Montagem e Rastreamento do Desenvolvimento de Comunidade Microbiana em uma Plataforma Microwell Array

O objetivo geral deste método é a análise paralela de alto rendimento de comunidades microbianas de vários membros em ambientes confinados usando micro matrizes de poços de silício. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma triagem altamente paralela de alto rendimento de interações microbianas finamente localizadas que são significativas para a indústria, a medicina e o meio ambiente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da ecologia biomédica e microbiana, como como as restrições espaciais inerentes a escalas finas impulsionam os parâmetros determinísticos e estocásticos do desenvolvimento da comunidade e quais são os principais efeitos na abundância e organização dos membros microbianos?

Comece preparando as matrizes de micro poços. Primeiro, corte chips individuais de micro matriz de poços de wafers de silício impressos com várias matrizes usando um riscador de diamante. Cada chip individual contém sub-matrizes de poços com diâmetros que variam de cinco a 100 mícrons em três densidades de espaçamento diferentes.

Em cada chip, o motivo completo dos poços também é repetido quatro vezes. Em seguida, faça uma câmara umidificada usando uma caixa de ponta de pipeta e um lenço umedecido em PBS. Em seguida, aplique uma gota de 150 microlitros de solução BSA em cada chip e incube os chips na caixa por uma hora em temperatura ambiente.

Enquanto isso, prepare as bactérias. Gire uma cultura e ressuspenda-a em 500 microlitros de meio R2A fresco com dois por cento de glicerol. Em seguida, meça a densidade da cultura em 600 nanômetros e ajuste a concentração para uma densidade óptica de 0,02.

Após a incubação dos chips, remova a solução BSA e enxágue os chips três vezes com PBS. Após os enxágues, seque os cavacos com gás nitrogênio e devolva-os à câmara umidificada. Em seguida, adicione 150 microlitros de suspensão de cultura a cada cavaco seco e incube os cavacos por uma hora a quatro graus Celsius para que as bactérias tenham tempo de aderir aos poços, mas a divisão celular de qualquer possível contaminante seja lenta.

Para preparar um chip para imagem, primeiro faça uma lamínula revestida de agarose para cada chip. Liquefaça um pequeno volume de agarose, cerca de cinco mililitros são necessários para cada lamínula. Em seguida, lave um lado de uma lamínula com etanol e centralize-o em uma lâmina de vidro com o lado lavado para cima.

Em seguida, posicione dois espaçadores PDMS de um milímetro de espessura ao longo das bordas longas da lamínula e desloque a lamínula para que um milímetro fique pendurado na lâmina. Agora, despeje agarose suficiente na lamínula para cobri-la completamente. Em seguida, use uma segunda lâmina de vidro para achatar a agarose em uma espessura uniforme.

Prepare vários desses conjuntos de slides em paralelo. Quando a agarose começar a solidificar, transfira os conjuntos para quatro graus Celsius. Após 15 minutos de resfriamento, corte o excesso de agarose ao redor das lamínulas.

Em seguida, coloque os conjuntos em placas de Petri e armazene-os a quatro graus Celsius. Depois que os chips forem incubados com as bactérias, mergulhe-os em água ultrapura, um de cada vez, por 10 segundos cada. Em seguida, coloque as lascas úmidas em suas bordas sobre um lenço de papel até que a maior parte do líquido tenha escorrido.

Agora, remova as bactérias que não se instalaram nos poços. Corte um pedaço de fita adesiva no comprimento do chip de silício e cole-o na camada de parileno do silício. Em seguida, retire a fita para remover a camada de parileno e prepare-se imediatamente para inverter o chip.

Agora, coloque o chip em um conjunto de lâminas de forma que os micro poços fiquem em contato com a agarose. Tenha muito cuidado para não mover ou deslocar o chip uma vez em contato com a agarose. Agora, transfira o conjunto completo para o suporte de slides de uma câmara de controle ambiental de palco e adquira imagens de lapso de tempo nas próximas 24 horas no intervalo desejado e com ampliação de 10x.

Processe as pilhas de imagens usando software convencional disponível gratuitamente. Primeiro, importe a sequência de imagens. Para calcular a média, carregue a correção ou as imagens de campo escuro.

Em seguida, execute uma subtração de fundo. Forneça um valor de raio como 135 pixels e selecione o parabolóide deslizante. Em seguida, remova a imagem média do campo escuro da imagem média do campo de iluminação selecionando as duas imagens e usando a operação de subtração.

Agora, aplique uma correção de iluminação da seguinte maneira. Defina a operação para dividir, defina i1 para a imagem do poço, defina i2 para a imagem de correção, defina k1 para a média da imagem de correção e defina k2 para zero. Em seguida, clique em Criar nova janela.

Para quantificar o crescimento bacteriano nos micro poços, primeiro selecione as regiões de interesse com o micro array plug-in. No menu do mapa, clique em redefinir grade e especifique as linhas, colunas e diâmetros de poço. Em seguida, no menu de forma de ROI, selecione círculo.

Para ajustar a matriz ROI à imagem, a matriz ROI pode ser movida pressionando a tecla ALT ou ALT+SHIFT e selecionando o ROI superior esquerdo com o mouse. Para redimensionar os ROIs, pressione a tecla shift enquanto seleciona o canto inferior direito da matriz de ROI. Para ajustar o espaçamento entre as ROIs, pressione a tecla shift enquanto arrasta o lado superior ou inferior da matriz.

Quando a matriz de ROI se ajustar aos poços da imagem, clique em Medir RT. Em seguida, uma tabela com todas as medições para cada imagem ou ponto de tempo será emitida e poderá ser copiada para uma planilha para análise. O crescimento de duas cepas de Pseudomonas aeruginosa foi comparado. Uma cepa expressa constitutivamente proteínas efetoras tóxicas associadas a secreções do tipo seis.

O outro é suscetível à patogênese do tipo seis devido à perda de função. Ambos expressam uma proteína fluorescente diferente. As coculturas foram estudadas longitudinalmente e em diferentes tamanhos de poço.

As bactérias foram cultivadas individualmente e em co-cultura. 20 horas de crescimento foram visualizadas em intervalos de 30 minutos. Após as correções de software realizadas nos dados de imagem, as trajetórias quantitativas de crescimento foram traçadas.

Na co-cultura, os dados não sugerem muita mudança no crescimento. Para avançar na análise, cada trajetória foi ajustada a uma função logística modificada com três parâmetros, sinal máximo, taxa máxima e tempo de latência. Esta análise sugere que o co-cultivo dessas espécies teve um efeito insignificante em seu crescimento geral e sua variabilidade observada nas curvas de crescimento é provavelmente devido a fatores ambientais.

Uma vez masterizado, a configuração pode ser executada em apenas algumas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ter células de crescimento robusto para ajustar adequadamente os valores finais de diâmetro externo da célula para ter camadas de trado uniformes nos conjuntos de cavacos e estar atento durante a etapa de remoção do parileno. Seguindo este procedimento, questões como como a expressão gênica dentro de cada comunidade muda em função da composição e organização da comunidade podem ser abordadas pela análise do material genético.

Não se esqueça de que trabalhar com Pseudomonas aeruginosa pode ser potencialmente perigoso, e precauções como luvas, jaqueta, óculos e técnicas assépticas adequadas devem sempre ser usadas durante a realização deste procedimento.