Multi-layer Cortical Ca ²⁺ Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

O objetivo geral deste procedimento é permitir a visualização simultânea da atividade neuronal em várias camadas de neurônios corticais usando indicadores de cálcio em um camundongo que se comporta livremente e entender o funcionamento do circuito neural usando um microscópio de fluorescência miniaturizado montado na cabeça. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência de sistemas, como como é o propagador de informações em várias camadas do córtex. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite visualizar grandes populações de neurônios geneticamente codificados em várias camadas corticais em animais que se comportam livremente, de forma confiável ao longo do tempo.

Para visualizar neurônios geneticamente codificados de várias camadas corticais em um animal que se comporta livremente, os seguintes procedimentos precisam ser realizados, e este protocolo destaca a implantação da sonda de prisma, a instalação da placa de base e a imagem in vivo em um camundongo que se comporta livremente. Para iniciar este procedimento, uma a duas semanas após a injeção do vírus, coloque o animal no aparelho estereotáxico e prepare-se para a cirurgia de implante da sonda prismática, desinfetando-o em etanol a 70% e limpando-o com papel para lentes. Em seguida, abra uma craniotomia redonda, usando uma micro broca com uma broca de 0,5 milímetro.

Certifique-se de que o diâmetro da craniotomia seja apenas maior que o diâmetro do prisma. Em seguida, posicione a craniotomia de forma que, quando o prisma for inserido no córtex, sua borda plana esteja voltada para o local da injeção do vírus e esteja dentro de um raio de 150 a 200 mícrons. Depois disso, remova a dura-máter com uma pinça fina.

Sempre mantenha o tecido úmido com solução salina estéril, uma vez que o tecido cerebral esteja exposto. Isso também manterá a pressão no tecido. Para aliviar a pressão no tecido cerebral durante a inserção da sonda de prisma, crie um trato de inserção prendendo uma faca de dissecção de ponta reta ao braço porta-eletrodo do aparelho estereotáxico.

Monte-o em um ângulo de modo que a placa da faca fique perpendicular à curvatura do crânio e em um plano paralelo à coluna de injeção de vírus. Posicione cuidadosamente a faca acima da craniotomia, ao longo de sua borda interna da mídia e cerca de 200 mícrons laterais ao local da injeção do vírus com a borda cortante voltada para trás. Zere o eixo Z quando a ponta da faca tocar a pia.

Em seguida, abaixe-o gradualmente até uma profundidade que a sonda de prisma será inserida. Em seguida, mova a faca um milímetro posteriormente, para criar um caminho para a borda de ataque do prisma. Retraia lentamente a faca usando o micromanipulador de braço estereotáxico em incrementos de 10 mícrons por segundo e coloque um pedaço de esponja de espuma de gel embebida em solução salina estéril sobre a incisão.

Em seguida, prenda o suporte da lente ao braço manipulador estereotáxico no mesmo ângulo da faca na etapa anterior. Alinhe o prisma de forma que o lado plano do prisma fique acima da incisão e paralelo à coluna de injeção de vírus. Uma vez que o prisma esteja no ângulo correto, abaixe-o gradualmente no cérebro em incrementos de 10 mícrons até um nível Z final de 1,1 milímetro da superfície do cérebro, para esta sonda.

Cubra qualquer tecido exposto ao redor do prisma na craniotomia, com um nível protetor muito fino de adesivo de elastômero, usando uma agulha de calibre 25. Para evitar que a lente se mova dentro da craniotomia, após a cura do adesivo de elastômero, use uma agulha de calibre 25 para aplicar um pouco de adesivo de cianoacrilato para prender o vidro da lente do prisma ao crânio adjacente sobre a camada de adesivo de elastômero. Assim que o adesivo de cianoacrilato estiver curado, desparafuse o suporte da lente e remova cuidadosamente o microscópio.

Em seguida, retraia lentamente o braço manipulador estereotáxico, para deixar a sonda de prisma implantada com segurança. Aplique uma camada de acrílico dentário ou adesivo de cianoacrilato ao redor do implante, para cobrir a superfície exposta do crânio sem tocar no tecido muscular retraído circundante. Cobrir uma grande área do crânio com esta calota craniana ajudará posteriormente na fixação da placa de base.

Em seguida, misture a base da extremidade do catalisador de uma seringa adesiva de silicone e coloque uma gota do elastômero dentro do manguito da sonda do prisma, para cobrir a parte superior da lente da sonda, a fim de evitar que qualquer dano e poeira se depositem. Uma semana a 10 dias após a implantação da sonda de prisma, verifique a expressão do vírus no tecido através da sonda de prisma implantada. Para isso, remova a tampa adesiva de silicone sobre a superfície da lente da sonda de prisma implantada.

Examine a superfície da lente da sonda e limpe quaisquer detritos suavemente, com papel para lentes e etanol a 70%, para garantir que a superfície da imagem esteja limpa. Em seguida, conecte uma placa de base ao microscópio e aperte o parafuso de fixação da placa de base para mantê-lo na posição. Em seguida, prenda o microscópio na garra do microscópio no braço do micromanipulador estereotáxico.

Prenda a pinça a uma haste que pode ser montada no braço do micromanipulador estereotáxico. Em seguida, posicione o microscópio acima da lente da sonda de prisma, usando o braço micromanipulador estereotáxico. Inspecione visualmente a orientação visualizando a lente do prisma do lado e de trás do palco animal.

O eixo óptico da objetiva do microscópio e da sonda de prisma deve estar alinhado. Em seguida, inicie o software de aquisição, selecione o projeto e acenda o LED do microscópio por meio do software. Avalie a qualidade do alinhamento do microscópio concentrando-se na fase superior da lente da sonda de prisma implantada no software de aquisição, movendo o braço manipulador da estereotaxa.

Quando alinhadas corretamente, as bordas da lente da sonda do prisma devem parecer nítidas. Ajuste a distância física do microscópio acima da sonda de prisma implantada, usando o braço manipulador estereotáxico para obter o plano focal desejado dentro do tecido. Em seguida, use acrílico dental ou cianoacrílico para prender permanentemente a placa de base à tampa de acrílico para preencher a lacuna.

É fundamental não aplicar adesivo em nenhuma parte do corpo do microscópio ou no parafuso de fixação ao colar a placa de base na cabeça do animal. Agora, solte o microscópio da pinça e retraia a pinça do microscópio. Se foi usado cianoacrílico ou outro adesivo transparente, cubra-o com esmalte preto ou uma camada de cimento dental preto para evitar vazamento de luz ambiente na tampa da cabeça, o que pode contaminar futuras imagens adquiridas durante os experimentos.

Em seguida, proteja a sonda de prisma implantada com a tampa da placa de base. Neste procedimento, conecte o microscópio à sua caixa de aquisição de dados conectada ao computador e inicie o software de aquisição. Em seguida, remova a tampa da placa de base, girando o parafuso de fixação da placa de base no sentido anti-horário e levantando a tampa da placa de base.

Semeie o microscópio na placa de base do animal. O microscópio deve se encaixar no lugar com a ajuda dos ímãs na placa de base. Em seguida, avance o parafuso de fixação da placa de base até sentir uma ligeira resistência.

Depois disso, selecione as configurações de aquisição a serem usadas para coletar os dados, que incluem a taxa de quadros para capturar dados. Verifique o histograma da imagem ao selecionar as configurações para garantir uma boa relação sinal-ruído. Em seguida, comece a adquirir os dados.

Quando a gravação estiver concluída, solte o parafuso de fixação da placa de base e retire o microscópio da placa de base, puxando suavemente o microscópio para cima. Em seguida, recoloque a tampa da placa de base e aperte suavemente o parafuso de fixação da placa de base. Aqui está uma demonstração de um animal montado com o microscópio, interagindo livremente com os objetos na arena do comportamento.

Durante a imagem de comportamento acordado com o sistema, a atividade dos neurônios corticais somatossensoriais foi registrada quando o camundongo foi exposto a três ambientes diferentes. Campo aberto no primeiro dia, familiarização com objetos nos dias dois a quatro e novo objeto no quinto dia. Após a extração celular usando o software de análise de dados de imagem de cálcio, filtros espaciais correspondentes à localização das células foram sobrepostos na projeção da intensidade média de fluorescência dos dados de registro do microscópio.

Uma linha tracejada branca separa as camadas dois, três e cinco células. Traços de cálcio correspondentes de cinco células de cada uma das camadas mostram o padrão de cultivo das células em dois contextos comportamentais diferentes:Familiarização do objeto e exposição a novos objetos. As células da camada dois e três estavam mais ativas em comparação com as células da camada cinco no dia em que o camundongo foi exposto a um novo objeto.

Aqui estão os demais gráficos das atividades celulares dos jogadores de entidades superficiais, quando o animal estava em campo aberto, familiarização de objetos e exploração de novos objetos. Uma vez dominada, cada técnica pode ser concluída em uma hora, se executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores de neurociência de sistemas explorarem tipos específicos de células em diferentes áreas do cérebro, enquanto alavancam diferentes paradigmas de comportamento em zumbido e outros modelos de neurofisiologia na doença.

A partir deste protocolo, deve-se ter uma boa compreensão de como rotular várias camadas do córtex somatossensorial, implantar uma sonda de prisma e anexar um microscópio miniaturizado montado na cabeça.