Um Ensaio de Blot de Ponto de 5 mC Quantificando o N�el de Metila�o de ADN da Dediferencia�o de Condrocitos In Vitro

O objetivo geral deste experimento é determinar os níveis de 5-metilcitosina durante a desdiferenciação dos condrócitos. Este método mostra que pode ajudar a responder a perguntas-chave no tratamento de defeitos de cartilagem baseados em células, como implante autólogo de condrócitos. A principal vantagem desta técnica é que é um método confiável, simples e rápido para detectar o nível geral de metilação do DNA para avaliar o fenótipo de condrócitos.

A implicação dessa tecnologia é padrão para nossa parcela de implante autólogo de condrócitos porque a metilação do DNA durante a desdiferenciação dos condrócitos é um grande obstáculo para o tratamento de implante autólogo de condrócitos para defeitos de cartilagem. Embora esse método possa fornecer informações sobre os níveis de metilação do DNA na desdiferenciação de condrócitos, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças, como a osteoartrite. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando lemos os protocolos nas referências de um método de dot blot.

Por favor, mostre que a demonstração deste método é crítica, pois os estados de dot blot são difíceis de nomear. O DNA genômico deve ser desnaturado e, em seguida, diluído em série. Em seguida, seja apoiado em uma membrana de nylon carregada positivamente.

Demonstrando os procedimentos estará Zhaofeng Jia, um estudante de pós-graduação de nosso laboratório. Os tecidos da cartilagem articular utilizados neste estudo foram isolados das articulações do joelho de pacientes doadores após trauma. Usando um bisturi estéril, corte a cartilagem em pedaços de um a dois milímetros cúbicos.

Em seguida, adicione um miligrama por mililitro de colagenase II e DMEM à cartilagem picada. E incubar a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas para digerir os condrócitos. No dia seguinte, filtre a suspensão celular resultante através de um filtro de células de 40 micrômetros.

Gire as células. Descarte o sobrenadante, adicione PBS e gire para baixo novamente. Conte as células com um hemocitômetro.

E semente a uma densidade de 20.000 a 30.000 células por centímetro quadrado e DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina estreptomicina. Cultura em incubadora a 37 graus Celsius por 48 horas. Colha células subconfluentes usando 0,25% de tripsina EDTA.

E replate a uma densidade de 6.600 células por centímetro quadrado. Cultive os condrócitos em monocamadas por até seis passagens e avalie nas passagens um, dois, três, quatro e cinco. Para iniciar este procedimento, colete células por tripsinização e centrifugação.

Em seguida, ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão de lise por 10 milhões de células por pipetagem e inversão rápida. Incube por uma hora a 37 graus Celsius. Adicionar a proteinase K a uma concentração de 160 microgramas por mililitro de lisado celular e inverter vigorosamente a mistura.

Incube por seis horas a 55 graus Celsius. Adicione a cada amostra um volume de fenol saturado Tris pH 7,9 ao clorofórmio e ao álcool isoamílico. Agite bem a amostra com a mão por aproximadamente 20 segundos.

Centrifugar as amostras à temperatura ambiente a 13 000 vezes G durante cinco minutos. Remova a fase aquosa superior e transfira para um novo tubo. Para remover o fenol, adicione um volume igual de clorofórmio a cada tubo.

Agite com a mão e gire para baixo. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo. Adicione 0,1 volume de amostra de três molares de acetato de sódio pH oito e dois volumes de etanol a 100%.

Armazene os tubos a 20 graus Celsius negativos durante a noite para precipitar o DNA genômico. No dia seguinte, centrifugue as amostras a quatro graus Celsius por 10 minutos a 16.000 vezes G para granular o DNA genômico. Lave as amostras com etanol 70%.

E centrifugue a quatro graus Celsius por dois minutos a 13.000 vezes G. Remova o sobrenadante com cuidado e seque ao ar o pellet de DNA. Ressuspenda o DNA em 10 milimolares tris pH oito 0,1 milimolar EDTA. Inicie este procedimento desnaturando o DNA isolado em hidróxido de sódio 0,1 molar por 10 minutos a 95 graus Celsius.

Neutralizar o ADN com um acetato de amónio molar em gelo. E então dilua duas vezes com água destilada dupla. A etapa mais crítica nos ensaios de dot blot é a detecção das amostras, e lembre-se de fazê-lo devagar e com cuidado.

Tente minimizar cada matriz manchada para três a quatro milímetros de diâmetro. Usando uma ponta de pipeta de boca estreita, posicione cuidadosamente dois microlitros do DNA genômico diluído em série em uma membrana de náilon carregada positivamente no centro da grade. Seque a membrana a 80 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, bloqueie os locais de ligação de anticorpos não específicos embebendo a membrana em 5% BSA em TBST em uma placa de Petri de 10 centímetros por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave. Após uma hora, lave a membrana três vezes em TBST por cinco minutos de cada vez. Incube a membrana com um anticorpo monoclonal anti-5-metilcitosina de camundongo em TBST a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, lave a membrana três vezes em TBST por cinco minutos de cada vez. Em seguida, incube com um anticorpo secundário, imunoglobulina G de ovelha conjugada com peroxidase de rábano em TBST por uma hora em temperatura ambiente. Depois de lavar a membrana em TBST como antes, adicione o substrato enzimático à membrana e incube por cinco a 10 minutos.

Por fim, visualize o sinal do anticorpo secundário usando um kit de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante. Os condrócitos cultivados em monocamada até a passagem seis apresentaram alterações fenotípicas progressivas, tornando-se altamente comprimidos e achatados com passagens sucessivas. Essa mudança morfológica é típica do processo de desdiferenciação dos condrócitos.

O DNA genômico foi isolado dos condrócitos após a variação do número de passagens e os níveis de metilação do DNA foram avaliados por um ensaio de dot blot específico para 5-metilcitosina. As intensidades dos pontos foram então analisadas por imagem J. Níveis progressivamente elevados de cinco metilcitosina foram observados com subcultura prolongada, sugerindo uma associação entre níveis de metilação geralmente aumentados e desdiferenciação de condrócitos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 24 horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de maximizar a concentração e a pureza do DNA genômico. Seguindo este procedimento, outros métodos, como o perfil de maquinação do DNA genômico, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como condrócitos de desdiferenciação em monocultura. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de implante autólogo de condrócitos avaliarem a maquinação de DNA de condrócitos e determinarem o fenótipo de condrócitos no tratamento de defeitos de cartilagem.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o dot blot de 5-metilcitosina para detectar a alavanca de maquinação degenerada para avaliar o fenótipo de condrócitos. Não se esqueça de que trabalhar com fenol pode ser extremamente perigoso e luvas devem sempre ser usadas durante a realização deste procedimento.