Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

O objetivo geral deste experimento é comparar dois métodos usados para isolar DNA organelar de alta qualidade, tanto DNA plastidial quanto mitocôndria do tecido foliar vegetal adequado para sequenciamento de próxima geração. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave em biologia vegetal, como a extensão da diversidade organelar entre os táxons e como as mudanças na sequência ou estrutura do genoma organelar afetam o desenvolvimento e a resposta ao estresse. Compararemos duas técnicas, o método de centrifugação diferencial que enriquece para um tipo organelar específico e a técnica de meta-fracionamento que recupera DNA organelar total de amostras menores de tecido congelado.

O procedimento padrão para o cultivo de mudas de trigo é plantar sementes em vermiculita, em vasos quadrados com quatro a seis sementes por canto. Transfira os vasos para uma estufa com um ciclo de luz de 16 horas. Regue as plantas todos os dias.

Fertilize as plantas com um quarto de colher de chá de fertilizante granular 20-20-20 MPK após a germinação e novamente sete dias após a germinação. Para adulação de mudas de trigo, plante sementes e cuide das plantas como no procedimento padrão. Mas coloque os vasos em uma câmara de crescimento escura.

Uma alternativa ao cultivo dessas mudas em uma câmara de crescimento escura é cobrir as plantas na estufa, mas com ventilação adequada. O primeiro passo neste procedimento é isolar as organelas. Colha cinco gramas de tecido fresco e lave-o em água fria e estéril em um copo gelado com gelo.

Usando uma tesoura, corte o tecido da folha em pedaços de aproximadamente um centímetro diretamente em um tubo pré-resfriado de 50 milímetros contendo dois cilindros de moagem de cerâmica. Mantenha as amostras no gelo durante todo o procedimento. Para evitar contaminação cruzada, é importante trocar a tesoura entre as amostras.

Levar as amostras para a hotte e adicionar 20 mililitros de tampão STE a cada tubo de 50 mililitros. Coloque as amostras em blocos de moagem criogênica pré-resfriados em um aparelho de moagem de tecido e triture as amostras por 30 segundos a 1.750 rotações por minuto. Coloque as amostras no gelo por cerca de um minuto.

Gire as posições da amostra e triture por mais 30 segundos a 1.750 rotações por minuto. Retorne as amostras para o balde de gelo. Para cada amostra, insira um funil em um tubo limpo de 50 mililitros colocado em gelo e coloque uma camada de pano de filtração no funil.

Umedeça previamente o pano de filtragem com cinco mililitros de tampão STE e salve o fluxo. Despeje o tecido homogeneizado no funil. Enxágue o tubo de moagem com 15 mililitros de tampão STE, tampe e inverta o tubo para enxaguar as paredes e a tampa e despeje seu conteúdo no funil.

Remova cuidadosamente as pedras de cerâmica e, em seguida, aperte e torça o pano de filtragem no funil. Para evitar contaminação cruzada, troque as luvas entre as amostras. Enrole as tampas dos tubos com filme de parafina para evitar derramamento.

Centrifugar a 2 000 x G, a quatro graus Celsius, durante 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta sorológica para aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e coloque-o em um tubo de centrífuga de alta velocidade de 50 mililitros com uma junta de vedação hermética. Coloque um pequeno copo de gelo em uma balança, rasgue a balança e pese cada sobrenadante.

Use o tampão STE para equilibrar os tubos dentro de 0,1 gramas e, em seguida, centrifugue a 18.000 x G em quatro graus Celsius por 20 minutos. Quando a centrifugação estiver concluída, devolver as amostras à hotte e rejeitar o sobrenadante. Adicione um mililitro de tampão ST ao pellet e ressuspenda suavemente usando um pincel macio.

Adicione 24 mililitros de tampão ST para obter um volume final de 25 mililitros. Gire suavemente o pincel em uma suspensão para misturar e, em seguida, pressione o pincel na lateral de um tubo para remover todo o líquido antes de remover o pincel. Depois de equilibrar os tubos, centrifugue a 18.000 x G em quatro graus Celsius por 20 minutos.

Durante esta centrifugação, prepare a solução de DNA 1 conforme descrito no protocolo de texto e alíquota de 200 microlitros para um tubo de 1,5 mililitro por amostra. Quando a centrifugação estiver completa, descarte o sobrenadante e seque o tubo. Para cada tubo de centrífuga de alta velocidade, adicione 300 microlitros de tampão STE e ressuspenda o pellet usando um pincel macio.

Coloque o pincel no tubo de 1,5 mililitro previamente preparado contendo 200 microlitros de solução de DNA 1 e gire o pincel para remover qualquer pellet residual preso no pincel. Pipete a solução de DNA 1 no tubo de centrífuga de alta velocidade e gire suavemente para misturar. Enrole o filme de parafina ao redor do topo de cada tubo e incube a 37 graus Celsius em banho-maria por 30 minutos.

Durante a incubação, misture delicadamente girando. Usando uma ponta de pipeta com orifício largo, pipete suavemente a mistura de pellets para fora do tubo e coloque-a em um tubo de baixa ligação de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de EDTA 400 milimolar, pH 8,0 ao tubo de centrífuga de alta velocidade.

Pipete suavemente para remover completamente o pellet residual e transfira o EDTA para o tubo de baixa ligação que contém a mistura de pellets. Misture delicadamente por inversão. Centrifugar a 18 000 x G, a quatro graus Celsius, durante 20 minutos.

Em seguida, descartar o sobrenadante, secar cada tubo e utilizar imediatamente o sedimento para isolamento do ADN. Neste método, o DNA organelar é enriquecido a partir do DNA genômico total que foi extraído usando colunas comerciais de extração de DNA. Prepare a quantidade necessária de esferas magnéticas ligadas à proteína MBD2 FC, de acordo com as instruções do fabricante e dimensione as reações a serem usadas entre um e dois microgramas de DNA de entrada total.

Nesta demonstração, são necessários 160 microlitros de grânulos para um micrograma de DNA de entrada total. Para capturar DNA nuclear metilado, adicione um micrograma de DNA de entrada a um tubo contendo 160 microlitros de esferas magnéticas ligadas a MBD2 para cada amostra individual e pipete suavemente para cima e para baixo com uma ponta de furo largo. Adicione o volume apropriado de 5x tampão de lavagem de ligação para uma concentração final de 1x e pipete a amostra para cima e para baixo com uma ponta de furo largo, algumas vezes para misturar.

Gire os tubos em temperatura ambiente por 15 minutos. Para o sucesso do puxar para baixo, é fundamental misturar bem os grânulos durante a incubação, principalmente se houver aglomeração significativa do grânulo. Para evitar a aglomeração de grânulos e garantir a retirada do DNA metilado, pipete suavemente as amostras com uma ponta de pipeta de diâmetro largo e agite as amostras duas a três vezes durante a incubação.

Gire brevemente os tubos contendo a mistura de DNA e esferas magnéticas. Coloque os tubos em um rack magnético por pelo menos cinco minutos para coletar as contas ao lado dos tubos. A solução deve parecer clara, contém DNA enriquecido organelar não metilado.

Usando pontas de furo largo, remova cuidadosamente o sobrenadante limpo sem perturbar os grânulos e transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros limpo e de baixa ligação. Armazene as amostras a 20 ou 80 graus Celsius. O ensaio de PCR agudo foi empregado para avaliar as abundâncias relativas de três implicons específicos de organelas no DNA genômico total e na fração de DNA organelar obtida de ambos os métodos.

No geral, os dados indicam que o método de centrifugação diferencial, preferencialmente, enriquece as mitocôndrias. A fração não metilada do DNA genômico total metilfracionado mostra enriquecimento substancial de ambos os implícones organelares. As porcentagens de leituras mapeadas para os genomas de referência de mitocôndrias ou cloroplastos da primavera chinesa e do trigo cultivado são consistentes com os resultados do QPCR.

A centrifugação diferencial produz DNA que é mais enriquecido em DNA mitocondrial e o metilfracionamento produz DNA que provavelmente reflete a abundância nativa dos dois genomas organelares. Os rótulos das amostras, incluindo E, designam amostras idílicas e NE designam amostras não idílicas. Curiosamente, a idilação não alterou as abundâncias organelares.

Em ambos os métodos, a cobertura teórica dos genomas referenciados por mitocôndrias ou cloroplastos excede 100x a cobertura, mesmo quando 12 bibliotecas atremultiplexadas. O DNA genômico total migra como um esfregaço difuso em eletroforese em gel pós-campo e excede 50 quilobases. A fração nuclear após o metilfracionamento diminui de tamanho, mas permanece centrada em torno de 50 quilobases, sugerindo que o DNA metilfractioante é mais adequado para sequenciamento de leitura longa.

Uma vez dominadas, ambas as técnicas de extração de DNA organelar podem ser feitas em um a dois dias, desde a coleta da amostra até a avaliação do produto final, se realizadas adequadamente. A técnica de metilfracionamento tem o potencial de expandir muito a gama de estudos de DNA organelar para amostras raras e difíceis, uma vez que as entradas de tecido são extremamente baixas. No entanto, a centrifugação diferencial ainda pode ser preferível quando apenas o DNA mitocondrial é necessário para estudos a jusante.

Da mesma forma, as etapas de centrifugação podem ser ajustadas para extrair preferencialmente o DNA plastidial, se desejado. Ambos os métodos de extração de DNA organelar produzem DNA adequado para sequenciamento de próxima geração, mas o metilfracionamento produz DNA de alta taxa molecular que é ideal para sequenciamento de leitura longa.