Glicoproteômica da matriz extracelular: um método de análise GLICOP�TIDOS Intact Usando Espectrometria de Massa

O objetivo geral deste protocolo é analisar a composição proteica da matriz extracelular, incluindo a identificação de sítios de glicosilação e caracterização composicional das formas de glicano em tecidos cardiovasculares. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no processo de fibrose tecidual, como como uma glicostlação da matriz estrutural afeta a fibrose tecidual durante a doença cardiovascular. A principal vantagem desta técnica é que, ao contrário dos protocolos anteriores que analisam as alterações gerais da glicosilação, ela permite a caracterização da glicosilação em locais específicos de proteínas de uma matriz estrutural, fornecendo uma ferramenta para estudos mecanísticos de acompanhamento mais direcionados.

Demonstrando os procedimentos estarão a Dra. Marika Fava e a Sra. Ferheen Baig do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare todos os buffers de extração conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, use um bisturi para cortar 20 a 50 miligramas de tecido em três ou quatro pedaços menores com cerca de dois milímetros de tamanho.

Coloque o tecido em cubos em um tubo de 1,5 mililitro e adicione 500 microlitros de PBS gelado. Lave o lenço cinco vezes usando 500 microlitros de PBS para cada lavagem para minimizar a contaminação do sangue. Transfira as amostras lavadas para um tubo de 1,5 mililitro com tampa de rosca e adicione um volume de tampão de cloreto de sódio 10 vezes o peso do tecido.

Vórtice em velocidade mínima por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, transferir o extracto para novos tubos de centrifugação e centrifugar a 16 000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Lave brevemente os grânulos de tecido resultantes com tampão de cloreto de sódio fresco.

Depois disso, adicione um volume de tampão SDS 10 vezes o peso do tecido e vore a uma velocidade mínima por 16 horas em temperatura ambiente. Transferir o extracto para novos tubos de centrifugação e centrifugar a 16 000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Lave os pellets resultantes com água bidestilada

Adicione um volume de tampão cloridrato de guanidina cinco vezes o peso do tecido e vórtice na velocidade máxima por 72 horas à temperatura ambiente. Transferir o extracto resultante para novos tubos e centrifugar a 16 000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a quantificação da proteína, alíquota de 10 microgramas para um novo tubo para cada amostra, para a avaliação da ocupação do local de glicosilação, e 50 microgramas para um tubo separado para análise directa dos glicopeptídeos.

Adicione 10 vezes o volume de etanol a cada um e incube durante a noite a 20 graus Celsius. No dia seguinte, centrifugar as amostras a 16 000 vezes G durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o sedimento precipitado.

Em seguida, use um concentrador de vácuo para secar os pellets por 15 minutos em temperatura ambiente. Adicione 10 microlitros de tampão de desglicosilação preparado a cada amostra. Embale os tubos de amostra dentro de um tubo cônico de 50 mililitros e incube em um ângulo de 45 graus por duas horas a 25 graus Celsius.

Depois disso, aumente a temperatura para 37 graus Celsius e incube por 36 horas com agitação suave. Depois de centrifugar a 16.000 vezes G por um minuto, use um concentrador de vácuo à temperatura ambiente por 45 minutos para evaporar a água. Ressuspenda as amostras secas com 10 microlitros de água marcada com O-18 contendo 50 unidades por mililitro PNGase F. Incube por 36 horas a 37 graus Celsius sob agitação constante, em seguida, execute a digestão de tripsina em solução para todas as amostras e prossiga com a limpeza do C-18.

Para começar, adicione 200 microlitros de metanol a cada poço da placa giratória C-18 para ativar a resina. Centrifugar a 1 000 vezes G durante um minuto. Em seguida, adicione 200 microlitros de 80% ACN e 0,1% TFA em água a cada poço e centrifugue a 1.000 vezes G por um minuto.

Em seguida, adicione 200 microlitros de uma solução contendo 1% ACN e 0,1% TFA em água a cada poço e centrifugue por um minuto a 1.000 vezes G. Repita a adição desta solução e centrifugação duas vezes. Depois disso, carregue as amostras nos poços da placa giratória e centrifugue a 1500 vezes G por um minuto. Recarregue o fluxo e repita a centrifugação.

Em seguida, adicione 200 microlitros de uma solução contendo 1% de ACN e 0,1% de TFA em água a cada poço e centrifugue a 1500 vezes G por um minuto. Repetir a adição desta solução e centrifugar duas vezes. Em seguida, adicione 170 microlitros de uma solução contendo 50% de ACN e 0,1% de TFA em água em cada poço e centrifugue a 1500 vezes G por um minuto.

Repita esta adição e centrifugação mais uma vez. Use um concentrador de vácuo para secar o eluidor combinado em temperatura ambiente por duas horas. Armazene as amostras secas a 80 graus Celsius até que estejam prontas para uso.

Em seguida, realizar análise de espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida nas amostras destinadas à avaliação da ocupação do glicosita. Para amostras destinadas à análise direta de glicopeptídeos, prossiga primeiro com a rotulagem zero TMT padrão, conforme descrito no protocolo de texto. Para começar, adicione a cada 10 microlitros de amostra marcada com TMT zero 50 microlitros de tampão de ligação fornecido.

Em seguida, alíquota de 50 microlitros de suspensão homogênea de resina de captura de glico em novos tubos de 1,5 mililitro e centrifugue por um minuto a 2500 vezes G.Remova o sobrenadante e adicione 60 microlitros da amostra e solução tampão de ligação aos tubos contendo os grânulos de resina usando uma pipeta para misturar. Incube em temperatura ambiente por 20 minutos enquanto agita a 1200 RPM. Depois de centrifugar durante dois minutos a 2 000 vezes, G transfere o sobrenadante para novos tubos.

Depois disso, adicione 150 microlitros de tampão de lavagem a cada tubo de resina usando a pipeta para misturar para iniciar o processo de lavagem. Incube em temperatura ambiente por 10 minutos enquanto agita a 1200 RPM. Depois de centrifugar a 2500 vezes G durante dois minutos, transferir cada sobrenadante para o tubo de armazenamento do sobrenadante correspondente para completar a lavagem.

Repita este processo de lavagem mais duas vezes. Em seguida, adicione 75 microlitros de tampão de eluição e misture com uma pipeta. Incube em temperatura ambiente por cinco minutos enquanto agita a 1200 RPM.

Centrifugar a 2500 vezes G durante dois minutos e transferir cada sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros. Adicione 75 microlitros de tampão de eluição usando uma pipeta para misturar e repita a incubação e centrifugação das amostras. Transfira cada eluição para o tubo correspondente.

Depois de centrifugar o eluidor combinado durante dois minutos a 2500 vezes G, transferir cada sobrenadante para um novo tubo para assegurar a remoção completa da resina. Depois disso, use um concentrador de vácuo para secar o eluidor por duas horas em temperatura ambiente. Ressuspenda os glicopeptídeos secos em 15 microlitros de 2% ACN e 05% TFA em água bidestilada

Em seguida, execute a análise de espectrometria de massa conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, as proteínas ECM do tecido cardiovascular são preparadas para análise de espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida da composição da ECM, bem como análise indireta e direta de glicopeptídeos. A estratégia principal é baseada em incubações sequenciais com cloreto de sódio, SDS e cloridrato de guanadina seguidas de análise indireta ou direta de glicopeptídeos.

A eficiência da extração é monitorada em géis de acrilamida bis-tris com coloração de prata para visualização. Dos três extratos executados, a maioria das glicoproteínas ECM são vistas nas alíquotas de cloridrato de guanadina. As glicoproteínas ECM são decoradas com cadeias de glicanos de glicosamina grandes e repetitivas, juntamente com oligossacarídeos ligados a N e O curtos e diversos.

A eficiência da desglicosilação é observada com a adição de enzimas que digerem glicanos glicosamínicos e enzimas que têm como alvo oligossacarídeos menores ligados a N e O. As glicoproteínas são então identificadas pela presença de asparaginas desaminadas marcadas com oxigênio 18 nas sequónias NXT ou NXS. Um espectro de massa em tandem HCD representativo para um peptídeo de decorina com uma asparagina desaminada na posição dois 11 é mostrado aqui.

A fragmentação de HCD ETD é então usada para analisar o extrato de ECM enriquecido com glicoproteína. O espectro de massa em tandem ETD permite a caracterização da composição do glicano. Uma vez dominada, essa técnica deve levar aproximadamente duas a três semanas.

Esta glicoproteômica nos permite explorar a função fisiológica e patológica da fibrose não apenas nas mudanças na proteômica, mas também na composição dos açúcares do pensamento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como preparar amostras para um estudo em glicosilação de proteínas por espectrometria de massa. Embora este método possa fornecer informações sobre doenças cardiovasculares, também pode ser aplicado a outras patologias na fibrose de volume, como doenças respiratórias ou câncer.