Name: Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de Staphylococcus aureus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a extrair e quantificar metabolitos de Staphylococcus aureus usando cromatografia líquida e espectrometria de massas em tandem. Este método revela como a bactéria ajusta seu metabolismo durante infecções.

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Este trabalho foi financiado em parte por uma NIH Pathway to Prêmio Independência (conceder GM 099.893) e os fundos de arranque faculdade de SRB, bem como um projeto de Grant Research (conceder GM 042.219). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e interpretação, ou a decisão de enviar o trabalho para publicação.

1. Preparação de Soluções Tampão <ol><li> Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) por diluição de uma solução de reserva de 10x PBS para uma concentração final de 1x com água ultrapura (desionizada destilada e). </li><li> Preparar a solução de têmpera através da combinação de 2 mL de acetonitrilo, 2 mL de metanol, 1 mL de H2O ultra-pura, e 19 uL (concentração final 0,1 mM) de ácido fórmico. </li><li> Prepare LC-MS solvente A pela adição de ácido fórmico (0,2% [v / v] concentração final) de água ultrapura. </li><li> Prepare LC-MS solvente B por adição de ácido fórmico (0,2% [v / v] de concentração final) a acetonitrilo. Nota: Todas as soluções devem ser preparadas utilizando os reagentes de maior grau de pureza disponível (geralmente de alto desempenho de grau de cromatografia luida). Soluções deve ser preparada fresca antes de cada experiência e armazenados em gelo antes do uso. </li></ol> 2. Estabelecimento de estado estacionário S. aureus Crescimento <ol><li> Streak S. aureus estirpes de interesse para o isolamento em agar de soja tríptica (TSA) a partir de um stock de glicerol congelado. Incubar a 37 ° C durante 16-24 h. </li><li> Inocular 4 ml de caldo tríptico de soja (TSB) ou outro meio adequado de incubação em tubos de vidro estéreis, com colónias únicas de cada estirpe. Incubar inclinada (~ 70 ° de ângulo), com rotação a 60 rotações por minuto (rpm) a 37 ° C durante 16-20 h. NOTA: Culturas durante a noite são propensos a gradientes de oxigénio quando são usados ​​métodos convencionais, incluindo os descritos na etapa 2.2, que afectam a fisiologia celular. Assim, nós empregamos uma estratégia de múltiplos back-diluição para garantir estado de equilíbrio biológico (veja as etapas 2,4-3,2, abaixo). </li><li> Utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade óptica das culturas a partir do passo 2.2 a 600 nm (OD 600). Use meio estéril como uma referência óptica (em branco). Dilui-se estas células para uma DO600 de 0,05 em 50 ml de meio TSB estil (pré-aquecido a 37 ° C) em separado, 250 mL DeLong frascos. </li><li> incuBATE as culturas a 37 ° C em um banho de água com agitação a 280 rpm. </li><li> Cada 30 minutos, tomar OD 600 medições; como as densidades ópticas aumentar, pode tornar-se necessário diluir as culturas com TSB para que permaneçam dentro do intervalo linear de absorvância do espectrómetro. </li><li> Quando as culturas a partir do passo 2.5 atingir uma OD 600 de ~ 0,8-1,0, subcultura-los em 50 ml de 37 ° C TSB para um OD 600 de 0,01-0,05 e repetir os passos 2.4 e 2.5. </li></ol> Setup Coleção 3. Amostra <ol><li> Prepara-se uma cama de gelo seco esmagado num recipiente apropriado (por exemplo, um prato de vidro, balde de gelo, ou mais frio). </li><li> À medida que as densidades ópticas das culturas aproximar do ponto de colheita desejada, adicionar 1 mL de uma solução não tratada para um prato de Petri 35 mm, e pré-arrefecer em gelo seco para têmpera ≥5 min. NOTA: O &quot;ponto de colheita desejada&quot; irá variar dependendo objetivos experimentais. Por exemplo, se alguém fosse examinar metabolites durante o crescimento aeróbico, os principais indicadores desse estado incluem excreção de etilo e re-assimilação do acetato de durante a fase de crescimento exponencial pós-32, 33. Geralmente, este ponto deve estar dentro de uma fase de crescimento específico (por exemplo, fase exponencial). Os 600 valores de DO específicos associados com esta fase pode variar entre diferentes estirpes bacterianas e meios de crescimento. </li><li> Coloque uma frita de filtro de aço inoxidável (pré-arrefecido a -20 ° C) em uma rolha de borracha e colocá-la no topo de um frasco de vácuo ligada a uma câmara de vácuo ou bomba de vácuo. </li><li> Aplicar o vácuo e colocar uma membrana de éster de celulose misturados (0,22 de tamanho de poro) no topo. NOTA: É importante a utilização de um filtro com um diâmetro igual ao da frita e para centrar correctamente este filtro para garantir que a amostra é retirada através do filtro, em vez de ao longo da borda. Molhar a membrana com gelo-frio, H2O esterilizada pode ajudarcom o posicionamento da membrana. </li></ol> 4. Colheita de Amostra <ol><li> A uma DO600 de ~ 0,4-0,5, utilizar uma pipeta serológica para remover 13 ml de cultura a partir do frasco e para aplicar a amostra ao filtro. </li><li> Depois de toda a amostra foi filtrada, lava-se imediatamente o filtro com ≥5 mL de PBS gelado para lavar metabolitos associados a médias. </li><li> Desligar o vácuo e usar um par de pinças estéreis para remover o filtro de frita. Inverter o filtro (no lado da célula para baixo) para a solução de paragem pré-gelada. NOTA: É importante realizar os passos acima rapidamente (isto é, dentro de segundos) e, assim que o líquido tiver sido removida para assegurar a rápida extinção das células, prendendo actividade metabólica. </li><li> Incubar o filtro numa solução de arrefecimento rápido em gelo seco para ≥20 min. </li><li> Usando pinças estéreis, inverter o filtro (-lado célula para cima) na placa de petri e usar uma micropipeta para lavar as células fora de tele membrana na solução de extinção. </li><li> Re-suspendeu as células em solução de paragem e, em seguida, transferir a suspensão de células para um tubo resistente a impacto 2 mL estéril contendo ~ 100 mL de esferas de sílica de 0,1 mm. Conserva-se a em gelo seco ou a -80 ° C. </li></ol> 5. Metabolito Extraction <ol><li> Descongelar amostras em gelo húmido e perturbar as células em um homogeneizador com quatro rajadas s 30 a 6.000 rpm, com períodos de arrefecimento 2 min em gelo seco entre os ciclos. </li><li> Esclarecer os lisados durante 15 minutos numa pré-arrefecido, de microcentruga refrigerada a velocidade máxima (isto é, 18,213 xg à ≤4 ° C). </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. </li><li> Usando uma micropipeta, transferir uma pequena parte da amostra para um tubo de microcentrífuga para a quantificação do teor de péptido residual no passo 6; armazenar o restante à temperatura de -80 ° C. NOTA: O volume da amostra reservados varia, dependendo do ensaio BCA usado no passo 6.1. esteamostra deve ser armazenada em gelo húmido para análise imediata ou congeladas a -80 ° C. </li></ol> 6. ácido bicinconínico (BCA) Ensaio <ol><li> Realizar um ensaio de BCA tal como recomendado pelo fabricante do kit, utilizando amostras a partir do passo 5.4 para determinar a concentração de péptido residual para cada amostra. </li></ol> 7. LC-MS <ol><li> Misturar 75 mL de S. aureus extracto com 75 ul de LC-MS solvente B, preparado no passo 1.4. </li><li> Vortex para misturar e centrifugação a 13000 xg durante 5 min. </li><li> Colocar 100 uL de sobrenadante para uma cromatografia líquida (LC) frasco e cap. Garantir que nenhuma bolha de ar estão presos na amostra. </li><li> Coloque os frascos LC para o amostrador automático LC-MS e editar a lista de execução no software &quot;offline Worklist Editor.&quot; <ol><li> Para preencher o &quot;Nome da Amostra&quot; (por exemplo, de tipo selvagem-1), &quot;Amostra Posição&quot; (por exemplo, P1-A1), &quot;Processo&quot; (por exemplo, fórmico Umcid-negativa Método), e (por exemplo, de tipo selvagem) 1-colunas &quot;do ficheiro de dados&quot;. Clique no botão &quot;Salvar Lista de trabalho&quot;. Abra o software &quot;Mass Spectrometry Aquisição de Dados da Estação de Trabalho&quot; e insira a lista de trabalho salva anteriormente. Clique no botão &quot;Iniciar Lista de trabalho Executar&quot; para iniciar a medição contínua LC-MS. </li></ol></li><li> Separaram-se as amostras numa coluna, ligar a coluna para um tempo de voo (TOF) espectrómetro, e acoplar o espectrómetro TOF com o sistema de LC. Utilizar um gradiente de fase móvel como se segue: 0-2 min, 85% de solvente B; 3-5 min, 80% de solvente B; 6-7 min, 75% de solvente B; 8-9 minutos, 70% de solvente B; 10-11,1 min, 50% de solvente B; 11,1-14 min, 20% de solvente B; e 14,1-24 min, 5% de solvente B; acabar com um período de re-equilíbrio de 10 min a 85% de solvente B e uma velocidade de fluxo de 0,4 ml min -1. </li><li> Usando uma bomba isocrática, infundir uma solução de massa de referência com o correr para permitir a calibração do eixo massa simultânea. NOTA: Este passoé baseado no manual de TOF espectrômetro padrão. <ol><li> Utilizar a mistura de ácido acético D4 e hexaquis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxi) fosfazina como a solução de massa de referência para realizar a calibração em tempo real. Utilizar a bomba isocrática com o caudal de 2,5 ml min -1 para a infusão. </li></ol></li></ol> 8. Lote Correcção de Contagem de iões <ol><li> Designa qualquer exemplo para servir como uma amostra de referência para o lote de correcção (por exemplo, de tipo selvagem, replicar 1). </li><li> Calcular a soma das contagens de iões para todos os metabolitos dentro da amostra de referência. Repita este cálculo para todas as amostras. </li><li> Dividir a contagem total de iões de cada amostra por contagem do total de iões da amostra de referência para gerar um rácio. </li><li> Dividir a contagem de iões para cada metabolito dentro de uma amostra pela relao entre a amostra / de referência para se obter uma contagem de iões corrigido-lote para cada metabolito. </li></ol> 9. Péptido Normalização <ol><li> Divide os valores de contagem de iões corrigido-lote para cada amostra obtida no passo 8 pela concentração de péptido determinado com o ensaio BCA no passo 6, para se obter um valor normalizado para cada metabolito. NOTA: As normalizados, lote-batch corrigido contagens de iões para cada metabolito obtido na etapa 9.1 pode ser directamente comparada entre estirpes e sujeitos a análise estatística (por exemplo, um U de Mann-Whitney -teste). Alternativamente, um metabolito conhecido por ser inalterada quer pelo tratamento ou fundo genético pode ser usado como um normalizador para detectar mudanças devido ao metabolito decomposição. A inclusão de uma quantidade conhecida de L-norvalina ou ácido gluraric no tampão de extracção pode ser utilizado para corrigir a perda durante o processamento da amostra 34. </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Todos os metabolitos de pequenas moléculas são ligadas uma à outra através das suas origens comuns em vias metabólicas centrais. Durante o crescimento exponencial, as células bacterianas são em estado estacionário biológica e metabólica, fornecendo um instantâneo do estado fisiológico sob condições específicas. Cody monitora suficiência de nutrientes por responder a ILV e GTP. Como ILV e GTP piscinas gota, actividade Cody é provável progressivamente reduzido, ajustando a expressão dos seus genes-alvo para se adaptar ao ...

patógenos bacterianos devem lidar com muitos desafios dentro do ambiente de host. Além de ataque directo por células do sistema imunológico, o hospedeiro também sequestra nutrientes essenciais para a sobrevivência das bactérias e a replicação, gerando imunidade nutricional 1, 2. Para sobreviver nestes ambientes hostis, patógenos bacterianos implantar fatores de virulência. Alguns destes factores de permitir que as bactérias para evadir a resposta imune; Outros factores incluem segregada enzimas digestivas, tais como hialuronidase, termonuclease, e lipases, que podem permitir que as bactérias para reabastecer nutrientes em falta por consumir constituintes derivadas de tecido 3, 4, 5. Com efeito, as bactérias têm evoluído sistemas reguladores que ligam o estado fisiológico da célula para a produção de factores de virulência 6, 7, <s<html> -se class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Um crescente corpo de evidências aponta para Cody como um regulador crítico que liga o metabolismo e virulência. Embora descoberto pela primeira vez em Bacillus subtilis como um repressor do gene dipéptido permease (dpp) 11, Cody é agora conhecido por ser produzido por quase todas as bactérias em G + C Gram-positivos baixos 12, 13 e regula dezenas de genes envolvidos em carbono e metabolismo 14, 15, 16, 17, 18, 19 de azoto. Em espécies patogénicas, Cody também controla a expressão de alguns dos mais importantes genes de virulência de 20, 21,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody é activada como uma proteína de ligação de ADN por duas classes de ligandos: aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA, isoleucina, leucina, e valina [ILV]) e GTP . Quando estes nutrientes são abundante, Cody reprime (ou em alguns casos, estimula) a transcrição. Como estes nutrientes tornam-se limitadas, actividade Cody é progressivamente reduzido, o que resulta em uma resposta transcripcional graduada que re-rotas precursores por meio de várias vias metabólicas ligados ao metabolismo central 28, 29, 30. Em tandem cromatografia luida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS) é uma técnica poderosa que pode identificar e quantificar com precisão pequenas moléculas metabolitos intracelulares 31. Quando emparelhado com transcanálise riptome (por exemplo, ARN-SEQ), este fluxo de trabalho analítico pode fornecer informações sobre as alterações fisiológicas que ocorrem em resposta ao stress ambiental ou nutricional. Aqui, apresentam-se um método para a extracção de metabolitos a partir de células de Staphylococcus aureus e subsequente análise por meio de LC-MS. Esta abordagem tem sido usada para demonstrar os efeitos pleiotrópicos das Cody sobre S. aureus fisiologia.

<table><tbody><tr><td>Material/Equipamentoa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DeLong Culture Flask (250 mL)</td><td>Belco</td><td>2510-00250</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Pistola, 500 mL</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td></td></tr><tr><td>Rolha de borracha de 3 furos, #7</td><td>Fisher</td><td>14-131E</td><td></td></tr><tr><td>Porta-filtro/frita em aço inoxidável</td><td>VWR</td><td>89428-936</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, 35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>Não tratada com cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Membrana de éster de celulose mista, 0,22 &mu; m tamanho do poro</td><td>Millipore</td><td>GSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos resistentes ao impacto, 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1420-9600</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Sílica, 0.1 mm</td><td>Biospec Products Inc</td><td>11079101Z</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Precellys 24</td> Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA <td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119-200-RD000.0</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de hidreto de diamante tipo C Agilent</td><td></td><td>70000-15P-2</td><td></td></tr><tr><td>Tempo de voo de massa precisa (TOF) LC-MS, bomba</td> de quat <td>Agilent</td><td>G6230B</td><td></td>série 6200</tr><tr><td>, série 1290 Agilent</td><td></td><td>G4204A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Bin, Série 1290</td><td>Agilent</td><td>G4220A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Válvula de Acionamento, Série 1290</td><td>Agilent</td><td>G1107A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Isocrática, Série 1290</td><td>Agilent</td><td>G1310B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCC, Série 1290</td><td>Agilent</td><td>G1316C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Amostrador, Série 1290</td><td>Agilent</td><td>G4226A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Termostato, Série 1290</td><td>Agilent</td><td>G1330B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><forte>Químico</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tríptico Caldo de Soja</td><td>Ágar Becton Dickinson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Difco, Granulado</td><td>Becton Dickinson</td><td>214530</td><td>Meio sólido contém 1,5% [p/v] de ágar</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) 10x</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Diluir fresco até 1x com água ultrapura</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-500</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-500</td><td>Optima LC-MS; ácido</td></tr><tr><td>fórmico</td> tóxico <td>Sigma Aldrich</td><td>94318</td><td>Para espectrometria de massa, 98%</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassHunter</td><td>Agilent</td><td>G3337AA</td><td></td></tr><tr><td>Cepa bacteriana</ forte></td><td><forte>Espécie</forte></td><td><forte>Cepa</forte></td><td><forte>Genótipo</forte></td></tr><tr><td>SRB 337</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>tipo selvagem</td></tr><tr><td>SRB 372</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>&Delta; codY::erm</td></tr><tr><td colspan="4">aOs produtos químicos e materiais enumerados são específicos do método descrito e não incluem produtos químicos ou materiais de laboratório normalizados.</td></tr></tbody></table>

uma abordagem baseada em espectrometria tandem cromatografia líquida de massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; staphylococcus aureus</em

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Em um esforço para frustrar patógenos bacterianos, os anfitriões muitas vezes limitam a disponibilidade de nutrientes no local da infecção. Esta limitação pode alterar as abundâncias de metabólitos chave para os quais fatores regulatórios respondem, ajustando o metabolismo celular. Nos últimos anos, um número de proteínas e de ARN surgiram como importantes reguladores da expressão de genes de virulência. Por exemplo, a proteína Cody responde a níveis de aminoácidos de cadeia ramificada e de GTP e é amplamente conservada em baixo G + C bactérias Gram-positivas. Como um regulador global em Staphylococcus aureus, Cody controla a expressão de dúzias de genes de virulência e metabólicas. Nossa hipótese é que S. aureus usa Cody, em parte, para alterar seu estado metabólico em um esforço para se adaptar às condições de limitação de nutrientes potencialmente encontrados no ambiente de host. Este manuscrito descreve um método para a extracção e análise de metabolitos a partir de S. aureus utilizando cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massatrometry, um protocolo que foi desenvolvido para testar esta hipótese. O método também destaca as melhores práticas que irão garantir rigor e reprodutibilidade, tais como manter o estado estacionário biológico e aeração constante sem o uso de culturas quimiostato contínuas. Em relação aos USA200 sensível à meticilina S. aureus isolar UAMS-1 estirpe parental, o mutante isogico Cody exibiram aumentos significativos na aminoácidos derivados a partir de aspartato (por exemplo, treonina e isoleucina) e diminui em seus precursores (por exemplo, aspartato e O -acetylhomoserine ). Estes resultados correlacionam-se bem com os dados obtidos com análise de transcrição de ARN-seguintes: os genes nestas vias foram supra-regulados entre 10 e 800 vezes no mutante nulo Cody. Acoplamento análises globais do transcriptoma e metaboloma pode revelar como as bactérias alterar o seu metabolismo, quando confrontado com o estresse ambiental ou nutricional, proporcionando potencial visão sobre as physmudanças iological associados com esgotamento de nutrientes experimentado durante a infecção. Tais descobertas podem abrir o caminho para o desenvolvimento de novos anti-infecciosos e terapêutica.

Analisamos piscinas metabolitos intracelulares em S. aureus durante crescimento in vitro num meio rico, complexo. Como prova de princípio, foram comparados os perfis de metabolitos entre o S. aureus sensível à meticilina osteomielite isolar UAMS-1 (tipo selvagem [WT]) e uma estirpe isogénica sem o regulador transcricional mundial Cody (Δ Cody) 26. O estado estacionário, culturas exponenciais das estirpes WT e Cody foram...

Aqui, descrevemos um protocolo para a extracção de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus e a sua subsequente análise por meio de cromatografia líquida e espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

O objetivo geral deste método de amostragem é coletar amostras de metabólitos de Staphylococcus aureus para quantificação subsequente por Cromatografia Líquida em Tandem com Espectrometria de Massas. Nosso laboratório tem interesse em estudar a interseção entre metabolismo e patogênese em bactérias relevantes para a saúde humana. Atualmente, estamos utilizando o patógeno oportunista humano Staphylococcus aureus como organismo modelo.Uma questão fundamental que desejamos responder é como as bactérias ajustam sua fisiologia e patogenicidade quando enfrentam a escassez de nutrientes durante a infecção no hospedeiro. Esta técnica é vantajosa porque fornece um instantâneo da distribuição de metabólitos específicos entre as diversas vias metabólicas em células em crescimento ativo, com mínima perturbação de seu estado fisiológico. Para começar, faça o estriamento dos linhagens de S.aureus de interesse para isolamento em ágar soja triptona a partir do estoque congelado em glicerol.Incube as células a 37 graus Celsius por 16-24 horas. No dia seguinte, inocule 4 mL de caldo tripticaseína de soja, ou TSB, em tubos de incubação de vidro estéreis com colônias isoladas de cada cepa. Incube os cultivos, inclinados com rotação, a 37 graus Celsius por 16-20 horas.Utilize um espectrofotômetro para medir a densidade óptica das culturas em 600 nanômetros, abreviado como OD600. Com base nesta medida, dilua as células até um OD600 de 0,05 em 50 mL de meio TSB estéril, em frascos Delong de 250 mL. Incube as culturas a 37 graus Celsius em banho-maria com agitação a 280 rpm.A cada 30 minutos, realize medições de DO600. À medida que as densidades ópticas aumentam, pode ser necessário diluir as culturas com TSB para mantê-las dentro da faixa linear de absorvância do espectrofotômetro. Enquanto as células estiverem crescendo, prepare recentemente as soluções de tampão de extração utilizando reagentes da maior pureza disponível, conforme descrito no protocolo textual.Quando as culturas atingirem uma OD600 entre 0,8 e 1,0, repique-as em 50 mL de TSB fresco pré-aquecido para uma OD600 de 0,01 a 0,05 e repita os passos de incubação e medição. Prepare uma camada de gelo seco moído em um recipiente apropriado, como uma travessa de vidro, balde de gelo ou isopor. À medida que as densidades ópticas das culturas se aproximarem do ponto desejado de colheita, adicione 1 mL da solução de quenching a uma placa de Petri não tratada de 35 mm e pré-resfrie em gelo seco por pelo menos 5 minutos.Para os nossos propósitos, o ponto desejado de colheita é uma densidade óptica de aproximadamente 0,4 a 0,5. No entanto, isso pode variar, dependendo dos objetivos experimentais. Em seguida, coloque um filtro frito de aço inoxidável em uma rolha de borracha e posicione-o sobre um frasco de vácuo conectado a uma linha de vácuo central ou a uma bomba de vácuo.Aplique o vácuo e coloque uma membrana de éster de celulose mista em cima. Utilize um filtro com o mesmo diâmetro do frit para garantir que todas as células sejam coletadas. É essencial coletar as células e interromper a atividade metabólica o mais rapidamente possível, a fim de obter um instantâneo das abundâncias metabólicas sob uma determinada condição.Até pequenos atrasos podem afetar a fisiologia em estado estacionário das células. Em uma OD600 entre 0,4 e 0,5, utilize uma pipeta serológica para remover 13 mL de cultura do frasco. Aplique imediatamente a amostra ao filtro.Após toda a amostra ter sido filtrada, lave imediatamente o filtro com no máximo 5 mL de PBS gelado para remover os metabólitos associados ao meio. Em seguida, desconecte a vácuo e use um par de pinças estéreis para remover o filtro do funil. Inverta o filtro na solução de quench pré-resfriada.Incube o filtro na solução de quenchagem em gelo seco por pelo menos 20 minutos. Usando as pinças estéreis, inverta o filtro na placa de Petri e utilize uma micropipeta para lavar as células da membrana para dentro da solução de quenchagem. Re-suspenda as células na solução de quenchagem e, em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo estéril resistente ao impacto de 2 mL contendo aproximadamente 100 microlitros de microesferas de sílica de 0,1 mm.Armazene isso em gelo seco ou a 80 graus Celsius. Para iniciar a extração de metabólitos, primeiro descongele as amostras em gelo úmido. Em seguida, rompa as células em um homogeneizador com quatro pulsos de 30 segundos a 6000 rpm, com períodos de resfriamento de dois minutos em gelo seco entre os ciclos.Clarifique os lisados por 15 minutos em um tubo de microcentrífuga refrigerado pré-resfriado, na velocidade máxima. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. Usando uma micropipeta, transfira uma pequena porção da amostra para um tubo de microcentrífuga para quantificação do teor residual de peptídeos conforme descrito no protocolo textual.Armazene o restante da amostra a 80 graus Celsius. Consulte o protocolo textual para análise dos metabólitos por cromatografia líquida e espectrometria de massa. O mutante nulo de CodY foi utilizado para investigar o esgotamento de aminoácidos de cadeia ramificada, já que a proteína CodY ajusta a expressão de dezenas de genes em resposta à queda na concentração desses nutrientes.A mutação codY tem pouco efeito na taxa de crescimento de células de S.aureus. A queda na densidade óptica no momento de 3 horas indica o passo de re-diluição, que aumenta o número de duplicações celulares antes da colheita e dilui várias moléculas que se acumulam durante o crescimento noturno. Uma análise de sequência de RNA dos transcriptomas das duas linhagens mostra alterações significativas na expressão de genes envolvidos na síntese da família de aminoácidos derivados do aspartato.Aqui, os números abaixo dos nomes dos genes indicam a variação do nível de expressão em um mutante nulo de codY, em comparação com a linhagem selvagem. Após a quantificação por LC-MS dos metabólitos extraídos, as abundâncias entre as duas linhagens foram comparadas. Focando em alguns compostos relacionados à família de aminoácidos do aspartato, as abundâncias de precursores, como o aspartato e a O-acetilhomoserina, estão reduzidas no mutante codY.Por outro lado, produtos finais como a treonina e a isoleucina são aumentados. Aqui, a linha tracejada indica o limite de corte para as alterações na abundância nesta experiência. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como colher metabólitos de Staphylococcus aureus para quantificação por espectrometria de massas com cromatografia líquida.Este protocolo também é adequado, com modificações, para a coleta de metabólitos de outras espécies bacterianas. Como as bactérias respondem a ambientes dinâmicos, é importante realizar rapidamente as etapas de filtração e lavagem para minimizar possíveis alterações fisiológicas induzidas pela amostragem. As alterações também podem ser minimizadas mantendo o frit e o PBS frios durante a coleta da amostra.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Compostos de captura são trifuncional pequenas moléculas para reduzir a complexidade do proteoma por funcionais reversíveis interação molécula de proteína pequena seguido por foto-reticulação e purificação. Aqui usamos um Composto de captura...

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

Fonte: Samuels, D. J., et al. Uma abordagem baseada em cromatografia líquida tandem – espectrometria de massas para análise de metabólitos de Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o uso da cromatografia líquida–espectrometria de massa para identificar e quantificar metabólitos intracelulares de S. aureus. Ele descreve as etapas envolvidas na extração de metabólitos, normalização de peptídeos, cromatografia líquida e análise espectrométrica de massas.

Uma abordagem baseada em Cromatografia Líquida e Espectrometria de Massas para Análise de Metabólitos de S. aureus

O perfil de metabólitos não direcionados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) é uma técnica poderosa para investigar o metabolismo.  Este artigo descreve um fluxo de trabalho típico utilizado para o perfil de metabólitos não direcionados do soro, incluindo organização e preparação de amostras, aquisição de dados, análise de dados, controle de qualidade e identificação de metabólitos.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

Irrelevantes metabolômica fornece uma hipótese gerando instantâneo de um perfil metabólico. Este protocolo irá demonstrar a extracção e análise de metabolitos a partir de células, soro ou tecido. Uma gama de metabolitos são pesquisadas utilizando extracção de fase líquido-líquido, cromatografia líquida de microfluxo UltraPerformance /-espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS), acoplado ao software de análise diferencial.

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

O onipresente segundo mensageiro c-di-GMP controla o crescimento e o comportamento de muitas bactérias. Desenvolvemos uma nova tecnologia baseada em espectrometria de massa composta de captura para identificar e caracterizar bioquimicamente as proteínas de ligação c-di-GMP em praticamente qualquer espécie bacteriana.

Captura de Espectrometria de Massa Compound - uma ferramenta poderosa para identificar novos c-di-GMP efetoras Proteínas

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Este protocolo abrange uma análise detalhada da composição de peptidoglicanos usando cromatografia líquida, espectrometria de massas acoplada com extração avançada de recursos e software de análise bioinformática.

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Aqui apresentamos um protocolo para a identificação rápida de proteínas produzidas por bactérias patogênicas genomicamente sequenciadas usando espectrometria de massa maldi-TOF-TOF e análise proteômica de cima para baixo com software desenvolvido internamente. Íons proteicos metastáveis fragmentom por causa do efeito ácido aspartic e essa especificidade é explorada para identificação de proteínas.

Identificação de Proteínas de Imunidade Antibacteriana em Escherichia coli usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e Análise Proteômica De Cima Para Baixo

Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

Aprenda a extrair e quantificar metabolitos de Staphylococcus aureus usando cromatografia líquida e espectrometria de massas em tandem. Este método revela como a bactéria ajusta seu metabolismo durante infecções.

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de Staphylococcus aureus (Vídeo) | JoVE Journal

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de

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