intraperitoneal de fibrilas-sinucleína em alfa bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos, que sobre-expressam alfa-sinucleína humana com a mutação A53T a partir do promotor da proteína prião e a luciferase do pirilampo de o promotor para a proteína ácida fibrilar glial (GFAP), é suficiente para induzir doença neuropatológica. Em comparação com Tg homozigótica (M83 + / +) ratinhos que desenvolvem sintomas neurológicos graves começam com uma idade de 8 meses, heterozigótica Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) animais permanecem livres da doença espontânea até atingirem um idade de 22 meses. Interessantemente, a injeco de fibrilas-sinucleína alfa através da intraperitoneal rota induzida doença neurológica com paralisia em quatro de cinco Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos com um tempo de incubação médio de 229 ± 17 dias. animais doentes mostrou depósitos graves de fosforilada alfa-sinucleína em seus cérebros e medulas espinhais. Acumulações de alfa-sinucleína foram sarcosil-insolúvel e co-localizada com ubiquitina e p62, e foram acompanhados por uma resposta inflamatória que resulta em gliose de astrócitos e microgliose. Surpreendentemente, a inoculação de fibrilas-sinucleína alfa para a língua era menos eficaz em causar doença com apenas um dos cinco animais injectados mostrando alfa-sinucleína patologia após 285 dias. Nossos resultados mostram que a inoculação por via intraglossal e mais ainda através da via intraperitoneal é adequado para induzir doença neurológica com características relevantes da sinucleinopatias em Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) camundongos. Isto fornece um novo modelo para estudar prion-como patogênese induzird por prionoids alfa-sinucleína em maior detalhe.

Injecção periférica de prionoids alfa-sinucleína através da língua ou no peritoneu induzida neuropatologia no CNS de Tg bigenic (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos (Tabela 1 e Figura 1). Após uma única injecção intraperitoneal com fibrilas-sinucleína alfa, quatro de cinco ratinhos desenvolveram uma doença neurológica com um tempo de incubação médio de 229 ± 17 dias. Surpreendentemente, apenas um de cinco ratinhos desenvolver...

Injecção periférica de fibrilas-sinucleína alfa no peritoneu ou língua de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos, que expressam alfa-sinucleína humana com a mutação A53T familiar e a luciferase do pirilampo, pode induzir a neuropatologia, incluindo neuroinflamao , em seu sistema nervoso central.

Imagem de bioluminescência de Neuroinflammation em Ratinhos Transgénicos Após inoculação periférica de alfa-sinucleína fibrilas

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

O objetivo geral deste método de imagem de bioluminescência é quantificar a neuroinflamação no sistema nervoso central de um modelo murino de doença de Parkinson após injeção periférica de fibrilas de alfa-sinucleína. Este método pode ajudar a determinar quando e em que grau a neuroinflamação ocorre em modelos murinos de doenças neurodegenerativas. A principal vantagem desta técnica é que a neuroinflamação pode ser monitorada de forma não invasiva e repetida até que os camundongos desenvolvam doenças neurológicas.A implicação desta técnica é o diagnóstico na décima hora de doenças neurológicas, pois o aumento da bioluminescência devido à inflamação nervosa não apenas acompanha, mas muitas vezes precede a doença neurológica. Comece anestesiando adequadamente o animal para a cirurgia. Aplique um aperto no dedo do pé e confirme que o animal não retira o membro para indicar um plano cirúrgico de anestesia.Aplicar pomada oftálmica para prevenir ressecamento durante a anestesia. Usar fita adesiva para fixar cuidadosamente o animal sobre uma placa aquecida em posição decúbito dorsal, com a cabeça voltada para o pesquisador. Em seguida, encher uma seringa descartável hipodérmica de 27 gauge com cinco microlitros de fibrilas de alfa-sinucleína sonicadas.Em seguida, use um par de pinças rombas para segurar a boca do animal aberta e utilize o par menor de pinças para cuidadosamente puxar a língua, tornando acessível a sua face inferior para a injeção. Insira a agulha da seringa no lado inferior direito ou esquerdo da língua, próximo ao nervo hipoglosso. Após cinco segundos, injete lentamente o inóculo.Deixe a agulha em posição por mais cinco segundos para garantir que o inóculo penetre no tecido e, em seguida, retire cuidadosamente a agulha. Após a injeção, solte o animal e deixe-o sobre a placa aquecida sob monitoramento constante até a recuperação completa. Para injeções intraperitoneais, narcotize brevemente os animais em uma câmara de anestesia com isoflurano.Novamente, pinçe o dedo do animal e confirme que ele não retira a pata traseira para garantir uma anestesia adequada. Encha uma seringa hipodérmica descartável de 27 gauge com 50 microlitros de fibrilas de alfa-sinucleína sonicadas ou PBS. Segure o animal em posição dorsal com a cabeça voltada para longe do pesquisador e inclinada para baixo em aproximadamente 45 graus.Injete diretamente no peritônio do camundongo sem penetrar o intestino delgado ou o ceco localizados atrás da parede abdominal. Monitore os animais até que se recuperem da anestesia. Antes da aquisição de imagens, raspe e depile as cabeças dos camundongos anestesiados com isoflurano.Colorir as orelhas em preto com uma caneta não irritante para bloquear a bioluminescência inespecífica. Pesar os animais antes da injeção. Em seguida, calcular o volume exato de D-Luciferina para injeção na dose de 150 miligramas por quilograma de peso corporal.Injecte intraperitonealmente o volume calculado de D-Luciferina e, em seguida, devolva cada animal à câmara de anestesia. Inicie o software de imagem. Após o sistema de imagem atingir sua temperatura de operação, inicialize o sistema clicando no botão Inicializar no painel de controle.Em seguida, selecione os botões Luminescente e Fotografar. Ajuste o tempo de exposição para 60 segundos, o Binning para médio, o F/Stop para um e o ganho EM para desligado. Selecione Bloquear e depois Abrir.Em seguida, na aba altura do sujeito, selecione 1,50 no menu suspenso. Dez minutos após a injeção com D-Luciferina, posicione os animais sobre a placa aquecida na câmara de imagem e certifique-se de que seus músculos estejam corretamente posicionados na saída de anestesia. Alterne o fluxo de isofluorano da câmara de inalação para a câmara de imagem e feche adequadamente a porta da câmara de imagem.Clique no botão de aquisição para medir a bioluminescência, o que leva 60 segundos. Interrompa o fluxo de isofluorano e, em seguida, devolva os animais às suas gaiolas. Utilize o software de imagem para quantificar a bioluminescência, abrindo o menu da paleta de ferramentas e selecionando Ferramentas de ROI.Em tipo, selecione ROI de medição. Dentro das ferramentas de ROI, clique na ferramenta de círculo e selecione o número de ROI a desenhar no menu suspenso. Idealmente, três para três camundongos.Na imagem, clique com o botão direito em cada ROI e, em propriedades, ajuste a largura e a altura para 1,25 centímetros. Posicione cada ROI sobre a área cerebral que será quantificada. No canto superior esquerdo da imagem, configure o painel de unidades para radiância em fótons.Em seguida, abra o menu da paleta de ferramentas. Selecione ajuste de imagem e ajuste o mínimo e o máximo da escala de cores. Por exemplo, de 200.000 a um milhão.Por fim, no menu arquivo, clique em salvar para salvar os dados. Como mostrado aqui, após injeção intraperitoneal com fibrilas de alfa-sinucleína, quatro dos cinco camundongos transgênicos A53T sinucleína GFAP luciferase reporter desenvolveram doença neurológica dentro de 229 dias, conforme indicado pelos quadrados roxos. No entanto, apenas um dos cinco camundongos injetados por via interglossal desenvolveu doença neurológica dentro de 285 dias, conforme indicado pelos círculos verdes.A imagem de bioluminescência revelou que os camundongos transgênicos emitiam bioluminescência elevada em seus cérebros e medulas espinhais, logo antes de desenvolverem sinais de doença neurológica. Essa bioluminescência foi mais acentuada após injeção intraperitoneal e ausente após injeção de PBS, sugerindo ausência de gliose astrocítica. Esta figura mostra a bioluminescência nos cérebros de camundongos transgênicos ao longo do tempo após injeção intraperitoneal de fibrilas de alfa-sinucleína.Conforme mostrado pelos círculos azul, verde, marrom e laranja. Níveis aumentados de bioluminescência acima de um limiar de 2 milhões de fótons por segundo por centímetro quadrado por esterorradiano foram observados algumas semanas antes de esses quatro camundongos individuais desenvolverem sinais neurológicos da doença. Um dos cinco animais também apresentou níveis elevados de bioluminescência pouco antes de morrer, 285 dias após a injeção intraglossal com fibrilas de alfa-sinucleína.Em contraste, para camundongos controle saudáveis injetados com PBS e para um animal que não desenvolveu doença após injeção intraperitoneal, com fibrilas de alfa-sinucleína indicadas pelos círculos vermelhos, o sinal de bioluminescência permaneceu abaixo do limiar durante o período de observação. A coloração por imunofluorescência de cortes cerebrais de animais doentes com anticorpos contra GFAP e Iba1 confirmou neuroinflamação com microgliose e astrócitos reativos em regiões com depósitos de alfa-sinucleína. Animais saudáveis que não acumularam depósitos de alfa-sinucleína apresentaram pouca coloração para GFAP e Iba1.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de uma hora, se realizada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurodegeneração explorarem de forma não invasiva a neuroinflamação no sistema nervoso central de camundongos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como injetar perifericamente camundongos com fibrilas de alfa-sinucleína e como realizar a imagem de bioluminescência para monitorar a neuroinflamação no SNC.O objetivo geral do procedimento é induzir perifericamente uma doença neurológica por meio de injeção intraglosal ou intraperitoneal com fibrilas de alfa-sinucleína e realizar imagens não invasivas da indução da neuroinflamação ao longo do tempo.

bioluminescence-imaging-neuroinflammation-transgenic-mice-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Imagem de bioluminescência de Neuroinflammation em Ratinhos Transgénicos Após inoculação periférica de alfa-sinucleína fibrilas

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