Question 1

Como as técnicas de edição do genoma criam mutações direcionadas no DNA?

Accepted Answer

Métodos de edição do genoma usam enzimas nucleases projetadas para criar pequenos cortes ou quebras de fita dupla em sequências específicas de DNA. As células tentam reparar esse dano por meio de união de extremidades não homólogas ou reparo direcionado por homologia. Durante o reparo, mutações são introduzidas na região alvo com eficiência muito maior do que os métodos clássicos direcionamento gênico.

Question 2

Qual é a diferença entre NHEJ e HDR na reparação do ADN?

Accepted Answer

A união de extremidades não homólogas (NHEJ) religa diretamente extremidades quebradas do DNA, mas frequentemente de forma imperfeita, excluindo ou adicionando bases e mutando a sequência alvo. O reparo direcionado por homologia (HDR) corrige danos copiando de um modelo homólogo, permitindo que os pesquisadores adicionem sequências específicas para direcionar mudanças precisas no local alvo.

Question 3

Como as nucleases de dedo de zinco e TALENs diferem em sua abordagem de direcionamento?

Accepted Answer

Zinc finger nucleases (ZFNs) fundem domínios de dedos de zinco ligados ao DNA à endonuclease FokI, com cada domínio reconhecendo um tripleto específico de nucleotídeos. TALENs unem FokI a domínios efectores semelhantes a ativadores de transcrição bacterianos, onde cada domínio reconhece uma única base de DNA única, fornecendo diferentes níveis de especificidade de sequência.

Question 4

Por que o sistema CRISPR-Cas9 é vantajoso em comparação com os métodos de edição do genoma baseados em proteínas?

Accepted Answer

O sistema CRISPR-Cas9 usa sequências de guia de RNA personalizáveis chamadas RNAs guia únicos (sgRNAs) para direcionar Cas9 às sequências genéticas desejadas. Esta abordagem baseada em RNA fornece vantagens distintas sobre métodos baseados em proteínas como ZFNs e TALENs porque a sequência guia pode ser facilmente modificada para direcionar quase qualquer localização genômica em células de mamíferos ou outros sistemas.

Question 5

Que papel desempenha o motivo adjacente ao protoespaçador no direcionamento CRISPR-Cas9?

Accepted Answer

O motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) é uma sequência de 3 pares de bases localizada no final 3' da região alvo do DNA. Cas9 requer o PAM para reconhecer e cleaving o DNA alvo, e a sequência exata do PAM é específica do organismo do qual a enzima Cas9 se originou, tornando-o essencial para a edição bem-sucedida do genoma.

Question 6

Como são sintetizadas e incorporadas sequências de guia CRISPR nas células?

Accepted Answer

Dois oligonucleotídeos complementares correspondentes à sequência-alvo são sintetizados, desnaturados e renaturados. A sequência guia resultante é ligada em um plasmídeo contendo um scaffold de sgRNA usando enzimas de restrição e ligase. A construção CRISPR é então co-transfectada com uma construção codificadora de Cas9 em células-alvo, que são cultivadas e selecionadas por PCR ou sequenciamento para as mutações desejadas.

Question 7

Quais são algumas aplicações atuais da edição do genoma na pesquisa?

Accepted Answer

Pesquisadores usam edição genômica para inserir sequências repórter como a proteína fluorescente verde em genes específicos, gerar organismos knockout onde os genes são tornados não funcionais e criar grandes deleções genéticas induzindo duas quebras de dupla fita na mesma região cromossômica. Essas aplicações permitem o estudo de mecanismos de função gênica e doença em organismos modelo e células cultivadas.

Edição do Genoma - Questionário de avaliação