Quantificando pigmentação abdominal em Drosophila melanogaster

O objetivo geral desta metodologia é quantificar rapidamente a pigmentação abdominal na mosca-das-frutas Drosophila melanogaster. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia evolutiva, como identificar os loci genéticos subjacentes, por sua vez, à morfologia de variação específica de confiança e compreender o desenvolvimento e a evolução dos fenótipos morfológicos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os usuários meçam de forma não destrutiva vários aspectos da pigmentação abdominal, incluindo a propagação e a profundidade da pigmentação.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a pigmentação abdominal de Drosophila melanogaster, ele também pode ser aplicado a outras espécies de Drosophila e facilmente adaptado para medir padrões de pigmentação em outros insetos e táxons de animais. Antes da imagem, as moscas podem ser armazenadas em etanol a 70% para manter sua pigmentação. A visualização requer uma plataforma de montagem.

Carregue uma placa de Petri de 60 milímetros com cerca de 10 mililitros de 1,25%ágar em água. Sob um microscópio, use uma pinça fina para cavar uma trincheira de 20 milímetros de comprimento, dois milímetros de largura e um milímetro de profundidade no gel. Várias trincheiras podem ser feitas em um prato.

Em seguida, incorpore as moscas na trincheira com a superfície para análise logo acima da superfície do gel. Neste caso, o lado dorsal é de interesse. Agora, encha o prato com etanol 70% até que as moscas estejam completamente submersas.

Isso reduz os reflexos da cutícula que podem obscurecer o padrão de pigmentação. Agora, inicie o software de imagem e a câmera digital conectada ao microscópio. Para uma fonte de luz, a luz fria de um dispositivo pescoço de ganso duplo é ampla.

No software de análise de imagem, defina o tipo de imagem para 8 bits. Em seguida, no software de captura de imagem, alterne a configuração Ao vivo para abrir uma janela de visualização da câmera. Defina o tipo de imagem como Escala de cinza.

Agora, defina a fonte de luz para sua intensidade máxima e posicione as luzes a cerca de 120 milímetros do palco. Defina o microscópio para uma ampliação de 60 vezes para que o campo de visão tenha três milímetros de largura. Em seguida, coloque o micrômetro de estágio de dois milímetros no campo de visão e concentre-se nele.

Voltando ao software, ajuste o tempo de exposição para visualizar o micrômetro usando o campo encontrado na caixa de exposição. Em seguida, defina a escala. Abra a ferramenta de linha reta e desenhe o comprimento de dois milímetros ao longo do micrômetro do estágio.

Em seguida, insira esse comprimento na opção Definir escala. A janela deve então exibir a escala em pixels por mícron. Anote a escala e OK os ajustes.

Agora, retorne ao software de captura de imagem e use os comandos Parar e Encaixar para capturar uma imagem do micrômetro do palco. Em seguida, retorne ao software de análise de imagem e salve a imagem como um arquivo Tiff. Agora, concentre-se na linha média dorsal de uma mosca montada.

A linha média deve ser posicionada para cima para obter os melhores resultados de imagem. Afaste as asas e quaisquer outras estruturas intrusas e ajuste a iluminação para melhor iluminar a cutícula. Em seguida, defina a exposição no software de captura de imagem usando o histograma de valor de pixel como guia para capturar toda a faixa de pixels da imagem sem saturação, maximizando assim o contraste.

Mantenha essa exposição e iluminação durante todo o experimento. Agora, antes de capturar uma imagem, certifique-se de que os segmentos abdominais de interesse estejam à vista. Em seguida, capture uma imagem e salve-a com o número de ID de amostra no nome do arquivo.

Use o formato descrito no protocolo escrito. Esta análise faz uso de uma macro fornecida pelos autores. A série de imagens para análise deve estar contida na mesma pasta de arquivos.

Agora, inicie a macro e siga os comandos solicitados. Primeiro, identifique o local dos arquivos armazenados. Em seguida, identifique o local onde os dados de análise devem ser armazenados.

Em seguida, insira o número de caracteres que foram usados nos nomes dos arquivos para que o software leia a série de imagens corretamente. O próximo prompt é para a largura da região de interesse. Aqui, insira o número de pixels ao longo da faixa ântero-posterior que precisa ser analisada.

Agora, no prompt, faça a escolha de analisar a primeira imagem da série. As outras opções são analisar a próxima imagem da série ou sair da análise. A ferramenta de linha é selecionada automaticamente.

Use-o para identificar a linha média na imagem, desenhando uma linha ao longo dela na direção anterior para posterior. Em seguida, siga as instruções de macro para identificar a borda posterior do Tergite4 usando a ferramenta de linha. A ferramenta de linha é disponibilizada para desenhar a linha da borda da linha média posterior até a borda lateral direita, de modo que o centro da linha fique logo posterior à borda posterior da faixa de pigmento.

Em seguida, defina a borda anterior do Tergite4 usando a ferramenta de linha. Desenhe uma linha da borda da linha média anterior até a borda lateral direita. O meio da linha definida por um quadrado branco deve ficar na borda anterior da cutícula levemente pigmentada.

Com essas informações, a macro agora gera um perfil de pigmentação. No entanto, o perfil pode ser impreciso se cerdas ou outras manchas cruzarem a faixa ao longo da qual o perfil é medido. Para corrigir isso, selecione a visualização ao vivo na janela do histograma e ajuste a linha de forma que o perfil seja suave.

Para que a tira de análise de imagem capture com precisão os vários aspectos da pigmentação, é vital identificar uma região de análise que tenha o mínimo de ruído causado por irregularidades na imagem ou na amostra. Agora prossiga para analisar Tergite3 na mesma imagem e depois passe para a próxima imagem. O procedimento descrito foi usado para explorar uma mudança conhecida na pigmentação abdominal causada pela temperatura de elevação.

O terceiro e o quarto tergitos foram examinados várias vezes sob várias iluminações e exposições. Vários aspectos da pigmentação foram explorados. E, especificamente, verificou-se que as faixas de pigmentação eram mais largas quando as moscas eram criadas em temperaturas mais baixas.

Os valores calculados foram então comparados com medidas subjetivas gerais feitas nas mesmas moscas por cinco observadores diferentes. Na avaliação de 45 moscas fêmeas, a classificação média observada da largura da quarta faixa de pigmentação abdominal foi fortemente correlacionada com a medição automatizada da macro. A mesma banda de pigmentação também foi medida manualmente usando um software de imagem.

Esses resultados também foram fortemente correlacionados com as medições geradas usando a macro. O software foi então testado para medir a pigmentação em mutantes de ébano feminino, que são bem conhecidos por terem pigmentação aumentada na terceira e quarta bandas de pigmento. O método também foi utilizado para medir a quinta e sexta bandas abdominais de fêmeas selvagens.

A técnica automatizada sempre forneceu medições úteis da densidade do pigmento e do tamanho da banda. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar com rapidez e precisão a pigmentação abdominal em Drosophila. Dominar a técnica requer principalmente o uso de fórceps em profundidade.

Uma vez dominada, a parte de imagem desta técnica pode ser feita a uma taxa de 50 amostras por hora. A extração das medidas de pigmentação dessas imagens pode ser feita a um ritmo de 70 imagens por hora.