Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos

O objetivo geral deste procedimento é isolar fragmentos microvasculares do tecido adiposo murino para a geração de unidades de vascularização para engenharia de tecidos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia de tecidos sobre a vascularização in vivo de substitutos teciduais. Uma vantagem dessa técnica é que ela produz segmentos microvasculares totalmente funcionais sem processamento in vitro complexo que podem ser semeados em andaimes e implantados em defeitos teciduais.

Este método também pode ser aplicado a outros sistemas, como ensaios de angiogênese in vitro, para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à formação e remodelação da rede microvascular. Comece colocando um camundongo macho tipo C57 preto seis anestesiado na posição supina sob um estereomicroscópio cirúrgico e confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé. Imobilize as patas com fita adesiva e desinfete o abdômen.

Em seguida, use uma tesoura de dissecação para separar a camada abdominal do tecido muscular subjacente e faça uma laparotomia na linha média. Desdobre lateralmente os retalhos da parede abdominal e identifique bilateralmente os testículos, o epidídimo e as bolsas de gordura do epidídimo. Em seguida, use uma pequena tesoura de preparação e uma pinça fina para colher as almofadas de gordura, tomando cuidado para não coletar nenhum tecido epididimal e coloque as almofadas de gordura em uma placa de Petri contendo 15 ml de DMEM a 37 graus Celsius.

Em uma capela de fluxo laminar, lave as almofadas de gordura em três placas de Petri separadas contendo 15 ml de PBS e coloque a gordura lavada em um tubo vazio de polipropileno de 14 ml. Use uma balança de tubo para determinar o volume de gordura colhida. Em seguida, use uma tesoura fina para picar mecanicamente o tecido adiposo.

Quando uma suspensão de tecido homogêneo for obtida, use uma pipeta de medição de 10 mL para transferir o tecido picado com dois volumes de collaginase NB 4G para um frasco erlenmeyer de 50 mL contendo uma barra de agitação de 25 milímetros. Colocar o balão numa estufa de cultura de células durante 10 minutos, agitando vigorosamente. Em seguida, observe 10 mcL do tecido digerido ao microscópio.

O passo mais difícil neste procedimento de isolamento é identificar o momento apropriado para interromper a digestão. Digerir as almofadas de gordura por muito tempo resultará em uma única suspensão celular sem fragmentos microvasculares. Se o digerido contiver fragmentos microvasculares derivados de tecido adiposo livre próximos a células individuais, neutralize a enzima com dois volumes de PBS suplementados com 20% FCS e transfira a suspensão do vaso celular para novos tubos de polipropileno.

Incubar a solução por cinco minutos a 37 graus Celsius para separar os fragmentos microvasculares da gordura restante por gravidade. Em seguida, use uma pipeta de precisão de um mL para remover cuidadosamente um mL do sobrenadante de gordura principal, seguido pelo uso de uma pipeta de precisão de 100 mcL para remover o restante do sobrenadante até que a suspensão pareça estar livre de gordura. Quando toda a gordura tiver sido removida, use uma pipeta de medição de 10 mL para filtrar a suspensão do vaso celular através de um filtro de 50 mícrons sobre um tubo cônico de 50 mL e transfira a suspensão filtrada para um novo tubo de polipropileno de 14 mL para cada fragmento microvascular isolado individual.

Colete os grânulos de fragmentos microvasculares por centrifugação e remova todos, exceto o último mL de sobrenadante de cada tubo. Ressuspenda os pellets nos sobrenadantes restantes. Em seguida, transfira cada suspensão para tubos de microcentrífuga cônicos individuais de 1,5 mL e coloque os fragmentos microvasculares novamente para ressuspensão no volume final apropriado de PBS e 20% FCS para a análise planejada a jusante.

Aqui, é mostrada a distribuição de comprimento de fragmentos microvasculares recém-isolados de seis camundongos pretos selvagens tipo C57 de seis meses de idade, com um comprimento médio de aproximadamente 42 micrômetros observados. Como demonstra este esfregaço representativo de suspensão de vasos celulares, fragmentos microvasculares grandes, médios e pequenos, bem como células únicas, são observados quando o tecido adiposo foi suficientemente digerido. Uma ampliação maior revela que os fragmentos microvasculares exibem uma morfologia de microvasos madura com segmentos hierárquicos de microvasos.

A caracterização dos fragmentos microvasculares por citometria de fluxo indica que eles contêm células endoteliais CD31 positivas, células paravasculares alfa lisas positivas para actons e células-tronco mesenquimais CD117 positivas, células que expressam marcadores. Após a semeadura em um substituto cutâneo da pele, fragmentos microvasculares maiores são localizados principalmente na superfície do implante com alguns segmentos de vasos capilares detectados dentro dos núcleos do implante. A coloração imuno-histoquímica dos fragmentos microvasculares semeados revela ainda mais configurações fisiológicas de microvasos com fragmentos arteriolares, venulares e capilares.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas horas se executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar fragmentos microvasculares do tecido adiposo murino como unidades de vascularização para engenharia de tecidos.