Name: A indução de transições mesenquimais-epiteliais em células de sarcoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a induzir transições mesenquimais-epiteliais em células de sarcoma usando microRNA-200 e GRHL2. Este método reprodutível permite estudar redes reguladoras de genes e plasticidade fenotípica para desenvolver estratégias terapêuticas.

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JAS reconhece o apoio do Instituto Duke Cancer, The Duke University Genitourinary Oncologia Laboratory, e do Departamento de Ortopedia da Universidade de Duke. HL foi apoiado pela National Science Foundation (NSF) Centro de Física Biológica Teórica (NSF PHY-1427654) e NSF DMS-1361411, e como CPRIT (Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas) Scholar na Cancer Research do Estado do Texas na Universidade Rice. KEW foi apoiado pelo NIH F32 CA192630 MKJ e HL beneficiado a partir de discussões úteis com Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta, e Donald S. Coffey.

1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Prepare DMEM para cultura de células por adição de 50 ml de soro fetal de bovino (FBS) e 5 mL de penicilina-estreptomicina (5000 U / mL) a 500 mL de meio DMEM. Este meio pode ser armazenado a 4 ° C durante até seis meses. </li><li> Ressuspender iniciadores liofilizados em água isenta de nuclease, a uma concentração final de 10 uM. iniciadores loja re-suspenso a -20 ° C. </li><li> Prepare ensaio de radioimunoprecipitação tampão (RIPA) (NaCl 150 mM, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, Tris a 50 mM, pH 8,0). Suplemento com o cocktail inibidor de protease antes da utilização e manter tampão em gelo quando em utilização. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare a 10 mg / mL de polibreno (brometo de hexadimetrina) no filtro de água e de uma seringa para esterilizar utilizando um filtro de 0,45? M de polietersulfona. Solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até seis meses. </li><li> Prepara-se uma solução de 1 mg / mL de trabalho de cloreto de tetrazólio azul nitro por dissolução de 10 mg em 10 mL de PBS. Armazenar a 4 ° C.</li></ol> 2. Transdução Lentivirus de GRHL2 Dia 1 <ol><li> A placa 3 x 10 5 culas HEK293T por poço de uma placa de 6 cavidades em 2 ml de DMEM suplementado. Quantificar culas utilizando um contador de células automatizado. As células devem ser 40 - 60% confluentes, após cultura durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol> Dia 2 <ol start="2"><li> Dilui-se 2 ug de vector vazio (pCMV-EGFP-UBC) ou 2? G de pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 em 200 uL de meio sem soro, juntamente com 1,8 ug de pΔ8.9 e 0,2 ug de pCMV-VSV plasmídeos auxiliares -G. Num tubo separado, dilui-se 4 ul de um reagente de transfecção à base de lípidos em 200 uL de meio isento de soro por transfecção (8 uL em 400 uL de duas amostras). Adicionar 200? L de mistura de reagente de transfecção para cada solução de plasmídeo e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Durante o incubação, lavar as células HEK293T por remoção do meio por aspiração e lavagem as células com 1 ml de PBS. Substituir o PBS com 800 uL de meio isento de soro. Após 20 min, adiciona-se 200 uL de reagente de transfecção: mistura de plasmídeo a partir do passo 2.2 gota a gota, a cada poço e incubar as células durante 2 h a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Cuidadosamente remover meio de transfecção por aspiração e substituir com 2 ml de DMEM suplementado. As células voltem para a incubadora para a cultura durante a noite. NOTA: As células HEK293T são vagamente aderente. Meios de substituição deve ser realizado com cuidado para limitar a remoção das células a partir do fundo do prato ou frasco. </li></ol> Dia 3 <ol start="5"><li> Actualizar meios em células HEK293T transfectadas e a placa 3 x 10 5 culas RD por poço de uma placa de 6 cavidades em 2 ml de DMEM suplementado. Células de cultura durante a noite. culas RD são uma linha de células de rabdomiossarcoma humano comercialmente disponível. </li></ol> dia 4 </p&gt; <ol start="6"><li> Recolhe meios viral a partir de células HEK293T. Pipetar o meio DMEM a partir das células HEK293T e em lugar de um novo 15 mL cónico. Cuidadosamente substituir com novos media DMEM e células lugar HEK293T de volta na incubadora para o dia seguinte. </li><li> Adicionar 2 mL de 10 mg / ml de polibreno por mL de meio virais em dois novos tubos de 50 mL cónicos (uma para a transfecção o vector vazio e outro para a transfecção GRHL2). filtro de seringa de meios viral, removendo o êmbolo de uma seringa de 3 mL e anexar um filtro de 0,45? m de polietersulfona para a ponta. <ol><li> Adicionar os meios virais recolhidas no passo 2.6 para dentro do tambor da seringa, e mergulhar meios para os novos tubos de 50 mL cónicos contendo polibrene. Remover o meio a partir de culas RD por aspiração a vácuo e adicionar meios viral filtrada para células RD. </li></ol></li></ol> dia 5 <ol start="8"><li> Dia 4. células HEK293T de repetição podem ser descartados após a mídia viral foi recolhido. </li></ol> dia 7 </strong&gt; <ol start="9"><li> Lavar as células RD com 1 mL de PBS e adicionar 200 ul de tripsina a 0,05% por poço. Incubar a 37 ° C durante 5 min, adicionar 2 ml de meio suplementado, e mover-se suspensão de células para um novo 15 mL cónico. células centrifugar a 250 xg durante 5 min à temperatura ambiente e meios aspirado. Ressuspender em 1 mL de meio DMEM (suplementado com 5% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina). NOTA: Usando uma percentagem mais elevada de SBF podem provocar entupimento, durante o fluxo de citometria <ol><li> células de filtro para citometria de fluxo. Usar uma pipeta para aplicar a suspensão de células 1 mL DR através de um filtro de 30 um em tubos de citometria de fluxo e os tubos de colocar em gelo. </li><li> Ordenação de eGFP + 26 em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 0,5 mL de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina e colocar em gelo. Placa eGFP + no total de 1 mL de DMEM suplementado classificados em um único poço de uma placa de 12 poços e lugar na incubadora para cultura. ; NOTA: O rendimento de células a partir de EGFP + citometria de fluxo após esta transdução é geralmente baixa (50.000-100.000 células). As células podem precisar de ser cultivadas durante 10 - 14 dias antes de prosseguir para o passo 3. </li></ol></li></ol> 3. Transfecção reversa de miR-200s <ol><li> Preparar 50 uM stocks de miR-200 imita usando livre de nuclease H 2 O. estoques alíquotas e armazenar a -20 ° C para evitar ciclos de congelamento / descongelamento. </li><li> Adiciona-se 3 mL de cada um de 50? M de miR-200 mímico (miR-200a, miR-200b, e miR-200 c) a 300 uL de meio isento de soro ou 9 mL de 50 um miARN controlo negativo para meio isento de soro de 300 uL. </li><li> Adicionar 6 mL de reagente de transfecção específico siRNA para 600 uL de meio isento de soro e 300 pL de dividir esta mistura em dois tubos, um para cada uma das duas misturas de miR passo 3.2. Combinam-se as 300 uL de cada mistura de miR do passo 3.2 com uma mistura de 300 uL de reagente de transfeco. Incubar durante 20 min a te quartomperatura. </li><li> Durante a incubação, preparar uma suspensão de células de 600.000 células EGFP + RD expressam EV ou GRHL2 criado na secção 2 em 2,4 mL (250 células / ml) de meio isento de soro por tratamento. </li><li> Numa placa de 24 poços, adicionar 100 ul por poço de miR-200 mistura ou mistura de controlo negativo a partir do passo 3.3 em seis poços, e, em seguida, adicionar 400 uL de cada suspensão de células em três poços de cada mistura de miR. </li><li> Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO 2 durante a noite e meios de comunicação para alterar totalmente suplementado DMEM no dia seguinte. Recolher as células 2 dias mais tarde para análise utilizando o tampão adequado (ver abaixo). imagiologia de lapso de tempo de células de sarcoma RD submetidos a MET é disponível como material suplementar. Imagem cada poço a cada 2 h com uma objetiva de 10X usando um gerador de imagens ao vivo de células automatizado 27. </li></ol> 4. extracção de ARN, transcrição reversa, e qPCR <ol><li> Extrair ARN de acordo com as instruções do fabricante, usando um padrão de RNAkit de extracção 24. ARN extraído pode ser armazenado a -80 ° C. </li><li> Quantificar a concentração de ARN. Descongelar e trabalhar com ARN em gelo. Para quantificar as concentrações de ARN, medir a absorvância de UV a 260 nm com um espectrofotetro leitor de placas de acordo com o protocolo do fabricante. Dilui-se todas as amostras para a concentração mais baixa com água isenta de nuclease. </li><li> Realizar a transcrição inversa de ARN total em ADN complementar (ADNc). Combinar não menos do que 100 ng de ARN total com tampão de PCR, de mistura de dNTP (100 mM), os iniciadores de hexâmeros aleatórios, transcriptase e água isenta de nuclease reversa num volume de reacção de 20 uL 24. Executar ciclos de RT de acordo com o protocolo do fabricante. ADNc pode ser armazenada a longo prazo a -20 ° C. </li><li> Diluir 20 uL a reacções de 100 uL com 80 uL de livre de nuclease H 2 O. </li><li> Dissolvem-se 5 mL de uma baseada em fluorescência corante intercalante 2x qPCR master mix, 0,06 L de cada iniciador a 10? M, umND 2? L de reaco de RT por amostra diluída. </li><li> Run qPCR de acordo com o protocolo do fabricante para a mistura principal à base de fluorescência. </li><li> Quantificar as quantidades relativas de ARNm pelo método CT delta e normalizar a GAPDH. Traça-se a expressão do mRNA média das réplicas biológicas ± desvio padrão para cada grupo de tratamento. NOTA: precauções especiais devem ser tomadas quando se trabalha com ARN a fim de evitar contacto com RNases, tais como a utilização de plásticos e reagentes isentos de RNase. equipamento não descartável deve ser tratada antes do uso para remover RNases. </li></ol> 5. Imunofluorescência Coloração <ol><li> Seguindo o passo 3.6, meios aspirado por aspiração a partir de células RD em formato de 24 poços. </li><li> Fixar as células por adição de 500 uL de paraformaldeído a 4% (PFA) por poço e incubar durante 15 min à temperatura ambiente (RT). Após a fixação, as células lugar em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e armazenar a 4 ° C durante a noite se necessário. </li><li> permeabilizaras células por adição de 500 ul de PBS + 0,2% de Triton-X100 e incubar 30 min a RT. Por aspiração de vácuo, remover o tampão de permeabilização e lavar três vezes com PBS. </li><li> Bloco em 500 mL de 5% de albumina de soro bovino (BSA) / PBS e incubar as células durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células podem ser armazenadas a 4 ° C durante a noite se necessário. </li><li> Prepare uma diluição de anticorpo primário. Pipetar 200 L de 5% de BSA / PBS por poço num cónico de 15 mL (12 poços = 2,4 mL) e adicionar 1 mL de anticorpo primário por mL de BSA a 5% / PBS necessário. Remover o tampão de bloqueio por aspiração a vácuo e dispensar 200 uL de anticorpo primário diluído a cada poço. <ol><li> Incubar as células em 1: 1.000 de anticorpos diluídos primários em BSA a 5% / PBS durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Após a incubação, lavar as células duas vezes com PBS. </li></ol></li><li> Preparar uma diluição de anticorpo secundário no mesmo volume de BSA a 5% / PBS como acima. Adicionar o anticorpo secundário conjugado com corante vermelho-extremo usando uma diluição de 1: 2000. Além disso adicionar1 ug / mL de corante Hoechst à mistura. Remover o PBS e adicionar 200 mL da mistura para cada poço. <ol><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1 h no escuro. Lavar 3 vezes com PBS, deixa as células em PBS, e proteger as células da luz utilizando folha metálica. As células podem ser armazenadas a 4 ° C, se necessário. </li></ol></li><li> células de imagem em ampliação total 400X num microscópio de epifluorescência invertido com excitao de comprimento de onda 594-650 nm. </li></ol> 6. Western Blotting <ol><li> Lavar as células duas vezes com 3,6 de PBS gelado. Em gelo, as células lisam com 50 ul de 1x tampão RIPA suplementado com um cocktail inibidor de protease 1x. </li><li> Os lisados ​​de rocha, a 4 ° C durante 15 minutos, recolher os lisados ​​para tubos de 1,5 ml e centrifugar a alta velocidade (20000 xg) durante 5 min para clarificar as amostras. Os lisados ​​celulares podem ser armazenadas a longo prazo a -80 ° C, se necessário. </li><li> Quantificar a proteína total utilizando um ensaio de Bradford e aliquotar uma quantidade igual de proteína em novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL. BrinAs amostras de g para volume igual usando tampão RIPA e tampão de carga Laemmli 3x suplementado com 2-mercaptoetanol. </li><li> Incubar as amostras em tamp de carga de Laemmli 1x amostra durante 5 minutos a 95 ° C e executado de SDS-PAGE utilizando um gel de Tris-glicina 4-12% a 200 V durante 45 min. A quantidade de faixas carregadas de proteína, dependendo da linha celular. Em alguns casos, 50-100 ug de proteína total é necessária para a detecção de E-caderina em linhas celulares mesenquimais. </li><li> Transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose durante 2 horas a 50 V em tampão de transferência 1x Tris-glicina. </li><li> membrana bloco durante 1 h a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C em um tampão de bloqueio à base de BSA. </li><li> Dilui-se os anticorpos primários em 1: 1000 de concentração em 5 mL de tampão de bloqueio, adicionar diluição para a membrana, e incubar com agitação suave durante 1 h a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. membrana de lavagem 3 vezes em PBS com 0,05% de Tween-20. </li><li> Incubar as membranas durante 1 h à RT com Secundaria acoplado-fluorescente no infravermelhoy anticorpo a 1: 20000 em tampão de bloqueio de diluição como acima. </li><li> Lavar membrana duas vezes em PBS com 0,05% de Tween-20 e depois uma vez em PBS. </li><li> membrana imagem utilizando detecção de fluorescência no infravermelho padrão. </li></ol> 7. ensaios de crescimento independente da ancoragem NOTA: Para um protocolo de ensaio em agar mole detalhada, ver 28. <ol><li> Quente meios 2x DMEM estéril a 42 ° C em banho de água quente. Durante este tempo, o calor de pré-autoclavadas a 1% de agarose em microondas durante 3 minutos. Micro-ondas durante um período adicional de 30 segundos de cada vez conforme necessário, ou até estarem completamente fundidos. Mover de agarose para um banho de água a 42 ° C. </li><li> Colocar um tubo de 50 mL cónico numa proveta com 42 ° C em água estéril um capuz e misturar 1% de agarose e meios 2x DMEM numa mistura 1: 1 proporção de contabilidade para 1,5 mL de mistura por poço numa placa de 6 poços. Sempre preparar extra de DMEM / agarose para dar conta de erro pipetagem e para evitar bolhas. </li><li> Adicionar a mistura aoos lados do poço, assegurando que não se formem bolhas e deixar repousar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Enquanto a camada inferior é solidificando, preparar a cada grupo de células RD transf ectadas no passo 3 aspirao por meios e lavagem uma vez com 1 mL de PBS. Aspirar PBS e adicionar 0,2 ml de 0,05% de tripsina e incubar a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Neutraliza-se a tripsina em 0,8 mL de meio e células Triturar para formar uma suspensão de célula única. Transferir a suspensão de células para um tubo cónico de 15 mL. </li><li> Contagem de células e calcular o volume de suspensão de células necessário para a 10.000 células por poço. </li><li> Aquecer 0,6% de agarose em microondas durante 3 minutos, seguido por 30 segundos de cada vez até que esteja completamente derretida. Mover de agarose a 42 ° C Banho de água. </li><li> Colocar um tubo de 50 mL cónico numa proveta com 42 ° C em água estéril um capuz. Misturar 0,6% de agarose e suspensão de células diluída numa proporção de 1: 1 para se preparar 1,5 mL de mistura por poço numa placa de 6 poços. Sempre preparar suspensão de células de cama / agarose misturar para dar conta de erro pipetagem epara evitar bolhas. NOTA: É importante trabalhar a 42 ° C aqui. Se a temperatura é muito baixa a mistura vai solidificar antes do plaqueamento, e temperaturas acima de 42 ° C irá afectar a viabilidade celular. </li><li> Misture bem por trituração células várias vezes e adicionar mistura de células aos poços, assegurando que não forma bolhas, e deixar solidificar durante 20 minutos a RT. </li><li> Adicionar 2 ml de meio suplementado a cada poço e mover as placas para incubadora. <ol><li> Mudança de mídia uma vez por semana, durante 3-4 semanas ou até colônias multicelulares formar. Tenha cuidado para evitar tocar o agar ao remover a mídia por aspiração a vácuo. Em alternativa, usar um P1000 para remover a camada de topo do meio líquido. </li><li> Manchar placas de agar mole por adição de 200 uL de solução de cloreto de azul de tetrazólio Nitro (1 mg / mL em PBS) e incubar a placa durante a noite a 37 ° C. Substituir meios no dia seguinte com PBS para imagiologia. </li><li> poços de imagem em 40X ampliação total em um microscópio invertido. </li><li> Realizar a análise em ImageJ para a área colónia e número. Lote número médio de colónias de réplicas biológicas ± desvio padrão. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition%2C+TGF-beta%2C+and+osteopontin+in+wound+healing+and+tissue+remodeling+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Burn+Care+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury.</a> J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).</li>
<li>Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT-MET+in+renal+disease%3A+should+we+curb+our+enthusiasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm.</a> Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).</li>
<li>Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+EMT+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The role of EMT in renal fibrosis.</a> Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).</li>
<li>Willis, B. C., Borok, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+EMT%3A+mechanisms+and+implications+for+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).</li>
<li>Ye, X., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Plasticity%3A+A+Central+Regulator+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).</li>
<li>Li, L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+human+cancer%3A+comprehensive+reprogramming+of+metabolism%2C+epigenetics%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation.</a> Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).</li>
<li>Tsai, J. H., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+plasticity+in+carcinoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis.</a> Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).</li>
<li>Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+epithelial+plasticity+in+prostate+cancer+dissemination+and+treatment+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Migration+and+Invasion+Uncoupled%3A+Increased+Migration+Is+Not+an+Inexorable+Consequence+of+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).</li>
<li>Mathow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zeb1+affects+epithelial+cell+adhesion+by+diverting+glycosphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism.</a> EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).</li>
<li>Ware, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+resistance+to+gefitinib+mediated+by+cellular+reprogramming+and+the+acquisition+of+an+FGF2-FGFR1+autocrine+growth+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop.</a> Oncogenesis. 2, e39(2013).</li>
<li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+versus+mesenchymal+phenotype+determines+in+vitro+sensitivity+and+predicts+clinical+activity+of+erlotinib+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).</li>
<li>Jolly, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+elucidating+the+connection+between+epithelial-mesenchymal+transitions+and+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness.</a> J R Soc Interface. 11 (101), 20140962(2014).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133 (4), 704-715 (2008).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+is+regulated+via+microRNA-200%2FZEB1+axis+control+of+tumour+cell+PD-L1+expression+and+intratumoral+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression.</a> Nat Commun. 5, 5241(2014).</li>
<li>Nicolazzo, C., Gradilone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+circulating+tumor+cells+in+soft+tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , 697395(2015).</li>
<li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://mcb.asm.org/content/early/2016/07/08/MCB.00373-16.abstract">Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Transition+Phenotype+Is+Associated+with+Clinicopathological+Factors+That+Indicate+Aggressive+Biological+Behavior+and+Poor+Clinical+Outcomes+in+Invasive+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer.</a> J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).</li>
<li>Humphries, B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family%3A+small+molecules+with+novel+roles+in+cancer+development%2C+progression+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy.</a> Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).</li>
<li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+primary+high-grade+soft+tissue+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas.</a> Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).</li>
<li>Petrof, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+GRHL2+result+in+an+autosomal-recessive+ectodermal+Dysplasia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome.</a> Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).</li>
<li>Werner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+the+transcription+factor+grainyhead-like+2+%28GRHL2%29+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer.</a> J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).</li>
<li>Werth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+grainyhead-like+2+regulates+the+molecular+composition+of+the+epithelial+apical+junctional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex.</a> Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).</li>
<li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-Epithelial+Transition+in+Sarcomas+Is+Controlled+by+the+Combinatorial+Expression+of+MicroRNA+200s+and+GRHL2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).</li>
<li>Varma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+Grainyhead-like+2+and+NK2-homeobox+1+form+a+regulatory+loop+that+coordinates+lung+epithelial+cell+morphogenesis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation.</a> J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).</li>
<li>Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fluorescent+protein+expressing+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+morphological+screen+identifies+novel+microRNAs+that+regulate+neuroblastoma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation.</a> Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).</li>
<li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soft+agar+colony+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The soft agar colony formation assay.</a> J Vis Exp. (92), e51998(2014).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomics+and+genomics+analysis+reveals+a+novel+mesenchymal+to+epithelial+reverting+transition+in+leiomyosarcoma+through+regulation+of+slug%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).</li>
<li>Alba-Castellon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail1+expression+is+required+for+sarcomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Snail1 expression is required for sarcomagenesis.</a> Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).</li>
<li>Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+to+Epithelial+Transition+Induced+by+Reprogramming+Factors+Attenuates+the+Malignancy+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0156904(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Sarcomas são cancros raros, mas altamente agressivas de uma linhagem mesenquimal. Apesar da sua linhagem mesenquimal, um subconjunto dos sarcomas parece sofrer uma transição fenotípica para um estado mais epitelial semelhante. Este interruptor MET-like tem relevância prognóstico, como pacientes com mais tumores epiteliais, como são menos agressivos 24. Apesar da sua relevância clínica, existem poucos estudos sobre os mecanismos moleculares de condução dessas transições fenotípicas em sarcomas. </...

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Shenghan Xu
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Shengnan Xu

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Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

plasticidade fenotípica refere-se a uma transição reversível entre os fenótipos celulares, e é geralmente divididos em dois tipos, epitelial-a-mesenquimal (EMT) transições e transições mesenquimais-a-epitelial (MET). Esta plasticidade fenotípica desempenha um papel importante em processos normais de organismos multicelulares, tais como desenvolvimento e cicatrização de feridas 1; no entanto, estas mesmas vias e programas de expressão génica também pode levar a doenças, tais como fibrose (revisto em 2, 3, 4) e a metástase de carcinoma (revisto em referências 5, 6, 7, 8). Durante a metástase, por exemplo, EMT perturba polaridade celular, as interacções célula-célula, e promove a invasão 9, 10. Juntos, EMT contribuirs para um estado fenotípico que facilita a disseminação de células de cancro. Além disso, EMT também conduz a uma série de outras alterações fenotípicas que dirigem um fenipo agressivo, incluindo a desregulação do metabolismo celular de cancro 6, o desenvolvimento de resistência ao fármaco 11, 12, o aumento da capacidade do tumor-iniciação 13, 14 e 15 acolher evasão imune. plasticidade fenotípica tem sido bem estudada na progressão do carcinoma; no entanto, os sarcomas também exibem plasticidade fenotípica. Curiosamente, parece que alguns dos mesmos drivers de plasticidade fenotípica em carcinomas também contribuem para a plasticidade sarcoma e agressividade. Por exemplo, células tumorais circulantes (CTCs) a partir de pacientes de sarcoma foram mostrados para expressar o EpCAM, uma proteína da superfície celular que é tipicamente encontrado em culas epiteliais 16. Addicionalmente, 250 amostras de sarcoma dos tecidos moles foram categorizados como epitelial-mesenquimal como ou semelhantes com base na expressão do gene. Pacientes na assinatura biomarcador epitelial-like tiveram melhor prognóstico do que pacientes com a assinatura biomarcador mesenquimais-like 17. Isto é consistente com muitos carcinomas, em que os doentes com mais de carcinomas epiteliais semelhantes têm melhores resultados em comparação com os pacientes com mais do mesquima semelhante a tumores 18. Enquanto alguns sarcomas exibir biomarcadores e vias de expressão génica consistentes com MET, as bases moleculares da plasticidade fenotípica permanecem pouco compreendidos. Para estudar os mecanismos e os condutores de MET em sarcoma foi desenvolvido um modelo de indução MET utilizando dois factores específicos do epitélio, o microARN (MIR) -200 família e grainyhead-like 2 (GRHL2). Os miR-200 são uma família de pequenos RNAs não-codificantes que regulam a expressão de genes por ligao ao dos UTRs 3 de messenger ARN e evitando a tradução na proteína. A família de miR-200 consiste em dois sub-grupos - um contendo miR-141 e miR-200a, e o outro incluindo o miR-200b, miR-200c, e miR-429. Os membros da família de miR-200 são enriquecidos em tecidos epiteliais, e a perda de miR-200 está associado com a metástase em carcinomas 19. A família de miR-200 também é regulada negativamente nos sarcomas de tecidos moles em comparação com o tecido normal 20. Similar aos miR-200s, GRHL2 é um regulador chave que é importante para o desenvolvimento epitelial 21. O factor de transcrição GRHL2 actua em dois modos para regular positivamente genes epiteliais, tais como a E-caderina: 1) Em células epiteliais, GRHL2 reprime directamente o principal regulador EMT, ZEB1 22; e 2) GRHL2 activa directamente a transcrição de genes epiteliais 23. As nossas investigações anteriores mostraram que a expressão combinada de miR-200s e GRHL2 em células de sarcomainduz um fenótipo MET-24 como. Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para criar um modelo in vitro de indução MET em células de sarcoma usando a expressão ectópica de miR-200s e GRHL2.

<table><tbody><tr><td>Contador automatizado Countess</td><td>Life technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Sistema de PCR em Tempo Real</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR microplaca</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Kit de qPCR universal rápido</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de Partida (PBS) Buffer de bloqueio</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>BSA baseado em tampão de bloqueio</td></tr><tr><td>Agarose de Propósito Geral LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glicina/SDS Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>Tampão de corrida</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Tampão de transferência</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &mu; m nitrocelulose</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep Kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAi Max</td><td>Thermo</td><td>Fisher 13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA miRNA miMImímica controle negativo #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>tem-miR-200 mirVana miRNA miRNA miMímica</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>tem-miR-200 mirVana miRNA miRNA imita</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>tem-miR-200 mirVana miRNA imita</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>meio sem soro</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Ecadherin</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta actina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>anti-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>anti-coelho AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease e Inibidor de Fosfatos</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &mu; m filtro para fluxo</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>nitro azul tetrazólio&nbsp;</td><td>Brometo</td> de hexadimetrina Sigma <td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL</td><td></td> de polibreno <td>Sigma</td> H9268 BD Bioscience 309657 <td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa estéril</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo de polipropileno de 5 mL Tubos de</td><td>citometria de fluxo</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Kit de <tr><td>transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>Thermo Fisher</td><td>Kit de</td><td>transcrição reversa</td></tr><tr><td>4368814 4% paraformaldiídeo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

a indução de transições mesenquimais-epiteliais em células de sarcoma

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

plasticidade fenotípica refere-se a um fenómeno no qual as células transitoriamente ganhar traços de outra linhagem. Durante a progressão do carcinoma, plasticidade fenotípica impulsiona invasão, disseminação e metástase. Com efeito, enquanto que a maioria dos estudos de plasticidade fenotípica têm sido no contexto de carcinomas epiteliais derivadas de, verifica-se os sarcomas, os quais são mesenquimal de origem, também exibem plasticidade fenotípica, com um subconjunto de sarcomas submetidos a um fenómeno que se assemelha a um mesenchymal- transição epitelial (MET). Aqui, nós desenvolvemos um método compreendendo a família de miR-200 e grainyhead-like 2 (GRHL2) para imitar este fenómeno MET-como observado no sarcoma paciente samples.We sequencialmente expressar GRHL2 e a família de miR-200 utilizando a transdução de células e transfecção, respectivamente , para compreender melhor as bases moleculares destas transições fenotípica em células de sarcoma. células de sarcoma que expressam miR-200s e GRHL2 demonstrado characterist epitelial aumentadaics na morfologia celular e alteração de biomarcadores epiteliais e mesenquimais. Estudos futuros utilizando estes métodos podem ser utilizados para compreender melhor as consequências fenotipicas de processos MET-como sobre células de sarcoma, tais como migração, invasão, propensão metastática, e resistência à terapia.

Esquema para a indução de MET em células de sarcoma Uma linha do tempo geral para a indução de alterações MET-como em células de sarcoma é mostrado na Figura 1. O protocolo começa por transdução GRHL2 (Figura 1A), seguido por transfecção da família miR-200 (Figura 1B). membros da família GRHL2 ou miR-200 não foram capazes de afectar a aparência de células RD quando expressa sozin...

Apresentamos aqui um método de cultura de células para a indução de transições mesenquimais-epiteliais (MET) em células de sarcoma com base na expressão ectópica combinado de microARN-200 e os membros da família grainyhead-like 2 (GRHL2). Este método é adequado para a melhor compreensão do impacto biológico de plasticidade fenotípica sobre a agressividade e tratamentos do cancro.

A indução de transições mesenquimais-epiteliais em células de sarcoma

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar as consequências fenotípicas das transições mesenquimais-epiteliais em sarcomas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre por que sarcomas com características epiteliais apresentam resultados superiores em comparação com sarcomas mais semelhantes ao tipo mesenquimal. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um meio fácil e reprodutível para estudar redes regulatórias gênicas downstream e fenótipos associados às transições mesenquimais-epiteliais em sarcomas.Ao compreender melhor a plasticidade fenotípica nos sarcomas, esperamos identificar intervenções terapêuticas que nos permitam direcionar os sarcomas para um estado mais indolente, semelhante ao epitelial. Realizando o procedimento estarão dois alunos de graduação em nosso laboratório, Jackson Xu e Shivee Gilja. No primeiro dia da transdução, plaque três vezes 10 à quinta potência de células HEK293T em cada uma de duas poças de uma placa de seis poças em dois mililitros de DMEM suplementado.Incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após o cultivo durante a noite, examine as células em um microscópio. Elas devem estar com 40 a 60% de confluência.Em seguida, em tubos separados contendo 200 microlitros de meio sem soro com 1,8 microgramas de p delta 8,9 e 0,2 microgramas de plasmídeos auxiliares pCMV-VSV-G, dilua dois microgramas do vetor vazio e dois microgramas do vetor contendo GRHL2. Em outro tubo, dilua quatro microlitros de um reagente de transfeção baseado em lipídios em 200 microlitros de meio sem soro por transfeção. Isso resultará em oito microlitros e 400 microlitros para duas amostras.Adicione 200 microlitros da mistura do reagente de transfeção a cada solução de plasmídeo e, em seguida, incube as amostras por 20 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, utilize um aspirador a vácuo para remover o meio das células HEK293T. Lave as células uma vez com um mililitro de PBS e, então, substitua o PBS por 800 microlitros de meio livre de soro.Após 20 minutos, adicione 400 microlitros da mistura de plasmídeo com reagente de transfeção gota a gota em cada poço das células cultivadas. Incube o recipiente por duas horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, remova cuidadosamente o meio de transfeção por aspiração a vácuo.As células HEK293T são fracamente aderentes, portanto, ao aspirar o meio, tenha cuidado para não remover as células do fundo da placa ou do frasco. Substitua o meio aspirado por dois mililitros de DMEM suplementado. Retorne as células ao incubador para cultivo durante a noite.No dia seguinte, troque o meio nos cultivos de células HEK293T transfectadas e, em seguida, plaque três vezes dez à quinta potência de células RD de rabdomiossarcoma humano em cada poço de uma placa de seis poços contendo dois mililitros por poço de DMEM suplementado. Incube ambas as placas durante a noite. No quarto dia, utilize uma pipeta para coletar o meio viral das células HEK293T e transfira-o para dois novos tubos cónicos de 15 mililitros, um contendo lentivírus com vetor vazio e outro contendo lentivírus com o plasmídeo GRHL2.Substitua cuidadosamente o meio por DMEM novo e coloque as células HEK293T de volta no incubador durante a noite. Em seguida, adicione dois microlitros de polibreno a 10 miligramas por mililitro por mililitro de meio viral em dois novos tubos cónicos de 50 mililitros, um para a transfeção com vetor vazio e outro para a transfeção com GRHL2. Remova o êmbolo de uma seringa de três mililitros e acople um filtro de politetrafluoroetileno de 0,45 micrômetro à ponta da seringa.Adicione o meio viral coletado anteriormente à câmara da seringa e injete-o em um dos novos tubos cónicos de 50 mililitros contendo polibreno. Repita este passo com a outra amostra. Em seguida, remova o meio das células RD por aspiração a vácuo e adicione dois mililitros de cada uma das amostras de meio viral filtrado a poços separados da placa de RD.Incube as células RD a 37 graus Celsius em um incubador umidificado. No dia seguinte, repita a coleta do meio viral e adicione o meio de infecção aos mesmos poços contendo as células RD previamente infectadas. As células HEK293T podem ser descartadas após a coleta do meio viral.Incube as células por mais dois dias. No sétimo dia, lave as células RD com um mililitro de PBS, depois adicione 200 microlitros de tripsina a 0,05% a cada poço. Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos.Adicione dois mililitros de meio suplementado e, em seguida, transfira a suspensão celular para novos tubos cónicos de 15 mililitros. Centrifugue as células a 250 g por cinco minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspire o meio e re-suspenda as células em um mililitro de DMEM suplementado com 5% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.Para filtrar as células em preparação para citometria de fluxo, use uma pipeta para aplicar a suspensão celular RD de um mililitro através de um filtro estéril de 30 micrômetros em tubos para citometria de fluxo. Coloque os tubos sobre gelo. Utilizando um citômetro de fluxo, separe as células positivas para EGFP em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro contendo 0,5 mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.Coloque as células classificadas novamente no gelo. Plaque as células positivas para EGFP provenientes das transduções com vetor vazio e GRHL2 em um total de um mililitro de DMEM suplementado em poços separados de uma placa de 12 poços. Em seguida, coloque as células no incubador para cultivo.O rendimento de células positivas para EGFP após citometria de fluxo geralmente é bastante baixo, na faixa de 50.000 a 100.000 células. Devido a isso, as células podem precisar ser cultivadas por um período adicional de 10 a 14 dias antes de prosseguir para a próxima etapa. Em um tubo de microcentrífuga, adicione três microlitros de cada mimetizador de miR-200 a 50 micromolar a 300 microlitros de meio livre de soro.Em um tubo separado, adicione nove microlitros de microRNA controle negativo a 50 micromolar em 300 microlitros de meio livre de soro. Em seguida, em outro tubo de microcentrífuga, adicione seis microlitros de reagente de transfeção específico para siRNA em 600 microlitros de meio livre de soro. Divida 300 microlitros dessa mistura em dois tubos, um para cada uma das duas misturas de miR.Combine 300 microlitros de cada mistura de miR com uma mistura de 300 microlitros de reagente de transfeção. Incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Durante a incubação, prepare uma suspensão celular de 600.000 células RD positivas para EGFP expressando o vetor MD ou GRHL2 em 2,4 mililitros com 250 células por microlitro de meio sem soro por tratamento.Em uma placa de 24 poços, adicione 100 microlitros por poço da mistura de miR-200 ou da mistura controle negativo em seis poços. Em seguida, adicione 400 microlitros de cada suspensão celular em três poços de cada mistura de miR. Incube a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono durante a noite.No dia seguinte, troque o meio por DMEM completamente suplementado. Colete as células dois dias depois para análise utilizando o tampão apropriado. Imagem cada poço a cada duas horas com uma objetiva de 10X utilizando um sistema automatizado de imagem de células vivas.Essas imagens de lapso de tempo mostram a transição mesenquimal-epitelial, ou MET, em células RD que expressam GRHL2, EGFP e miRNAs miR-200. As células mudam de formato alongado para um aspecto semelhante a seixos, com aumento das adesões célula a célula e uma morfologia mais arredondada. A MET não é observada em outras condições de tratamento.Em vez disso, as células exibem uma morfologia alongada, em forma de fuso, com poucas conexões entre célula e célula. Durante a indução de MET, a mudança morfológica nas células RD após superexpressão de GRHL2 e miR-200 foi acompanhada pela upregulação do marcador epitelial E-caderina, conforme medido por qPCR e western blotting. A adição de miR-200s aumentou a E-caderina isoladamente, mas a superexpressão combinada de miR-200s e GRHL2 potencializou sinergicamente a expressão da E-caderina.Como demonstrado pela microscopia de imunofluorescência, houve um aumento nas junções entre células de moléculas de adesão epitelial, EpCAM e TJP-1, indicado pelas setas brancas. A regulação positiva de proteínas epiteliais foi acompanhada pela regulação negativa dos genes mesenquimais ZEB1 e Notch1 por meio de QRT-PCR. A indução do MET reduziu o crescimento independente de aderência das células RD, conforme medido por ensaios de crescimento em ágar macio.A inibição do crescimento em ágar macio foi provocada exclusivamente pelos miR-200, já que a superexpressão de GRHL2 levou a um aumento no crescimento independente de aderência. Isso é consistente com relatos anteriores que mostram que a expressão de GRHL2 induz crescimento independente de aderência. Após este procedimento, outros métodos, incluindo ensaios para medir alterações na migração celular, invasão, metástase e resposta à terapia, podem ser realizados com o objetivo de elucidar as consequências fenotípicas do MET em sarcomas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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