Multi-layer Cortical Ca

O objetivo geral deste procedimento é permitir a visualização simultânea da atividade neuronal em múltiplas camadas de neurônios corticais utilizando indicadores de cálcio em um camundongo livre para se movimentar e compreender o funcionamento de circuitos neurais por meio de um microscópio de fluorescência miniaturizado montado na cabeça. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de neurociência de sistemas, como, por exemplo, como a informação é propagada através de múltiplas camadas do córtex. A principal vantagem desta técnica é que ela permite visualizar grandes populações de neurônios geneticamente codificados em múltiplas camadas corticais em animais livres para se comportar, de forma confiável ao longo do tempo.

Para visualizar neurônios geneticamente codificados de múltiplas camadas corticais em um animal livre para se movimentar, os seguintes procedimentos precisam ser realizados, e este protocolo destaca a implantação da sonda prismática, a instalação da base e a imagem in vivo em um camundongo livre para se movimentar. Para iniciar este procedimento, uma a duas semanas após a injeção do vírus, coloque o animal no aparelho estereotáxico e prepare-se para a cirurgia de implante da sonda prismática, desinfetando-a em etanol 70% e limpando-a com papel de lente. Em seguida, abra uma trepanação circular, utilizando uma microfresa com broca de 0,5 milímetro.

Certifique-se de que o diâmetro da craniotomia seja apenas um pouco maior que o diâmetro do prisma. Em seguida, posicione a craniotomia de modo que, quando o prisma for inserido na córtex, sua borda plana fique voltada para o local da injeção do vírus e dentro de um raio de 150 a 200 mícrons. Depois disso, remova a dura com pinça fina.

Mantenha sempre o tecido úmido com solução salina estéril, uma vez que o tecido cerebral estiver exposto. Isso também manterá a pressão sobre o tecido. Para aliviar a pressão no tecido cerebral durante a inserção da sonda prismática, crie um trajeto de inserção fixando uma lâmina de dissecação de borda reta ao braço do porta-eletrodo do aparelho estereotáxico.

Posicione-o em um ângulo tal que a placa da lâmina seja perpendicular à curvatura do crânio e em um plano paralelo à coluna de injeção do vírus. Posicione cuidadosamente a lâmina acima da craniotomia, ao longo de sua borda medial interna e cerca de 200 micrômetros lateral ao local de injeção do vírus, com a borda cortante voltada posteriormente. Zere o eixo Z quando a ponta da lâmina tocar a pia-máter.

Em seguida, abaixe-o gradualmente até uma profundidade na qual a sonda prismática será inserida. Posteriormente, mova o bisturi um milímetro para trás, para criar um caminho para a borda anterior do prisma. Retire lentamente o bisturi utilizando o micromanipulador do braço estereotáxico em incrementos de 10 micrômetros por segundo e coloque um pedaço de esponja de gel espuma embebida em solução salina estéril sobre a incisão.

Em seguida, fixe o suporte da lente ao braço do manipulador estereotáxico no mesmo ângulo da lâmina no passo anterior. Alinhe o prisma de modo que o lado plano do prisma fique acima da incisão e paralelo à coluna de injeção do vírus. Uma vez que o prisma esteja no ângulo correto, abaixe-o gradualmente no cérebro em incrementos de 10 micrômetros até um nível Z final de 1,1 milímetro da superfície do cérebro, para esta sonda.

Cubra qualquer tecido exposto ao redor do prisma na craniotomia com uma camada protetora muito fina de adesivo elastômero, utilizando uma agulha de 25 graus. Para evitar que a lente se mova dentro da craniotomia, após a cura do adesivo elastômero, utilize uma agulha de 25 graus para aplicar um pouco de adesivo de cianoacrilato a fim de fixar o vidro da lente do prisma ao osso adjacente sobre a camada de adesivo elastômero. Uma vez que o adesivo de cianoacrilato esteja curado, desparafuse o suporte da lente e remova cuidadosamente o microscópio.

Em seguida, retire lentamente o braço do manipulador estereotáxico para deixar a sonda de prisma firmemente implantada. Aplique uma camada de acrílico dental ou adesivo de cianoacrilato ao redor do implante, cobrindo a superfície exposta do crânio sem tocar os tecidos musculares retratados ao redor. Cobrir uma grande área do crânio com essa base craniana ajudará posteriormente na fixação da placa base.

Posteriormente, misture o catalisador e a base de um cartucho de adesivo de silicone e coloque uma gota do elastômero dentro da luva do prisma sonda, cobrindo a parte superior da lente da sonda, a fim de evitar danos e acúmulo de poeira. De uma semana a dez dias após a implantação do prisma sonda, verifique a expressão do vírus no tecido através do prisma sonda implantado. Para isso, remova a tampa adesiva de silicone da superfície da lente do prisma sonda implantado.

Examine a superfície da lente da sonda e remova suavemente qualquer resíduo com papel para lentes e etanol 70%, para garantir que a superfície de imagem esteja limpa. Em seguida, fixe uma placa-base ao microscópio e aperte o parafuso de fixação da placa-base para mantê-la na posição. Depois, prenda firmemente o microscópio ao suporte do microscópio no braço do micromanipulador estereotáxico.

Fixe o suporte a uma haste que possa ser montada no braço do micromanipulador estereotáxico. Em seguida, posicione o microscópio acima da lente da sonda de prisma, utilizando o braço do micromanipulador estereotáxico. Inspeccione visualmente a orientação observando a lente de prisma lateralmente e pela parte traseira da plataforma do animal.

O eixo óptico tanto do objetivo do microscópio quanto da sonda de prisma deve ser alinhado. Em seguida, inicie o software de aquisição, selecione o projeto e ligue o LED do microscópio por meio do software. Avalie a qualidade do alinhamento do microscópio focalizando na fase superior da lente da sonda de prisma implantada no software de aquisição, movendo o braço do manipulador do estereotáxico.

Quando corretamente alinhada, as bordas da lente da sonda de prisma devem parecer nítidas. Ajuste a distância física do microscópio acima da sonda de prisma implantada, utilizando o braço manipulador estereotáxico para obter o plano de foco desejado dentro do tecido. Em seguida, utilize acrílico dental ou cianoacrílico para fixar permanentemente a placa de base à tampa de acrílico, preenchendo a lacuna.

É fundamental não aplicar adesivo em nenhuma parte do corpo do microscópio ou no parafuso de fixação ao colar a placa de base na cabeça do animal. Agora, solte o microscópio do grampo e retire o grampo do microscópio. Se foi usado cianoacrilato ou outro adesivo transparente, cubra-o com esmalte preto ou uma camada de cimento dental preto para evitar a entrada de luz ambiente na tampa craniana, o que pode contaminar imagens futuras obtidas durante os experimentos.

Em seguida, proteja a sonda prismática implantada com a tampa da placa-base. Neste procedimento, conecte o microscópio à sua caixa de aquisição de dados ligada ao computador e inicie o software de aquisição. Depois, remova a tampa da placa-base girando o parafuso de fixação da placa-base no sentido anti-horário e levantando a tampa da placa-base.

Semeie o microscópio na placa-base sobre o animal. O microscópio deve encaixar-se no lugar com a ajuda dos ímãs na placa-base. Em seguida, avance o parafuso de fixação da placa-base até sentir uma leve resistência.

Em seguida, selecione as configurações de aquisição a serem usadas para coletar os dados, o que inclui a taxa de quadros para captura dos dados. Verifique o histograma da imagem ao selecionar as configurações para garantir uma boa relação sinal-ruído. Então, inicie a aquisição dos dados.

Quando a gravação estiver concluída, solte o parafuso de fixação da placa de base e desconecte o microscópio da placa de base, puxando suavemente o microscópio para cima. Em seguida, recoloque a tampa da placa de base e aperte levemente o parafuso de fixação da placa de base. Aqui há uma demonstração de um animal montado com o microscópio, interagindo livremente com os objetos na arena de comportamento.

Durante a imagem em comportamento acordado com o sistema, a atividade dos neurônios corticais somatossensoriais foi registrada quando o camundongo foi exposto a três ambientes diferentes. Campo aberto no primeiro dia, familiarização com objeto nos dias dois a quatro e objeto novo no quinto dia. Após a extração das células utilizando o software de análise de dados de imagem de cálcio, filtros espaciais correspondentes às localizações celulares foram sobrepostos à projeção da intensidade média de fluorescência dos dados de gravação do microscópio.

Uma linha tracejada branca separa as camadas duas, três e cinco células. Traçados de cálcio correspondentes de cinco células de cada uma das camadas mostram o padrão de agrupamento das células em dois contextos comportamentais diferentes: familiarização com objeto e exposição a objeto novo. As células das camadas dois e três foram mais ativas em comparação com as células da camada cinco no dia em que o camundongo foi exposto a um objeto novo.

Aqui estão os demais gráficos de atividades celulares dos principais participantes da entidade superficial, quando o animal estava em campo aberto, familiarização com o objeto e exploração de objeto novo. Uma vez dominada, cada técnica pode ser concluída em até uma hora, se realizada corretamente. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores de neurociência de sistemas explorarem tipos celulares específicos em diferentes áreas cerebrais, aproveitando diferentes paradigmas comportamentais em modelos de fisiologia neural normal e em doenças.

A partir deste protocolo, espera-se que o leitor tenha uma boa compreensão de como marcar múltiplas camadas do córtex somatossensorial, implantar uma sonda prismática e fixar um microscópio miniaturizado montado na cabeça.