Montagem e Acompanhamento do Desenvolvimento da Comunidade Microbiana dentro de uma Plataforma Array Microwell

O objetivo geral deste método é a análise paralela de alto rendimento de comunidades microbianas com múltiplos membros em ambientes confinados, utilizando matrizes de micropoços de silício. A principal vantagem desta técnica é que ela permite um rastreamento altamente paralelo e de alto rendimento de interações microbianas finamente localizadas, as quais são significativas para a indústria, a medicina e o meio ambiente. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de ecologia microbiana e biomédica, como, por exemplo, de que forma as restrições espaciais inerentes a escalas finas influenciam os parâmetros determinísticos e estocásticos do desenvolvimento comunitário e quais são os efeitos principais sobre a abundância e a organização dos membros microbianos?

Inicie preparando as matrizes de poços microscópicos. Primeiro, corte chips individuais de matriz de poços microscópicos de wafers de silício impressos com múltiplas matrizes usando uma ponta de diamante. Cada chip individual contém submatrizes de poços com diâmetros variando de cinco a 100 mícrons em três densidades de espaçamento diferentes.

Em cada chip, o padrão completo de poços também é repetido quatro vezes. Em seguida, prepare uma câmara umidificada usando uma caixa de ponteiras e um lenço umedecido com PBS. Então, aplique uma gota de 150 microlitros de solução de BSA em cada chip e incube os chips na caixa por uma hora à temperatura ambiente.

Enquanto isso, prepare as bactérias. Centrifugue uma cultura e re-suspenda-a em 500 microlitros de meio R2A fresco com dois por cento de glicerol. Em seguida, meça a densidade da cultura em 600 nanômetros e ajuste a concentração para uma densidade óptica de 0,02.

Após a incubação do chip, remova a solução de BSA e lave os chips três vezes com PBS. Após as lavagens, seque os chips com gás nitrogênio e devolva-os à câmara umidificada. Em seguida, adicione 150 microlitros de suspensão de cultura a cada chip seco e incube os chips por uma hora a quatro graus Celsius para que as bactérias tenham tempo de aderir aos poços, mas a divisão celular de qualquer possível contaminante seja lenta.

Para preparar um chip para imagem, primeiro faça uma lamínula revestida com agarose para cada chip. Liquefaça um pequeno volume de agarose, cerca de cinco mililitros são necessários para cada lamínula. Em seguida, lave um lado de uma lamínula com etanol e posicione-a no centro de uma lâmina de vidro com o lado lavado voltado para cima.

Em seguida, posicione dois espaçadores de PDMS com espessura de um milímetro ao longo das bordas longas do lamínula e desloque o lamínula para que um milímetro fique saliente em relação à lâmina. Agora, despeje quantidade suficiente de agarose sobre o lamínula para cobri-lo completamente. Em seguida, use uma segunda lâmina de vidro para nivelar a agarose, obtendo uma espessura uniforme.

Prepare vários desses conjuntos de lâminas em paralelo. Quando o agarose começar a solidificar, transfira os conjuntos para quatro graus Celsius. Após 15 minutos de resfriamento, corte o excesso de agarose ao redor das lamínulas.

Em seguida, coloque os conjuntos em placas de Petri e armazene-os a quatro graus Celsius. Após as lâminas terem sido incubadas com as bactérias, mergulhe-as em água ultrapura, uma a uma, durante 10 segundos cada. Em seguida, posicione as lâminas úmidas sobre as bordas, apoiadas em um papel absorvente, até que a maior parte do líquido tenha escorrido.

Agora, remova as bactérias que não sedimentaram nos poços. Corte um pedaço de fita adesiva com o comprimento do chip de silício e adira-o ao revestimento de parileno sobre o silício. Em seguida, desprenda a fita para remover o revestimento de parileno e prepare-se imediatamente para inverter o chip.

Agora, posicione o chip sobre um conjunto de lâmina de modo que os micropoços entrem em contato com o agarose. Tenha muito cuidado para não mover ou deslocar o chip uma vez que entre em contato com o agarose. Em seguida, transfira o conjunto completo para o suporte da lâmina de uma câmara de controle ambiental acoplada ao microscópio e adquira imagens em lapso de tempo nas próximas 24 horas no intervalo desejado e com ampliação de 10x.

Processe as pilhas de imagens usando software convencional e de acesso livre. Primeiro, importe a sequência de imagens. Para a média, carregue as imagens de correção ou de campo escuro.

Em seguida, realize uma subtração do fundo. Forneça um valor de raio, como 135 pixels, e selecione paraboloide deslizante. Depois, remova a imagem média do campo escuro da imagem média do campo de iluminação selecionando as duas imagens e utilizando a operação de subtração.

Agora, aplique uma correção de iluminação conforme a seguir. Defina a operação como divisão, defina i1 como a imagem do poço, defina i2 como a imagem de correção, defina k1 como a média da imagem de correção e defina k2 como zero. Em seguida, clique em Criar Nova Janela.

Para quantificar o crescimento bacteriano nos micropoços, selecione primeiro as regiões de interesse com o plug-in de microarranjo. No menu de mapa, clique em redefinir grade e especifique as linhas, colunas e diâmetros dos poços. Em seguida, no menu de forma da ROI, selecione círculo.

Para ajustar a matriz de ROI à imagem, a matriz de ROI pode ser movida pressionando a tecla ALT ou ALT+SHIFT e selecionando o ROI superior esquerdo com o mouse. Para redimensionar as ROI, pressione a tecla shift enquanto seleciona o canto inferior direito da matriz de ROI. Para ajustar o espaçamento entre as ROI, pressione a tecla shift enquanto arrasta o lado superior ou inferior da matriz.

Uma vez que a matriz de ROI se ajuste sobre os poços da imagem, clique em Medir RT. Em seguida, será gerada uma tabela com todas as medições para cada imagem ou ponto temporal, que poderá ser copiada para uma planilha para análise. O crescimento de duas cepas de Pseudomonas aeruginosa foi comparado. Uma das cepas expressa constitutivamente proteínas efetoras tóxicas associadas à secreção do tipo seis.

O outro é suscetível à patogênese do tipo seis devido à perda de função. Ambos expressam uma proteína fluorescente diferente. Os cultivos mistos foram estudados longitudinalmente e em diferentes tamanhos de poço.

As bactérias foram cultivadas individualmente e em co-cultura. O crescimento durante 20 horas foi registrado em intervalos de 30 minutos. Após correções por software nos dados de imagem, foram traçadas trajetórias quantitativas de crescimento.

No co-cultivo, os dados não indicam uma alteração significativa no crescimento. Para aprofundar a análise, cada trajetória foi ajustada a uma função logística modificada com três parâmetros: sinal máximo, taxa máxima e tempo de latência. Essa análise sugere que o co-cultivo dessas espécies teve um efeito desprezível sobre seu crescimento geral, e a variabilidade observada nas curvas de crescimento é mais provavelmente devida a fatores ambientais.

Uma vez dominado, o procedimento pode ser executado em apenas algumas horas, se realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante utilizar células com crescimento robusto para ajustar adequadamente os valores finais de OD celular e obter camadas uniformes de auger nas montagens do chip, além de ter cuidado durante a etapa de remoção do parileno. Após este procedimento, questões como como a expressão gênica dentro de cada comunidade muda em função da composição e organização da comunidade podem ser abordadas por meio da análise de material genético.

Não se esqueça de que trabalhar com Pseudomonas aeruginosa pode ser potencialmente perigoso, e precauções como luvas, jaleco, óculos de proteção e técnicas assépticas adequadas devem sempre ser utilizadas ao realizar este procedimento.