Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de

O objetivo geral deste método de amostragem é coletar amostras de metabólitos de Staphylococcus aureus para quantificação subsequente por Cromatografia Líquida em Tandem com Espectrometria de Massas. Nosso laboratório tem interesse em estudar a interseção entre metabolismo e patogênese em bactérias relevantes para a saúde humana. Atualmente, estamos utilizando o patógeno oportunista humano Staphylococcus aureus como organismo modelo.

Uma questão fundamental que desejamos responder é como as bactérias ajustam sua fisiologia e patogenicidade quando enfrentam a escassez de nutrientes durante a infecção no hospedeiro. Esta técnica é vantajosa porque fornece um instantâneo da distribuição de metabólitos específicos entre as diversas vias metabólicas em células em crescimento ativo, com mínima perturbação de seu estado fisiológico. Para começar, faça o estriamento dos linhagens de S.aureus de interesse para isolamento em ágar soja triptona a partir do estoque congelado em glicerol.

Incube as células a 37 graus Celsius por 16-24 horas. No dia seguinte, inocule 4 mL de caldo tripticaseína de soja, ou TSB, em tubos de incubação de vidro estéreis com colônias isoladas de cada cepa. Incube os cultivos, inclinados com rotação, a 37 graus Celsius por 16-20 horas.

Utilize um espectrofotômetro para medir a densidade óptica das culturas em 600 nanômetros, abreviado como OD600. Com base nesta medida, dilua as células até um OD600 de 0,05 em 50 mL de meio TSB estéril, em frascos Delong de 250 mL. Incube as culturas a 37 graus Celsius em banho-maria com agitação a 280 rpm.

A cada 30 minutos, realize medições de DO600. À medida que as densidades ópticas aumentam, pode ser necessário diluir as culturas com TSB para mantê-las dentro da faixa linear de absorvância do espectrofotômetro. Enquanto as células estiverem crescendo, prepare recentemente as soluções de tampão de extração utilizando reagentes da maior pureza disponível, conforme descrito no protocolo textual.

Quando as culturas atingirem uma OD600 entre 0,8 e 1,0, repique-as em 50 mL de TSB fresco pré-aquecido para uma OD600 de 0,01 a 0,05 e repita os passos de incubação e medição. Prepare uma camada de gelo seco moído em um recipiente apropriado, como uma travessa de vidro, balde de gelo ou isopor. À medida que as densidades ópticas das culturas se aproximarem do ponto desejado de colheita, adicione 1 mL da solução de quenching a uma placa de Petri não tratada de 35 mm e pré-resfrie em gelo seco por pelo menos 5 minutos.

Para os nossos propósitos, o ponto desejado de colheita é uma densidade óptica de aproximadamente 0,4 a 0,5. No entanto, isso pode variar, dependendo dos objetivos experimentais. Em seguida, coloque um filtro frito de aço inoxidável em uma rolha de borracha e posicione-o sobre um frasco de vácuo conectado a uma linha de vácuo central ou a uma bomba de vácuo.

Aplique o vácuo e coloque uma membrana de éster de celulose mista em cima. Utilize um filtro com o mesmo diâmetro do frit para garantir que todas as células sejam coletadas. É essencial coletar as células e interromper a atividade metabólica o mais rapidamente possível, a fim de obter um instantâneo das abundâncias metabólicas sob uma determinada condição.

Até pequenos atrasos podem afetar a fisiologia em estado estacionário das células. Em uma OD600 entre 0,4 e 0,5, utilize uma pipeta serológica para remover 13 mL de cultura do frasco. Aplique imediatamente a amostra ao filtro.

Após toda a amostra ter sido filtrada, lave imediatamente o filtro com no máximo 5 mL de PBS gelado para remover os metabólitos associados ao meio. Em seguida, desconecte a vácuo e use um par de pinças estéreis para remover o filtro do funil. Inverta o filtro na solução de quench pré-resfriada.

Incube o filtro na solução de quenchagem em gelo seco por pelo menos 20 minutos. Usando as pinças estéreis, inverta o filtro na placa de Petri e utilize uma micropipeta para lavar as células da membrana para dentro da solução de quenchagem. Re-suspenda as células na solução de quenchagem e, em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo estéril resistente ao impacto de 2 mL contendo aproximadamente 100 microlitros de microesferas de sílica de 0,1 mm.

Armazene isso em gelo seco ou a 80 graus Celsius. Para iniciar a extração de metabólitos, primeiro descongele as amostras em gelo úmido. Em seguida, rompa as células em um homogeneizador com quatro pulsos de 30 segundos a 6000 rpm, com períodos de resfriamento de dois minutos em gelo seco entre os ciclos.

Clarifique os lisados por 15 minutos em um tubo de microcentrífuga refrigerado pré-resfriado, na velocidade máxima. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. Usando uma micropipeta, transfira uma pequena porção da amostra para um tubo de microcentrífuga para quantificação do teor residual de peptídeos conforme descrito no protocolo textual.

Armazene o restante da amostra a 80 graus Celsius. Consulte o protocolo textual para análise dos metabólitos por cromatografia líquida e espectrometria de massa. O mutante nulo de CodY foi utilizado para investigar o esgotamento de aminoácidos de cadeia ramificada, já que a proteína CodY ajusta a expressão de dezenas de genes em resposta à queda na concentração desses nutrientes.

A mutação codY tem pouco efeito na taxa de crescimento de células de S.aureus. A queda na densidade óptica no momento de 3 horas indica o passo de re-diluição, que aumenta o número de duplicações celulares antes da colheita e dilui várias moléculas que se acumulam durante o crescimento noturno. Uma análise de sequência de RNA dos transcriptomas das duas linhagens mostra alterações significativas na expressão de genes envolvidos na síntese da família de aminoácidos derivados do aspartato.

Aqui, os números abaixo dos nomes dos genes indicam a variação do nível de expressão em um mutante nulo de codY, em comparação com a linhagem selvagem. Após a quantificação por LC-MS dos metabólitos extraídos, as abundâncias entre as duas linhagens foram comparadas. Focando em alguns compostos relacionados à família de aminoácidos do aspartato, as abundâncias de precursores, como o aspartato e a O-acetilhomoserina, estão reduzidas no mutante codY.

Por outro lado, produtos finais como a treonina e a isoleucina são aumentados. Aqui, a linha tracejada indica o limite de corte para as alterações na abundância nesta experiência. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como colher metabólitos de Staphylococcus aureus para quantificação por espectrometria de massas com cromatografia líquida.

Este protocolo também é adequado, com modificações, para a coleta de metabólitos de outras espécies bacterianas. Como as bactérias respondem a ambientes dinâmicos, é importante realizar rapidamente as etapas de filtração e lavagem para minimizar possíveis alterações fisiológicas induzidas pela amostragem. As alterações também podem ser minimizadas mantendo o frit e o PBS frios durante a coleta da amostra.