Glicoproteômica da matriz extracelular: um método de análise GLICOP�TIDOS Intact Usando Espectrometria de Massa

O objetivo geral deste protocolo é analisar a composição de proteínas da matriz extracelular, incluindo a identificação de sítios de glicosilação e a caracterização composicional das formas de glicanos em tecidos cardiovasculares. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no processo de fibrose tecidual, como a forma pela qual a glicossilatação da matriz estrutural afeta a fibrose tecidual durante doenças cardiovasculares. A principal vantagem desta técnica é que, ao contrário de protocolos anteriores que analisam alterações gerais de glicosilação, ela permite a caracterização da glicosilação em sítios específicos de proteínas da matriz estrutural, fornecendo uma ferramenta para estudos mecanicistas de acompanhamento mais direcionados.

As demonstrações dos procedimentos serão realizadas pela Dra. Marika Fava e pela Srta. Ferheen Baig do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare todos os tampões de extração conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, use um bisturi para cortar de 20 a 50 miligramas de tecido em três ou quatro pedaços menores, com cerca de dois milímetros de tamanho.

Coloque o tecido picado em um tubo de 1,5 mililitro e adicione 500 microlitros de PBS gelado. Lave o tecido cinco vezes usando 500 microlitros de PBS para cada lavagem, a fim de minimizar a contaminação sanguínea. Transfira as amostras lavadas para um tubo de 1,5 mililitro com tampa de rosca e adicione um volume de tampão de cloreto de sódio 10 vezes o peso do tecido.

Vortexie na velocidade mínima por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, transfira o extrato para novos tubos de centrífuga e centrifugue a 16.000 × g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Lave brevemente os pellets teciduais resultantes com tampão fresco de cloreto de sódio.

Após isso, adicione um volume de tampão SDS 10 vezes o peso do tecido e vortexie em velocidade mínima por 16 horas à temperatura ambiente. Transfira o extrato para novos tubos de centrífuga e centrifugue a 16.000 × g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Lave os pellets resultantes com água bidestilada.

Adicione um volume de tampão de cloreto de guanidina cinco vezes superior ao peso do tecido e vortexe em velocidade máxima por 72 horas à temperatura ambiente. Transfira o extrato resultante para novos tubos e centrifugue a 16.000 × g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a quantificação da proteína, alíquota 10 microgramas para um novo tubo para cada amostra, para avaliação da ocupação do sítio de glicosilação, e 50 microgramas para um tubo separado para análise direta de glicopeptídeos.

Adicione 10 vezes o volume de etanol a cada amostra e incube durante a noite a 20 graus Celsius. No dia seguinte, centrifugue as amostras a 16.000 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet precipitado.

Em seguida, utilize um concentrador a vácuo para secar os pellets por 15 minutos à temperatura ambiente. Adicione 10 microlitros de tampão de desglicosilação preparado a cada amostra. Coloque os tubos de amostra dentro de um tubo cônico de 50 mililitros e incube em um ângulo de 45 graus por duas horas a 25 graus Celsius.

Após isso, aumente a temperatura para 37 graus Celsius e incube por 36 horas com agitação suave. Após a centrifugação a 16.000 vezes G durante um minuto, utilize um concentrador a vácuo à temperatura ambiente por 45 minutos para evaporar a água. Reconstitua as amostras secas com 10 microlitros de água marcada com O-18 contendo 50 unidades por mililitro de PNGase F. Incube por 36 horas a 37 graus Celsius sob agitação constante, em seguida realize a digestão com tripsina em solução para todas as amostras e prossiga com a purificação em C-18.

Para começar, adicione 200 microlitros de metanol a cada poço da placa de centrifugação C-18 para ativar a resina. Centrifugue a 1.000 ×g por um minuto. Em seguida, adicione 200 microlitros de ACN 80% e TFA 0,1% em água a cada poço e centrifugue a 1.000 ×g por um minuto.

Em seguida, adicione 200 microlitros de uma solução contendo 1% ACN e 0,1% TFA em água a cada poço e centrifugue por um minuto a 1.000 × g. Repita a adição dessa solução e a centrifugação duas vezes. Após isso, carregue as amostras nos poços da placa de centrifugação e centrifugue a 1.500 × g por um minuto. Recarregue o fluxo passante e repita a centrifugação.

Em seguida, adicione 200 microlitros de uma solução contendo 1% ACN e 0,1% TFA em água a cada poço e centrifugue a 1500 × g por um minuto. Repita a adição dessa solução e a centrifugação duas vezes. A seguir, adicione 170 microlitros de uma solução contendo 50% ACN e 0,1% TFA em água a cada poço e centrifugue a 1500 × g por um minuto.

Repita essa adição e centrifugação mais uma vez. Utilize um concentrador a vácuo para secar o eluato combinado à temperatura ambiente por duas horas. Armazene as amostras secas a 80 graus Celsius até o momento de uso.

Após isso, realize a análise por espectrometria de massas em tandem com cromatografia líquida nas amostras destinadas à avaliação da ocupação de glicosítios. Para amostras destinadas à análise direta de glicopeptídeos, prossiga primeiro com a marcação padrão TMT zero conforme descrito no protocolo textual. Para iniciar, adicione a cada 10 microlitros da amostra marcada com TMT zero 50 microlitros do tampão de ligação fornecido.

Em seguida, alíquotas de 50 microlitros da suspensão homogênea de resina glico de captura são transferidas para novos tubos de 1,5 mililitro e centrifugadas por um minuto a 2500 ×g. Remova o sobrenadante e adicione 60 microlitros da amostra e da solução de tampão de ligação aos tubos contendo os pellets de resina, utilizando uma pipeta para homogeneizar. Incube à temperatura ambiente por 20 minutos sob agitação a 1200 rpm. Após centrifugação por dois minutos a 2.000 ×g, transfira o sobrenadante para novos tubos.

Após isso, adicione 150 microlitros de tampão de lavagem a cada tubo de resina usando a pipeta para misturar e iniciar o processo de lavagem. Incube em temperatura ambiente por 10 minutos sob agitação a 1200 RPM. Após a centrifugação a 2500 ×g por dois minutos, transfira cada sobrenadante para o tubo de armazenamento de sobrenadante correspondente para completar a lavagem.

Repita este processo de lavagem mais duas vezes. Em seguida, adicione 75 microlitros de tampão de eluição e misture com uma pipeta. Incube à temperatura ambiente por cinco minutos sob agitação a 1200 RPM.

Centrifugue a 2500 ×g por dois minutos e transfira cada sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 75 microlitros de tampão de eluição utilizando uma pipeta para homogeneizar e, em seguida, repita a incubação e a centrifugação das amostras. Transfira cada eluato para o tubo correspondente.

Após centrifugar o eluato combinado por dois minutos a 2500 ×g, transfira cada sobrenadante para um novo tubo para garantir a remoção completa da resina. Em seguida, utilize um concentrador a vácuo para secar o eluato por duas horas à temperatura ambiente. Reconstitua os glicopeptídeos secos em 15 microlitros de 2% ACN e 0,5% TFA em água bidestilada.

Em seguida, realize a análise por espectrometria de massas conforme descrito no protocolo textual. Neste estudo, proteínas da matriz extracelular de tecido cardiovascular são preparadas para análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem da composição da matriz extracelular, bem como para análise indireta e direta de glicopeptídeos. A estratégia principal baseia-se em incubações sequenciais com cloreto de sódio, SDS e cloreto de guanidina, seguidas por análise indireta ou direta de glicopeptídeos.

A eficiência da extração é monitorada em géis de bis-tris acrilamida com coloração por prata para visualização. Dentre os três extratos analisados, a maioria das glicoproteínas da MEC é observada nas alíquotas de cloreto de guanidina. As glicoproteínas da MEC são revestidas por cadeias grandes e repetitivas de glicanos de glicosamina, juntamente com oligossacarídeos N e O-ligados curtos e diversos.

A eficiência da desglicosilação é observada com a adição de enzimas que digerem glicanos glicosamínicos e enzimas que atuam em oligossacarídeos menores ligados a N e O. As glicoproteínas são então identificadas pela presença de asparaginas desamidadas marcadas com oxigênio 18 dentro dos sequons NXT ou NXS. Um espectro de massa tandem HCD representativo para um peptídeo da decorina com uma asparagina desamidada na posição dois 11 é mostrado aqui.

A fragmentação HCD ETD é então utilizada para analisar o extrato de ECM enriquecido em glicoproteína. O espectro de massa em tandem ETD permite a caracterização da composição do glicano. Uma vez dominada, esta técnica deve levar aproximadamente de duas a três semanas.

Essa glicoproteômica nos permite explorar a fisiologia e a patologia da função da fibrose não apenas em relação a alterações na proteômica, mas também quanto à composição dos açúcares modificados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras para um estudo de glicosilação proteica por espectrometria de massas. Embora este método possa fornecer informações sobre doenças cardiovasculares, ele também pode ser aplicado a outras patologias envolvendo fibrose, como doenças respiratórias ou câncer.