Método eletrofisiológico para gravações de tensão de célula inteira de

O objetivo geral deste procedimento é obter gravações por fixação de voltagem em células inteiras de um único fotorreceptor para medir correntes induzidas pela luz decorrentes da absorção de um único fóton e das respostas repetidas a luz intensa. Este método pode ajudar a abordar tópicos fundamentais na área de transdução sensorial, como a transdução visual, tanto nos mecanismos físicos quanto iônicos que sustentam a fototransdução e as propriedades dos canais TRP. As vantagens do uso desta técnica incluem o controle completo da voltagem da membrana, razão sinal-ruído extremamente alta e a possibilidade de introduzir indicadores específicos para medições ópticas.

De modo geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade com o tamanho minúsculo do preparo e com a necessidade de realizar a dissecação rapidamente devido à uma vulnerabilidade metabólica temporal. Para este procedimento, criar moscas em uma densidade de cerca de 20 por frasco. No momento do experimento, ter alguns frascos com pupas prestes a fechar e que tenham permanecido em escuridão constante por pelo menos 24 horas.

Duas horas antes de coletar os adultos, remova qualquer adulto que tenha emergido. Sempre manipule as moscas adaptadas ao escuro com tecidos sob iluminação de luz vermelha. Enquanto aguarda as moscas recém-emergidas, prepare a câmara de gravação.

Na parte inferior da câmara, fixe o lamínula usando parafina derretida ou graxa de silicone de alta vácuo para completar o banho. Em seguida, monte o banho na platina do microscópio invertido. Dentro do banho, posicione o tubo do sistema de perfusão, o tubo do sistema de sucção e o fio terra para a configuração de eletrofisiologia.

Antes de iniciar a dissecação, prepare algumas soluções no verso de uma placa de Petri de 60 milímetros. Coloque quatro gotas separadas de ES sem cálcio e uma gota de TS. Agora, usando pinças grossas, segure uma mosca que tenha eclodido recentemente pelas asas ou pelo corpo. Em seguida, com pinças finas, separe a cabeça e transfira rapidamente a cabeça para a primeira gota de ES sem cálcio. Sob um estereomicroscópio, divida a cabeça ao meio ao longo do plano sagital usando um segundo par de pinças finas.

Certifique-se de que ambos os olhos permaneçam intactos. Agora, transfira 1/2 da cabeça para a segunda gota de ES livre de cálcio e a outra metade da cabeça para a terceira gota de ES livre de cálcio. Em seguida, prossiga com a dissecação de um dos dois olhos.

Usando pinças finas, remova o máximo possível do tecido ao redor do olho para garantir que não haja danos à retina. Em seguida, segure firmemente a borda da córnea com pinças finas e retire a retina. O resultado deve ser uma córnea intacta e vazia, separada de uma retina intacta.

As pipetas são mantidas em etanol; portanto, ao usar uma nova pipeta de trituração, sempre enxágue-a primeiro com água. Em seguida, preencha a pipeta enxaguada com um pequeno volume de ES livre de cálcio da quarta gota. Depois, usando aspiração suave pela boca, aspire a retina isolada para dentro da pipeta.

Evite com extrema cautela o aprisionamento de bolhas de ar. Em seguida, deposite a retina na gota de TS. A seguir, repita o isolamento da retina no segundo olho, de modo que ambos fiquem agora na gota de TS. Então, limpe cuidadosamente apenas o ES livre de cálcio do recipiente de Petri e adicione mais seis gotas de TS à superfície do recipiente.

Transfira ambas as retinas para novas gotas de TS. Em seguida, substitua a pipeta de trituração por uma com orifício de pequeno diâmetro. Após enxaguá-la, preencha a pipeta com uma gota de TS. Com esta pipeta, aspire e expulse rapidamente e repetidamente ambas as retinas para separar alguns omátidos das células pigmentares. O TS ficará turvo durante esse processo.

Em seguida, transfira os restos de ambas as retinas para outra gota de TS. Então, aspire com a pipeta a gota turva de TS contendo os ommatídios isolados. Expulse a solução na câmara de banho. Repita este procedimento com pipetas de trituração de diâmetro cada vez menor até que a retina tenha se dissolvido completamente.

Agora, aguarde um minuto. Durante esta pausa, os omátidios isolados se ligarão ao fundo da câmara. Após um minuto, comece a fluir ES contendo cálcio 1,5 milimolar utilizando o sistema de perfusão.

À medida que a câmara é preenchida, certifique-se de que o fio terra e o tubo de sucção estejam submersos. Deixe a solução fluir por 60 a 90 segundos antes de prosseguir. Para começar, utilize a objetiva de 40x para inspecionar cuidadosamente os omatídios na solução.

Observe que os corpos celulares alongados dos fotorreceptores que formam o ommatídio estão destacados de seus axônios, mas permanecem viáveis. Agora, escolha um ommatídio apropriado para o experimento. Selecione aquele que atenda aos seguintes critérios.

A membrana externa deve ser lisa e intacta. O eixo longo deve estar quase em um ângulo reto em relação à aproximação do eletrodo a partir do lado distal. E o olho composto não deve estar cercado por nenhum tecido em excesso.

Uma vez selecionado, centralize o omatídio no campo de visão. Agora, preencha uma pipeta com a solução intracelular apropriada para o experimento. E conecte a pipeta ao suporte do eletrodo.

Então, sopre no tubo da pipeta para criar uma pressão positiva e mantenha a pressão fechando a válvula do tubo. Em seguida, insira a pipeta na câmara de banho e direcione-a próximo à seção distal do ommatídio até que uma pequena reentrância seja observada na membrana, causada pela pressão positiva da pipeta selada. Agora, abra o módulo de teste de membrana no software de registro para aplicar pulsos quadrados contínuos de dois milivolts a uma taxa de 100 hertz.

Em seguida, utilizando os controles do amplificador de patch clamp, ajuste o potencial de junção para zero, de modo a definir a base do pulso quadrado em corrente zero. Abra então a válvula para liberar a pressão na pipeta e aspire suavemente para criar pressão negativa. A pipeta deverá, então, aderir à membrana celular.

Uma vez que isso ocorra, feche a válvula para manter a pressão. Agora, verifique a resistência do eletrodo. Ela deve estar elevada entre 100 e 150 megaohms.

Em seguida, libere a pressão negativa na pipeta abrindo a válvula novamente. A resistência deve agora saltar para entre um e dois gigaohms, o que indica que um selo C foi formado entre a pipeta e a célula. A seguir, utilizando o amplificador de grampo de membrana, compense a corrente capacitiva da pipeta.

Para obter a configuração de célula inteira, rompa a membrana celular utilizando aspiração bucal. Aplique breves e rápidos pulsos de pressão negativa no eletrodo. Ao alcançar a configuração de célula inteira, ocorrerá um aumento súbito na capacitância.

Em seguida, utilizando o amplificador de patch clamp, ajuste o potencial de retenção à voltagem necessária e compense as correntes capacitivas na resistência em série. Agora feche a cortina preta francesa da gaiola de Faraday e inicie o experimento. Após obter a configuração de célula inteira com uma pipeta de patch contendo o corante fluorescente Lucifer yellow, pode-se observar que apenas um dos fotorreceptores que formam o omatídio foi carregado com o corante.

Esse fotorreceptor também será eletricamente isolado de seus vizinhos no omatídio. Omátidios submetidos a grampo de voltagem em célula inteira de moscas do tipo selvagem e de moscas com mutações nos genes InaC ou InaD exibiram saltos quânticos em resposta à luz fraca contínua. Uma terminação lenta dos saltos foi observada em ambos os mutantes em comparação com moscas do tipo selvagem.

Respostas normalizadas a pulsos de luz de 500 milissegundos entregues a 150.000 fótons por segundo, as fisiologias alteradas são claramente ilustradas. Com o preparo, foi até possível medir respostas de salto quântico em clamping de tensão de célula inteira a estímulos luminosos fracos de duração de um milissegundo. Tais respostas a um único fóton foram comparadas em moscas do tipo selvagem, mutantes da arrestina e mutantes de ninaC.

Ambos os mutantes responderam com uma sequência de saltos. Respostas normalizadas a um pulso de luz de 500 milissegundos entregue a 15.000 fótons por segundo. Assim, a terminação lenta da resposta macroscópica é observada nos mutantes arrestina-2 e ninaC.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar gravações de célula inteira em células fotorreceptoras de Drosophila. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora, se executada corretamente. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores compreendessem melhor os canais TRP e a sinalização por lipídeos de inositol, bem como o papel dos neurônios ganglionares retinianos intrinsecamente fotosensíveis encontrados em mamíferos, que estão envolvidos em atividades dependentes da luz não relacionadas à formação de imagens.