Name: Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar células intestinais mistas de murinos para estudar a secreção de peptídeos intestinais e imagens de células vivas de células enteroendócrinas. Este método permite investigar vias de sinalização em neurociência e biologia celular.

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GLP-1 imuno-ensaios foram realizados pelo laboratório central Ensaio bioquímica do Hospital de Addenbrooke. Este trabalho tem, ao longo dos anos, foi apoiado pelo Wellcome Trust (atualmente subsídios ativos 106262 / Z / 14 / Z e 106263 / Z / 14 / Z) e do Medical Research Council (MRC) (subvenções MRC_MC_UU_12012 / 3 e MRC_MC_UU_12012 / 5).

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Cambridge Bem-Estar Animal e Ethical Review Body e conformados com os Animais (Scientific Procedures) Act 1986 regulamentos Alteração (SI 2012/3039). 1. Preparação antecipadamente <ol><li> Colocar uma alíquota da matriz da membrana basal (BMM) (~ 200 mL) em gelo para descongelar. NOTA: O BMM solidifica à temperatura ambiente (RT). </li><li> de pré-aquecer a 50 ml de Dulbecco estéril alta-glucose Modified Eagle Médium (DMEM) (sem adições) e ~ 40 mL de meio de cultura estéril (DMEM-elevado teor de glucose suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 100U / mL de penicilina e 0,1 mg / mL de estreptomicina (P / S), e 2 mM de L-glutamina) em tubos de centrífuga de 50 ml num banho de água a 37 ° C. </li><li> cálcio Pré-frio e-magnésio contendo fosfato-solução salina tamponada (PBS). </li><li> Pesam-se 15 mg de colagenase (XI em bruto), adicionar a um tubo de centrífuga de 50 mL e mantê-lo em gelo. <ol><li&gt; ATENÇÃO: A colagenase é prejudicial. Ela provoca irritação da pele (H315) e irritação ocular grave (H319). Pode provocar sintomas de alergia ou de asma ou dificuldades respiratórias (H334). Isso pode causar irritação das vias respiratórias (H335). Use equipamento de protecção individual adequado, evitar a formação de poeira e evitar respirar o pó. Assegurar uma ventilação adequada. </li></ol></li></ol> Coleção 2. Tissue <ol><li> Adiciona-se 20 mL de meio L-15 ~ para um tubo de centrífuga de 50 mL e colocá-lo em gelo. </li><li> Eutanásia um rato por deslocamento cervical, ou outro método de programação aprovado 1. NOTA: Intestinal tecido é tipicamente obtido a partir de ratos em um fundo C57BL6. No entanto, outras origens genéticas também têm sido utilizados, por exemplo 129 / SvEv 15. Experiências de imagiologia requerem a utilização de ratinhos repórter fluorescentes, por exemplo GLU-Vénus 1. O tecido é obtido a partir de ratinhos adultos (2-6 meses) de ambos os sexos. Os ratinhos são alojados em individuagaiolas com acesso ad libitum à água e ração normal lly ventilado. No entanto, experimentos para testar o efeito de uma dieta rica em gordura, por exemplo, em função das células enteroendócrinas 16 pode ser executada se apoiado por uma licença de projeto. </li><li> Dissecar e suavemente remover intestino do rato (a partir do piloro até ao início do recto), utilizando fórceps e tesouras de dissecação. Armazená-lo em meio L-15 no gelo até estar pronto para usar. </li></ol> 3. Preparação de tecidos <ol><li> Colocar o tecido intestinal de uma placa de petri de 10 centímetros contendo PBS suficiente para cobrir o tecido. Tomar 10 cm de tecido desejado (por exemplo, intestino delgado superior, parte superior, 10 cm distais ao piloro). </li><li> Expulsar o conteúdo intestinal, utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico e refrigerados PBS. <ol><li> Usando fórceps, delicadamente aperto uma das extremidades do segmento intestinal e colocar a ponta de uma pipeta de Pasteur para ele. Lave com conteúdo refrigerado PBS. Repetir de ambas as extremidades até o majorança dos conteúdos tem sido expelidos. Transferir para um prato de Petri limpo contendo frescos refrigerados PBS. </li></ol></li><li> Usando fórceps, remover o tecido adiposo e mesentério, tendo o cuidado de não retirar a camada muscular, ao mesmo tempo. </li><li> Descasque a camada muscular off &quot;como um meia&quot; sob um microscópio de dissecação utilizando dois conjuntos de pinça fina. NOTA: Este passo não é essencial, mas é altamente recomendado. Existem formas alternativas de remoção da camada muscular ao descrito aqui. Por exemplo, o intestino pode ser cortado longitudinalmente em primeiro lugar, antes da remoção da camada muscular. <ol><li> Encontrar um ponto de partida na extremidade mais proximal do tecido onde existe uma aba visível do músculo. Suavemente afastar uma pequena quantidade da camada de músculo a toda a volta do intestino. NOTA: Para evitar rasgar da camada muscular ou o epitélio intestinal, diminuir a força de tensão de aperto por uma maior área de superfície, em vez de utilizar a tips das pinça fina. </li><li> Prender o intestino e o máximo da aba músculo quanto possível, suavemente separar e começar descascando a camada muscular de todo o intestino. Para evitar rasgar tanto a camada muscular e epitélio, manter reajustar a posição das pinças para mantê-los juntos fechar. Desta maneira, remover a camada de músculo de todo o comprimento do segmento intestinal e descarte. </li></ol></li><li> Cortar o intestino aberta longitudinalmente e lavar por agitação numa placa de Petri limpa com PBS fresco arrefecido. Repetir se necessário, para remover qualquer remanescente quimo ou muco. </li><li> Tecido tritura com uma lâmina de bisturi cirúrgico para alcançar quadrados de ~ 1-2 mm 2 e adicioná-los para ~ 20 mL refrigerados PBS num tubo de centrífuga de 50 ml usando uma pipeta de Pasteur. Para evitar pedaços de tecido que colam à pipeta, cortou a ponta e molhar a pipeta por trituração com PBS. </li><li> Agitar suavemente o tubo de lavagem ainda mais os pedaços de tecido. Permitir que o tecido para se estabelecer e derramar ou pipette fora a maioria da PBS e repita com PBS fresco até que a PBS parece clara. </li></ol> 4. Preparação de BBM-revestidos / placa pratos e digestão Médio NOTA: As etapas a seguir devem ser realizadas numa capa de cultura de tecido (com os passos de incubação de 37 ° C Banho de água). <ol><li> Prepara-se uma solução de BMM 2% em DMEM gelado (sem adições). Enquanto trabalhava, manter a solução em gelo. Para obter uma solução a 2%, adicionar 140 mL de BMM descongeladas a 7 ml de DMEM (suficiente para preparar uma única placa de 24 poços). <ol><li> Adicionar 250 uL de 2% de solução de BMM por poço (placa de 24 pos) ou por placa de imagiologia com fundo de vidro. </li><li> Incubar placas revestidas / pratos durante pelo menos 30 minutos num incubador a 37 ° C para permitir a polimerização adequada do BMM. </li></ol></li><li> Adicionar DMEM a 50 mL de pré-aquecido (sem adições) a 15 mg de colagenase (a partir de etapas 1.2 e 1.4) para formar uma solução de 0,3 mg / mL e inverter a dissolver-se. <ol><li> Emce completamente dissolvido, utilizando uma seringa de 20 mL, filtrar a solução de colagenase através de um filtro estéril de 0,2 um para um novo tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Rotular este como o meio de digestão. </li></ol></li></ol> Digestão 5. Tecido <ol><li> Remover os pedaços de tecido a partir do PBS utilizando uma pipeta serológica 10 e adicionar a um tubo esterilizado de 50 ml de centrífuga contendo DMEM estéril gelada (sem adições), redemoinho e então remover DMEM. NOTA: Para evitar tecido adere ao pipeta serológica, molhá-lo por meio de trituração com DMEM antes do contacto com o tecido. </li><li> &#39;Digest&#39; 1 e 2: A remoção de detritos celulares e as células individuais <ol><li> Adicionar 7 meio de digestão mL para os pedaços de tecido e dar o tubo de um redemoinho. </li><li> Incubar durante 5 min num banho de água a 37 ° C. </li><li> Agitar suavemente (não rodam) do tubo durante ~ 3 s. </li><li> Permitir que o tecido para se estabelecer e desfazer o meio de digestão, reservando umpequeno volume para olhar sob o microscópio. NOTA: Especialmente quando se inicia, é altamente recomendável para inspeccionar um pequeno volume de cada &#39;digerir&#39; (~ 30 mL) sob o microscópio para medir o progresso do processo de digestão. Se muitas criptas são observadas nesta fase, o tremor pode ser muito vigorosa. Para imagens representativas de que estágios diferentes &#39;digerir&#39; normalmente se parecem, consulte a Figura 1. </li><li> Repetir Passos 5.2.-5.2.4 (com meio fresco a digestão). </li></ol></li><li> 3 a 5 &#39;digere&#39;: colecção de fragmentos de criptas <ol><li> Adicionar 7 meio de digestão mL para o tecido. </li><li> Incubar durante 10 min a 37 ° C. <ol><li> Durante a incubação, agitar a cada 5 min durante 10-12 s. NOTA: A agitação é mais vigoroso do que a agitação durante &#39;digere&#39; 1 e 2. </li></ol></li><li> Permitir que o tecido não digerido para assentar e recolher o meio de digestão num tubo de centrífuga de 15 mL. E setecido é recolhido acidentalmente juntamente com o meio, permitir que a resolver, removê-lo usando uma pipeta serológica de 10 mL e transferi-lo de volta para o tubo de centrífuga de 50 mL contendo o tecido não digerido. </li><li> Centrífuga recolhido médio / sobrenadante à temperatura ambiente durante 3 min a 100 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio de cultura de 5 mL de pré-aquecido por trituração suave e posto de lado. </li><li> Inspeccionar um pequeno volume da suspensão de células sob o microscópio (ver Nota do Passo 5.2.4). NOTA: Idealmente, os fragmentos da cripta começam a aparecer em &#39;digerir&#39; 3, juntamente com os resíduos celulares e as células individuais. &#39;&#39; Os digeridos 4 e 5 contêm um número significativamente maior de fragmentos cripta com detritos celular reduzida (Figura 1). Ajustar agitação intensidade como necessário, ou seja, se o tecido não está digerindo e fragmentos das criptas não estão a aparecer, agitação mais vigorosa. </li><li> Repita os passos 5.3.1-5.3.6 até 5 &#39;digere&#39; ter sidoconcluída ou até que a maioria do tecido foi digerido (a 6 th resumo pode ser necessária). </li><li> Uma vez que todos os sobrenadantes de &#39;digere&#39; 3-5 (ou 3-6) foram colhidos, centrifugar os sobrenadantes digerir a TA durante 3 min a 100 x g. </li><li> Para as experiências de secreção, combinam-se os sobrenadantes a partir de &#39;digere&#39; 3-5 (ou 3-6) antes da centrifugação. NOTA: Menos tecido é necessária para experiências de imagiologia, por conseguinte, escolher o sobrenadante digesto que é o mais limpo (ausência de fragmentos de células e as células individuais) com o maior número de fragmentos da cripta. Este é tipicamente &#39;digerir&#39; 4 ou 5. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento por trituração até que não há aglomerados são visíveis. Re-suspender o sedimento em meio de cultura pré-aquecido suplementado com 10? M Y-27632 dicloridrato (para evitar a anoikis 17). Use 5 ml para experiências de secreção e 2 mL de meio de cultura para experiências de imagiologia. </li><li> Filtrosuspensão de células através de um filtro de 100? m (para remover qualquer tecido não digerido). Executar um adicional de 2 mL de meio de cultura pré-aquecido através do filtro para lavar (volume total: 7 mL e 4 mL, para a secreção e de imagem, respectivamente). Nota: A filtragem não é essencial, no entanto, fragmentos de tecido maiores não tendem a aderir à placa / pratos. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> Figura 1: Imagens representativas de &#39;&#39; digestões de método de cultura primária do intestino delgado. (A) Material típico a partir de 1 &#39;e 2&#39; digere as células contendo principalmente individuais e os detritos celulares. (B) Um exemplo de produtos de &#39;digerir&#39; 3. As setas pretas indicam fragmentos da cripta que aparecem no material de digerir. (C) típica de &#39;digerir&#39; 4 ou 5. O painel (D) representa reunidas digerir o material de&#39;digere&#39; 3-5 passado através de um filtro de 100? m para remover os fragmentos de tecido maiores indesejáveis observados em (C). Todas as imagens foram tiradas com um microscópio invertido digital com um objetivo 20X. Barras de escala = 100 pm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 6. Galvanização culturas intestinais (enriquecidas em células da cripta) <ol><li> Remover o excesso de solução de BMM da placa ou pratos, e adicionar 250 uL de meio de cultura pré-aquecido por secreção bem. NOTA: Imagens pratos são deixadas sem meio de assim proceder para o próximo passo rapidamente para evitar que o prato de secar. </li><li> Placa 250 pL de suspensão de células por poço (placa de 24 pos) ou por prato de vidro de fundo. <ol><li> Placa gota a gota, em um movimento lento &#39;zig-zag&#39; do outro lado do poço. Permitir fragmentos cripta se contentar com ~ 5 min antes de mover a placa para the incubadora. NOTA: Este deve incentivar uma distribuição uniforme das criptas / células dentro do poço. </li></ol></li><li> Incubar a placa ou placas durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. NOTA: Uma monocamada &#39;irregular&#39; deve ter se formado. Para obter uma imagem representativa de culturas seguintes três lavagens, ver Figura 2A. </li><li> pratos de imagem &#39;inundação&#39; com 2 mL de meio de cultura pré-aquecido por prato. NOTA: Estes pratos serão adequados para imagiologia por até ~ 72 h após plaqueamento. culturas do cólon geralmente duram mais tempo, até 7 dias. As células que não aderiram podem ser removidos por um passo de lavagem. As culturas primárias está agora pronto para ser usado para experimentos. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve o isolamento e cultura de células do intestino delgado de murídeo mistos para permitir o estudo da secreção de péptido intestino e imagens de células isoladas de células do enteroendócrinas marcados. Para aumentar a probabilidade dos pequenos culturas intestinais ser bem sucedido, é importante que o protocolo é levada a cabo tão rapidamente quanto possível (de preferência, dentro de 3 h de colheita do tecido) e de que o tecido é mantido em meio arrefecido com gelo ou tampão antes para o processo de digestão, para limitar a morte celular. Enquanto não é essencial, especialmente para as culturas do cólon, remoção da camada muscular do intestino delgado é fortemente encorajada. A pequena protocolo de cultura intestinal foi padronizado, tanto quanto possível. No entanto, é importante notar que nenhum processo de digestão é idêntico. Existem muitos passos durante este protocolo em que a variabilidade pode ser introduzido numa base dia-a-dia, por exemplo o grau de remoção do músculo, o tamanho de tele &#39;picada&#39; pedaços de tecido, a força de agitação, a potência de um determinado lote de colagenase etc. É, por conseguinte, da maior importância para inspeccionar alíquotas de cada um dos diferentes &#39;digere&#39; sob o microscópio para avaliar o progresso do processo de digestão e adaptar a agitação e o número de conformidade &#39;digere&#39;. Recomenda-se a agitar mais suavemente para começar e, se fragmentos cripta não são óbvias a partir de &#39;digerir&#39; 3 em diante, para começar a tremer de forma mais vigorosa. Pela nossa experiência, as células enteroendócrinas não proliferar em cultura e geralmente são perdidos a partir de pequenas culturas intestinais dentro de 4 dias. Não obstante, isto permite tempo suficiente para efectuar experiências de secreção de péptido intestino (tipicamente levada a cabo ao longo de 2 h, 18-24 h ap plaqueamento) para testar a estímulos fisiológicos e / ou agentes farmacológicos. As experiências que requerem uma incubação durante a noite anterior à experiência secreção são também, por exemplo viávelno caso de pré-tratamento com toxina da tosse convulsa 15. A técnica de cultura primária aqui apresentada é um método bem estabelecido, como evidenciado pelo volume de produção de pesquisa tem produzido ao longo dos anos. O modelo de cultura primária foi usado para estudar a secreção de uma variedade de péptidos do intestino, incluindo GLP-1 1, GIP 18 e PYY 19, em resposta a nutrientes diversificada e não nutrientes 14, 20 estímulos e inibidores. Além disso, a mesma técnica tem sido aplicada com sucesso para a cultura de células intestinais humanas 21. Muitas vezes, uma combinação do método de cultura de células primária, juntamente com um modelo experimental adicional por exemplo. ex vivo ou in vivo pode proporcionar a visão mais 6. Notavelmente e em contraste com outros métodos, esta técnica tem importantes aplicações para além da medição da libertação do péptido intestinal. Nós demonstramos que as pequenas culturas intestinais primárias derivadas de ratinhos transgénicos repórter são poderosos instrumentos para a interrogação de vias de sinalização intracelular acoplados a gut secreção de péptidos, usando, por exemplo, o Ca2 + e sensores de cAMP, GCaMP3 11, 13 e Epac2camps 14, respectivamente, bem como técnicas electrofisiológicas 12. Tal como acontece com todos os modelos in vitro, as culturas primárias intestinais têm certas limitações inerentes, incluindo a perda de polaridade das células epiteliais em cultura, bem como a perda de fornecimento de sangue e inervação. É difícil estimar os potenciais impactos destas condições artificiais em função das células enteroendócrinas. No entanto, os dados obtidos a partir de culturas primárias têm sido frequentemente traduzíveis na in vivo Setting (por exemplo, efeitos de ácidos gordos de cadeia curta sobre a secreção de GLP-1 15). As culturas intestinais primárias são uma técnica versátil com muitas aplicações potenciais. Eles já forneceram importantes insights mecanicista para a regulação da secreção de péptidos intestino.

O objectivo global do presente método é isolar e células intestinais murino cultura mista para permitir o estudo da secreção de péptido intestino e imagem de células vivas de células enteroendócrinas. Uma versão anterior do presente processo foi originalmente publicado em 2008 por Reimann et al. 1 e formou uma vez que a base de mais de 20 publicações do nosso grupo. Para este manuscrito, optamos por concentrar em pequenas culturas intestinais como eles são mais difíceis de estabelecer que as culturas do cólon. Células Enteroendócrinas secretar uma variedade de péptidos do intestino, incluindo péptido tipo glucagon 1 (GLP-1), péptido insulinotrópico (GIP) dependente da glicose, colecistoquinina (CCK) e péptido YY (PYY) 2. Estes péptidos intestinais têm funções fisiológicas importantes em orquestrar respostas pós-prandial, tais como o retardamento do trânsito intestinal, a potenciação da libertação de insulina estimulada por glicose e a indução de saciedade. GLP-1 um miméticosnd fármacos que inibem a sua degradação são actualmente licenciado para o tratamento da diabetes tipo 2 e não é contínua avaliação do potencial terapêutico da estimulação da secreção endógena deste péptido 3. Uma melhor compreensão da fisiologia enteroendrina e os mecanismos pelos quais a secreção é ou estimuladas ou inibidas é, portanto, de importância crítica. Gut a secreção do péptido pode ser estudado usando uma variedade de ensaios in vitro e modelos experimentais ex vivo, cada um deles com vantagens e desvantagens (para uma recente revisão abrangente cobrindo também o uso de modelos in vivo ver Svendsen et al. 4). Técnicas ex vivo, tal como o intestino e cinco câmaras de Ussing 6 perfundidos isolados estão actualmente a ser utilizados para explorar a secreção do péptido intestino em resposta a várias substâncias. A principal vantagem destes métodos, conformeem comparação com culturas primárias, é que o ambiente imediato das células enteroendócrinas permanece praticamente intacta e importante, a polaridade das células é preservada. Portanto, é possível obter informações sobre o qual a superfície de células de um secretagogo está agindo em 6. No entanto, estes são tipicamente técnicas de baixo rendimento e a qualidade dos dados derivados a partir deles baseia-se fortemente na integridade e viabilidade do tecido intestinal, o que, inevitavelmente, diminuir ao longo do tempo. Organóides intestinais são agora cada vez mais a ser utilizados como modelos in vitro para o estudo da função celular enteroendrina e desenvolvimento 7. Organóides, que podem ser derivados tanto de murino e o tecido humano, tem a vantagem de formar estruturas 3D &#39;cripta-like&#39;, que mantêm a polaridade celular em cultura. No entanto, as células enteroendócrinas organï¿½de-derivado tem ainda de ser completamente caracterizados e a sua semelhança com L cel nativals permanece em grande parte desconhecido. As culturas primárias tem a vantagem de ser mais um passo para a definição fisiológica, como células enteroendócrinas não são mantidas e diferenciadas em condições artificiais, por períodos prolongados de tempo. Um método de cultura principal alternativa que tem sido utilizado para a avaliação da secreção de péptido intestino é o isolamento de células de intestino de rato fetal (FRICS) 8. No entanto, a cultura de tecido intestinal adulto reuniu-se com menos sucesso e algumas diferenças foram observadas na resposta de FRICS comparada adultos células intestinais de murino (por exemplo, glicose 8). Linhas celulares Enteroendócrinas semelhante (por exemplo, GLUTag, STC-1 e NCI-H716) foram tradicionalmente utilizados para distinguir directa vs. efeitos indirectos sobre células enteroendócrinas e para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes acoplamento estímulo para a secreção; ver Kuhre et al </em&gt;. 9 para a produção de péptidos e a secreção por linhas celulares imortalizadas &#39;semelhantes a células L&#39;. Esta foi necessário como células enteroendócrinas, espalhados ao longo do trato gastrointestinal, constituem pouco menos de 1% das células epiteliais do intestino 10 e células classificadas, em nossas mãos, não sobrevivem na cultura 1. As linhas celulares que permanecem ferramentas úteis devido ao facto de que eles são uma população de células, em grande parte homogénea que é propício para manipulações genéticas, tais como o gene silenciador. Por conseguinte, é fácil de investigar o papel das proteínas que não podem ser segmentados farmacologicamente, quando os ratinhos transgénicos não estão disponíveis. No entanto, as linhas celulares não são sempre modelos válidos de células primárias. Embora existam muitas semelhanças, os resultados de culturas primárias têm destacado na ocasião diferenças nas vias de sinalização ativadas por certos nutrientes em células L primários em comparação com células GLUTag, por exemplo (por exemplo. Peptonas &lt;classe sup = &quot;xref&quot;&gt; 11). Fundamentalmente, em combinação com ratinhos transgénicos repórter fluorescentes, o modelo de cultura primária permite o exame detalhado das células individuais enteroendócrinas primária a nível intracelular. Células L fluorescentemente marcadas dentro de culturas primárias têm sido utilizados pelo nosso grupo para remendo de aperto 1, 12 estudos, e de uma única célula de cálcio 11, 13 e adenosina cíclico imagiologia monofosfato-FRET 14 estudos, que produziram avanços significativos no campo da enteroendrina fisiologia. O seguinte protocolo foi optimizado para a realização de experiências de secreção, utilizando uma placa de 24 poços ou para a preparação de até 16 pratos de imagem, a partir de uma secção de 10 cm do intestino delgado a partir de um único rato adulto. O protocolo pode ser facilmente modificado para o estudo de células do cólon, aumentando a tempos de digestão e coconcentração llagenase.

<table><tbody><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>Para experimentos de secreção</td></tr><tr><td>Bombesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4272</td><td>Controle positivo (experimento de imagem de cálcio)</td></tr> <tr><td>Tubos de centrífuga, 15 mL, estéril</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td>Para preparação/digestão de tecidos</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, 50 mL, estéril</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430828</td><td>Para preparação / digestão de tecidos</td></tr><tr><td>Collagenase XI (Crude)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>Para compor o meio de digestão</td></tr><tr><td>Espelho dicróico</td><td>Cairn</td> <td>Research-Para</td> <td>experimentos de imagem</td></tr><tr><td>DMEM Glicose alta (4500 mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D6546</td><td>Para dissolver o matrigel (manter em 4 &deg; C). Para fazer o meio de digestão, pré-aqueça a 37 °C.</td></tr><tr><td>Filtro de Emissão (Largura de Banda 510-560 nm)</td><td>Cairn</td> <td>Research-Para</td> <td>experimentos de imagem</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>Para confecção de meio de cultura</td></tr><tr><td>Fórceps/Pinças</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT520</td><td>Para dissecação/remoção do intestino</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>Controle positivo (experimento de secreção)</td></tr><tr><td>Pratos com fundo de vidro (35 mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Para experimentos de imagem Pinça</td></tr><tr>de<td>alta precisão (110 mm)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>Para remover a camada muscular</td></tr><tr><td>Câmera digital CCD de alta resolução</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER</td><td>Para experimentos de imagem</td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Controle positivo (experimento de secreção)</td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Para coletar tecidos, manter no gelo</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Para fazer meio de cultura</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Basement Membrane Matrix, para revestimento de placas e pratos</td></tr><tr><td>MetaFluor&nbsp;</td><td>Dispositivos moleculares (fornecidos pela Cairn Research)</td> <td>-</td> <td>Software de imagem de taxa de fluorescência</td></tr><tr><td>Ratos (C57BL6)</td> <td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL / 6J</td><td>Camundongos de fundo usados para reprodução. Também pode ser usado para experimentos de secreção Camundongos</td></tr><tr><td>(GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td> <td>em</td> <td>casa-Para</td> <td>experimentos de imagem e secreção de cálcio</td></tr><tr><td>Microscópio (EVOS XL Core)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Para fotomicrografias de culturas</td></tr><tr><td>Microscópio&nbsp;</td>Microscópio invertido <td>Olympus</td><td>IX71</td><td>com objetiva de óleo 40X usada para experimentos de imagem</td></tr><tr><td>Monocromador</td><td>Cairn</td> <td>Research-Para</td> <td>experimentos de imagem</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Pasteur Alpha Laboratories</td><td>LW4234</td><td>Para limpeza de tecidos</td></tr><tr><td>PBS contendo Ca2+ e Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Para lavar tecidos, mantenha no gelo</td></tr><tr><td>Penicilina & Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Para confecção de placas de Petri de meio de cultura</td></tr><tr><td>(100 mm x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td>Para limpeza de tecidos e remoção da camada muscular</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td>Controle positivo (experimento de imagem de cálcio)</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT554</td><td>Para dissecação/remoção do intestino</td></tr><tr><td>Filtro de células estéreis 100 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>Para filtrar a suspensão de células criptadas antes do revestimento</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi cirúrgico No.22 (estéril, inoxidável)</td> <td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>Para cortar tecidos</td></tr><tr><td>Filtros de seringa, Minisart NML (0.2 &micro; m tamanho do poro)</td><td>Sartorius</td><td>16534-K</td><td>Para solução de colagenase filtrante-esterilizante (meio de digestão)</td></tr><tr><td>Seringas, 20 mL, descartáveis, estéreis, Luer slip</td><td>BD</td><td>300613</td><td>Para solução de colagenase filtrante-esterilizante (meio de digestão)</td></tr><tr><td>Lâmpada de arco de xenônio 75W</td><td>Cairn</td> <td>Research-Para</td> <td>experimentos de imagem</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Inibidor de ROCK, preparar solução de estoque 10 mM em água estéril (usar 1:1.000 no meio de cultura final)</td></tr></tbody></table>

culturas primárias mistas de murino intestino delgado destinadas ao estudo de gut hormonal secreção e imagens de células vivas de células enteroendócrinas

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

O intestino é o maior órgão endócrino do corpo, com células enteroendócrinas secretores de hormona localizados ao longo do comprimento do epitélio gastrointestinal. Apesar da sua importância fisiológica, as células enteroendócrinas representam apenas uma pequena fracção da população celular epitelial e no passado, a caracterização apresentou um desafio considerável, resultando em uma dependência em modelos de linhas celulares. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento e cultivo de células do intestino delgado murino mistos. Estas culturas primárias têm sido utilizados para identificar as vias de sinalização subjacentes a estimulação e inibição de secreção de péptido intestino em resposta a um número de nutrientes e neuropeptídeos, bem como agentes farmacológicos. Além disso, em combinação com a utilização de ratos transgénicos repórter fluorescentes, que têm demonstrado que estas culturas primárias tornar-se uma ferramenta poderosa para o exame de células enteroendócrinas marcadas com fluorescência no emnível tracellular, utilizando métodos tais como patch clamping e de cálcio de uma única célula e imagiologia de cAMP-FRET.

A utilização de passos de digestão em série permite a recolha de uma preparao relativamente limpa de fragmentos de criptas a ser plaqueadas para experiências. As primeiras duas digestões de remover as células principalmente individuais e detritos celulares a partir do material de digestão (Figura 1A). Durante o terceiro digestão, fragmentos de criptas aparecem no material digerido (Figura 1B). Digere 4 e 5 rendimento de um maior número de fragmentos cripta com menor número de células individuais (Figura 1C). Filtrando o material reunido a partir de digestões de 3-5 remove pedaços maiores de tecido não digerido, os quais podem ser prejudiciais para a cultura, produzindo uma preparação de fragmento cripta limpo (Figura 1D). Seguindo 18-24 h de cultura, as monocamadas de células intestinais pequenas primárias são observados (Figura 2A). Utilizando culturas gerados a partir de ratinhos transgénicos que expressam especificamente a calCium de sensor fluorescente, GCaMP3, sob o controlo do promotor de proglucagon 11, células L são facilmente identificáveis e intercaladas dentro da cultura (Figura 2B). Em pequenas culturas primárias intestinal, os compostos alvo a L q -Ca 2+ i e i AMPc dependente de vias estimulada a secreção do GLP-1 (para a metodologia ver experiência secreção Reimann et al. 1). A bombesina (BBS, 100 nM) e a co-aplicação de forscolina e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (M / I, 10? M cada) desencadeou uma estimulação 2- e 11-vezes, de GLP-1 de libertao relativamente basais, respectivamente (Figura 2C). expressão celular específica de G GCaMP3 permite a identificação e a monitorização em tempo real de mobilização de cálcio em células L individuais. Ambos 100 nM bombesina (BBS) e cloreto de potássio 30 mM (KCl) estimulou aumentos transitórios no cálcio intracelular indicativos do conhecido L q &lt;/ sub&gt; - e vias electrogénica acoplada em células L primárias (Figura 2D). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Figura 2: Os dados representativos obtidos a partir de pequenas culturas primárias intestinais. Exemplo de imagens pequenas culturas intestinais mistas primárias utilizadas para (A) e a secreção de experiências de imagiologia (B) pós 24 h chapeamento. (A) A imagem obtida a partir de uma placa de 24 poços, utilizando um microscópio invertido digital com uma objectiva de 4X. Barra de escala = 500 pm. (B) Utilizando GLU-Cre x ratinhos ROSA26 GCamP3, culas L no campo de visão (células verdes) foram identificados pela fluorescência de GCaMP3. A barra de escala representa 50 um. (C) de GLP-1 a secreção foi medida em resposta à bombesina (BBS, 100 nM) e forscolina / 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (M / I, 10? M cada). Percentagem secreção de GLP-1 foi calculadapor medição dos níveis de GLP-1 em sobrenadantes e lisados ​​celulares. Os dados representam as médias ± SEM de n = 3 para cada condição. (D) fluorescência GCaMP3 (reflectindo cálcio citosólico) das duas células descritos em (B) monitorizados em tempo real, em resposta ao cloreto de potássio (KCl, 30 mM) e BBS (100 nM). imagiologia de célula única foi realizada utilizando um microscópio invertido de fluorescência com uma objectiva de imersão em óleo de 40X. GCaMP3 foi excitada a 475/10 nm, utilizando uma lâmpada de arco de xénon de 75 W e um monocromador controlado por software de imagem de fluorescência. Emissão foi registada com uma câmara de alta resolução digital de dispositivo de carga acoplada (CCD), usando um espelho dicróico e um filtro de largura de banda de 510-560 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve o isolamento e cultura de células do intestino delgado de murídeo mistos. Estas culturas primárias intestinais permitir a investigação das vias de sinalização subjacentes a secreção do péptido intestino utilizando um número de técnicas.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

O objetivo geral deste método é isolar e cultivar células intestinais murinas mistas para permitir o estudo da secreção de peptídeos intestinais e a microscopia de células vivas de células enteroendócrinas. Desenvolvemos originalmente este método para possibilitar a caracterização in vitro de células enteroendócrinas. As células enteroendócrinas monitoram o conteúdo intestinal e regulam a homeostase corporal.Mas eles têm sido difíceis de estudar, pois estão dispersos por todo o epitélio intestinal. Os cálcis descritos aqui são particularmente úteis quando combinados com marcação fluorescente genética de células enteroendócrinas, pois isso permite o uso de técnicas de eletrofisiologia em células isoladas e de imagem em tempo real em células vivas. Demonstrará o procedimento Cheryl Brighton, uma pós-doutoranda em nosso laboratório.Para começar, transfira um duodeno de camundongo isolado para uma placa de Petri de 10 centímetros preenchida com PBS. Usando pinças, segure cuidadosamente uma extremidade do fragmento intestinal e introduza a ponta de uma pipeta de Pasteur em seu lúmen. Em seguida, lave o conteúdo intestinal com PBS gelado.Repita para ambas as extremidades intestinais até que a maior parte do conteúdo seja removida. Transfira o intestino lavado para uma placa de Petri limpa contendo PBS fresco e gelado. Sob um microscópio estereoscópico, remova todos os tecidos adiposos e o mesentério do fragmento intestinal, evitando destacar a camada muscular.Em seguida, identifique uma prega da camada muscular na extremidade proximal do tecido. Depois, utilizando dois pares de pin&ccedil;as finas, puxe suavemente uma pequena quantidade dessa camada ao redor de todo o intestino. Segure o intestino e o maior peda&ccedil;o poss&iacute;vel da prega muscular, ent&atilde;o puxe suavemente as camadas separadas e comece a destacar a camada muscular ao redor do intestino.Mantenha as pinças próximas uma da outra para evitar o rompimento da camada muscular e do epitélio. Remova a camada muscular em todo o comprimento do fragmento intestinal. Em seguida, abra o intestino cortando-o longitudinalmente e transfira-o para uma placa de Petri limpa contendo PBS fresco e refrigerado.Agite o tecido para removê-lo de qualquer resíduo de chime ou muco. Após a lavagem, corte o tecido com uma lâmina cirúrgica para obter quadrados de aproximadamente um a dois milímetros quadrados. Em seguida, utilizando uma pipeta de Pasteur pré-umedecida com a ponta pré-cortada, transfira os fragmentos obtidos para um tubo cônico de 50 mililitros contendo aproximadamente 20 mililitros de PBS gelado.Agite suavemente o tubo para lavar adicionalmente os fragmentos de tecido e deixe o tecido sedimentar. Após a sedimentação do tecido, aspire a maior parte do PBS e lave a amostra com PBS fresco mais uma vez. Para digerir o intestino, utilize uma pipeta serológica de 10 mililitros para transferir os fragmentos de tecido para um tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros, contendo DMEM estéril gelado, gire suavemente a suspensão, deixe o tecido sedimentar e, em seguida, remova o meio.Adicione 7 mililitros do meio de digestão aos fragmentos de tecido e agite suavemente a suspensão. Incube a suspensão em banho-maria a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, agite suavemente o tubo por aproximadamente três segundos.Centrifugue o tecido não digerido e transfira o meio de digestão para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe qualquer tecido coletado acidentalmente decantar e, utilizando uma pipeta serológica de 10 mililitros, transfira-o de volta para o tubo cônico de 15 mililitros, contendo o tecido não digerido. Preserve um pequeno volume do meio de digestão para observação microscópica e descarte o restante.Monitore o conteúdo do meio de digestão sob o microscópio óptico para garantir que a suspensão não contenha muitas criptas. Em seguida, adicione 7 mililitros de meio de digestão fresco e realize o procedimento de digestão mais uma vez. Para preparar a suspensão de fragmentos de cripta, adicione 7 mililitros de meio de digestão fresco aos fragmentos de intestino.Incube o tecido em banho-maria a 37 graus Celsius por dez minutos. Agite a amostra por mais tempo e com maior vigor desta vez, a cada cinco minutos. Sedimente o tecido não digerido e transfira o meio de digestão para um tubo cônico de 15 mililitros.Deixe qualquer tecido coletado acidentalmente sedimentar e, com uma pipeta serológica de 10 mililitros, transfira-o de volta para o tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo o tecido não digerido. Adicione 7 mililitros de meio de digestão fresco aos fragmentos de intestino e inicie a próxima digestão. Em seguida, centrifugue o meio coletado da digestão anterior a 100 x g, em temperatura ambiente, por 3 minutos.Após descartar o sobrenadante, re-suspenda o pellet celular em 5 mililitros do meio de cultura pré-aquecido, por pipetagem suave. Em seguida, reserve a amostra e colete uma pequena alíquota da suspensão celular. Ao microscópio óptico, confirme que a amostra contém fragmentos isolados de criptas.Repita a digestão do tecido mais 2 a 3 vezes ou até que a maior parte do tecido tenha sido digerida. Após coletar os sobrenadantes da digestão, reúna todos eles e centrifugue a amostra a 100x g em temperatura ambiente por três minutos. Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet pipetando suavemente até que não sejam visíveis grumos e 5 mililitros de meio de cultura pré-aquecido suplementado com 10 micromolares de Y-27632, que previne a anoique. Finalmente, filtre a suspensão celular através de um filtro de 100 microns para remover qualquer tecido não digerido. Lave o filtro com 2 mililitros adicionais do meio de cultura pré-aquecido suplementado com Y-27632. Antes de semear as células, remova a placa revestida com matriz de membrana basal do incubador.Remova a solução em excesso de matriz da membrana basal da placa e adicione 250 microlitros do meio de cultura pré-aquecido, suplementado com 10 micromolar de Y-27632, a cada poço. Semee 250 microlitros da suspensão celular por poço de uma placa de 24 poços, utilizando pipetagem gota a gota realizada em movimento lento em zigue-zague. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Apresentam-se aqui imagens de microscopia das monocamadas de células primárias do intestino delgado obtidas após 18 a 24 horas de cultivo. Células primárias do intestino delgado cultivadas in vitro responderam a estímulos que elevam o cálcio intracelular ou o AMP cíclico, resultando em um aumento duas vezes maior na liberação do peptídeo semelhante ao glucagon-1, quando as células foram tratadas com bombesina, e em um aumento de onze vezes na secreção quando estimuladas simultaneamente com forskolina e IBMX. Por fim, utilizando culturas geradas a partir de camundongos transgênicos que expressam GCAMP 3 sob o controle do promotor de pró-glucagon, demonstrou-se que as células L primárias do intestino delgado respondem à estimulação com bombesina e cloreto de potássio com um aumento no cálcio citosólico, conforme evidenciado pelo aumento da fluorescência.O procedimento demonstrado concentra-se nas células do intestino delgado em cultura, as quais muitos laboratórios têm considerado desafiadoras. Também utilizamos uma abordagem semelhante para o cultivo de outros segmentos intestinais, tanto de origem murina quanto humana. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em quatro horas, se executada corretamente.Nenhuma das preparações é igual, portanto é importante lembrar-se de examinar alíquotas de cada digestão ao microscópio. Isso permite avaliar o andamento e ajustar a intensidade da agitação e o número de digestões conforme necessário.

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Research

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Biology

Biologia

Este artigo eo vídeo que acompanha apresentar o nosso protocolo para gerar o tecido de intestino no mouse, utilizando uma abordagem de unidades-em-andaime organóide.

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A tecnologia de imagem aprimorada está permitindo imagens tridimensionais de órgãos durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos todo um sistema de cultura de órgãos que permite imagens ao vivo das vilosidades em desenvolvimento no intestino fetal de camundongo.

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Este artigo apresenta um método único para analisar as interações hospedeiro-microbioma usando um novo sistema de cultura de órgãos intestinais para experimentos ex vivo.

Um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) com um Componente Imunológico

Aprenda a isolar e cultivar células intestinais mistas de murinos para estudar a secreção de peptídeos intestinais e imagens de células vivas de células enteroendócrinas. Este método permite investigar vias de sinalização em neurociência e biologia celular.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas (Vídeo) | JoVE Journal

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