Flash-e-Freeze: uma nova técnica para capturar Membrane Dynamics com Electron Microscopy

O objetivo geral deste procedimento é capturar a dinâmica da membrana por microscopia eletrônica após a indução da atividade neuronal usando optogenética e, em seguida, congelando as células em pontos de tempo definidos após a estimulação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em neurociência e biologia celular sobre os mecanismos de reciclagem de vesículas sinápticas e também talvez modelar em uma escala de tempo muito rápida. A principal vantagem dessa técnica é ser capaz de visualizar mudanças morfológicas dentro de uma célula usando microscopia eletrônica em uma escala de tempo de milissegundos.

O procedimento será demonstrado por Shuo Li, um estudante de pós-graduação e Sumana Raychaudhuri, uma pesquisadora associada. Ambos do meu laboratório. Antes de preparar o fixador, rotule duas limas criogênicas de mililitros com um lápis de acordo com o número de amostras.

Em seguida, combine todos os reagentes fixadores e aliquota um mililitro de volumes do fixador em cada frasco. Depois de tampar os tubos, mergulhe imediatamente os fixadores em nitrogênio líquido e armazene os frascos em uma caixa fechada de isopor. Em seguida, encha uma unidade de substituição livre automatizada e um freezer de alta pressão com nitrogênio líquido.

Em seguida, coloque um pequeno recipiente de acetona na câmara de amostra da unidade de substituição livre e espere até que a temperatura da unidade de substituição atinja 90 graus Celsius negativos. Para programar o protocolo de estimulação de luz, clique em editar na janela de estimulação de luz do monitor touchscreen. Outra janela será aberta.

Digite 15 segundos para a fase escura. 100 milissegundos para o período, 10 milissegundos para o pulso e um para o número de períodos para um único estímulo de 10 milissegundos.

Na tela principal, confirme se a caixa de estimulação de luz está marcada e clique em armazenamento de amostras seguido de editar. Na nova janela, use o botão de mais ou menos para selecionar dois para armazenar duas amostras em cada canal e confirmar se o nitrogênio líquido de armazenamento habilitado foi eleito. Agora, sob um microscópio estéreo, coloque uma célula de disco de safira voltada para cima no poço de uma placa preta do meio.

Seguido por um anel espaçador de 100 mícrons. Mergulhe um lado de um disco de safira em branco em solução salina pré-aquecida e coloque o disco sobre o anel espaçador, com o lado salino voltado para baixo. Coloque outro anel espaçador de 100 mícrons.

E um anel espaçador de 400 mícrons em cima do último disco de safira e use papel de filtro para remover qualquer excesso de líquido. Enquanto segura as amostras, certifique-se de não prender bolhas de ar entre os discos de safira. Em seguida, coloque todo o conjunto entre os dois semicilindros transparentes e feche a tampa vermelha superior para iniciar o processo de congelamento.

A tampa vermelha voltará a aparecer automaticamente assim que o processo de congelamento for concluído. Quando todas as amostras tiverem sido congeladas, abra a porta para o dewar de armazenamento e transfira o dewar para a bancada. Transfira a câmara de amostra do dewar de armazenamento para uma bandeja de amostra especializada cheia de nitrogênio líquido.

E destrave o botão para liberar o copo de amostra. Em seguida, use uma pinça com pontas resfriadas por nitrogênio líquido para remover os meios cilindros transparentes do copo de amostra. E transfira cuidadosamente as placas pretas do meio para um pequeno copo contendo nitrogênio líquido.

Tome cuidado para manter as amostras congeladas sob nitrogênio líquido o tempo todo e sempre manuseie as amostras com pinças pré-resfriadas. Pré-resfrie as pinças novamente e transfira rapidamente a primeira placa do meio para a acetona pré-resfriada. Agite suavemente e bata na placa para separar o disco de safira da placa.

Em seguida, coloque uma lima criogênica aberta de fixador em uma câmara de amostra na unidade de substituição. Transfira o disco de safira para o frasco para injetáveis. E tampe imediatamente o frasco.

Quando todas as amostras tiverem sido transferidas, definir os parâmetros apropriados do programa de substituição livre e iniciar o programa. No final do programa de substituição livre, use luvas para transferir os arquivos criogênicos da câmara de amostra para uma capa química e use uma pipeta para adicionar acetona à temperatura ambiente a cada frasco. Substitua a lavagem em cada frasco por acetona fresca quatro a seis vezes durante um período de uma a duas horas.

Em seguida, adicione resina epóxi a 30% recém-preparada a cada frasco para uma incubação de duas a três horas à temperatura ambiente em um agitador orbital a 120 rpm. No final da incubação, substitua a resina epóxi 30% por resina epóxi 70% por uma incubação de três a quatro horas no agitador orbital. Em seguida, use uma pinça para transferir cada disco, com o lado da célula para cima, para a tampa de uma cápsula de incorporação e adicione resina epóxi a 90% aos discos para uma incubação noturna a quatro graus Celsius.

Na manhã seguinte, transfira cada disco de safira para a tampa de uma nova cápsula de incorporação e encha a tampa com resina 100% epóxi recém-preparada. Após a última incubação de resina 100% epóxi, polimerizar as amostras em um forno a 60 graus Celsius por 48 horas. Quando as amostras estiverem polimerizadas, coloque a primeira amostra de cabeça para baixo no microscópio estéreo de modo que o disco de safira fique localizado na parte superior do bloco de resina e use uma lâmina de barbear para remover uma fina camada de resina da parte superior da amostra.

Em seguida, use a lâmina de barbear para cortar uma linha rasa ao longo da borda do disco para separar o disco de safira da resina epóxi. E mergulhe o disco em nitrogênio líquido por cerca de 10 segundos para separar o disco do resto da resina. Transfira a resina para um microscópio de dissecação e cole a amostra no estágio do microscópio.

Usando uma ampliação de quatro a 10X, encontre uma área com células e use uma lâmina de barbear de dois gumes para cortar uma área de dois por dois milímetros ao redor da região de interesse. Em seguida, use supercola para montar as células em um bloco cilíndrico feito de resina epóxi e incube o bloco a 60 graus Celsius por uma hora. Após o corte em um tomo ultramicro, transfira as amostras para um microscópio eletrônico de transmissão para obter imagens com uma ampliação de 930.000X.

Nesta imagem, a fusão da vesícula sináptica por exocitose registrada 15 milissegundos após o início da luz dentro da zona ativa de uma membrana pré-sináptica em um neurônio do hipocampo de camundongo é mostrada. 100 milissegundos após o início da luz, uma fosseta endocitótica adjacente à zona ativa pode ser observada, ilustrando a endocitose ultrarrápida pela célula nervosa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como processar amostras com experimentos de flash e congelamento.

Lembre-se, trabalhar com glutaraldeído, tetróxido de ósmio e nitrogênio líquido pode ser muito perigoso e, portanto, certifique-se de usar roupas de proteção. Uma vez dominado, a parte de congelamento desses procedimentos pode ser feita em algumas horas para 12 amostras, mas o restante dos procedimentos, incluindo imagem e análise de imagem, pode levar dias, semanas ou até meses e, portanto, pode ser um procedimento muito longo. Se você localizar proteínas ou visualizar sua dinâmica, também poderá usar protocolos diferentes para preservar a antigenicidade ou a perolescência de proteínas peroladas e visualizar sua dinâmica usando essas técnicas.