Name: Medição da captação de glicose e resposta à estimulação de insulina em miotubos primários humanos cultivados in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a medir a captação de glicose estimulada por insulina em miotubos primários humanos cultivados in vitro. Este método quantifica os efeitos biológicos da insulina no metabolismo muscular.

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Os autores reconhecem Anne Charrié no serviço de Radiobiologia (hospital Lyon-Sud) e Fond National Suisse (FNS) pelo apoio financeiro.

1. Preparação de meios e soluções de cultura de células <ol><li> Preparação de meios de cultura <ol><li> Prepare o meio de proliferação (PM), completando o meio F-10 de Ham com glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (5 μg / mL final), 2% de soro de vitelo fetal (FCS) e 2% de suero. </li><li> Prepare o meio de diferenciação (DM), completando o meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (5 μg / mL final) e FCS a 2%. </li></ol></li><li> Preparação de soluções de absorção de glicose Cuidado: o manuseio de material radioativo só é permitido em uma área restrita e controlada por pessoal autorizado. Os materiais e os resíduos devem ser manuseados de acordo com os procedimentos adequados, diretrizes e legislação local. <ol><li> Para preparar a solução salina tamponada com fosfato de X-Dulbecco (X-DPBS), faça uma solução de DPBS contendo 0,2% (p / v) (concentração final) de soro bovino albUmin (BSA). Filtra a solução através de um filtro de 0,2 μm. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Para preparar a solução fria de 2-desoxi-D-glicose (2dG), pesa 16,4 mg de 2dG e solubiliza-se em 10 mL de água destilada para se obter uma solução 10 mM. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicione 600 μL de 2dG frio e 6 μL de [3H] 2dG radiomarcado a 5400 μL de X-DPBS para obter a solução 2dG (2dG *) radiomarcada. NOTA: A concentração final é 1 mM 2dG e rotulagem é 1 μCi / mL. <ol><li> Coloque uma alíquota de 20 μL (TC20) de uma solução 2dG * radiomarcada. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação de misturas de incubação <ol><li> Para a mistura de citocalasina B, adicione 2 μL de citocalasina B 20 mM a 2 mL de solução 2dG * radiomarcada. NOTA: A solução de reserva de citocalasina B é de 10 mg / mL em sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li><li> Para a mistura DMSO, adicione 4 μL de DMSO aos restantes 4 mL de solução 2dG * radiomarcada. </li></Ol&gt; </li></ol> 2. Cultura das células musculares primárias humanas <ol><li> Semeadura de placas de 6 poços com células de células musculares humanas NOTA: Use in-house (veja a referência 24 para detalhes) ou células de satélite musculares disponíveis comercialmente a partir de um frasco congelado (contendo 250,000 células). O seguinte procedimento é dado para 250.000 células, de modo a obter uma placa de 6 poços necessária para a medição da absorção de glicose em uma única condição. <ol><li> Descongelar rapidamente os frascos congelados de 24 ou as preparações comerciais de células satélites de músculo humano em água pré-aquecida (37 ° C) até que apenas um pequeno bloco de gelo permaneça no frasco. </li><li> Despeje diretamente em um tubo de plástico de 50 mL contendo 10 mL de pré-aquecido (37 ° C) PM. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 500 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspenda gentilmente o sedimento celular com 18 mL de PM pré-aquecido (para obter 42.000 células por3 mL de meio). Distribua 3 mL em cada poço de uma placa de 6 poços (9,6 cm 2 ). NOTA: Os seis poços individuais de uma placa são necessários para realizar uma medida duplicada da absorção de glicose nas seguintes condições: inibição do transporte passivo (poços 1 e 2), taxa basal (poços 3 e 4) e taxa estimulada pela insulina (poços 5 e 6). Repita tantas placas de seis poços como tratamentos distintos são necessários. </li><li> Incubar em condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de CO 2 ) até as células atingir 90% de confluência. NOTA: Esta etapa leva entre 48 e 72 h, dependendo do lote celular. Não mude o meio durante esta etapa. </li></ol></li><li> Diferenciação de células musculares <ol><li> Remova o PM (após 48-72 h) e substitua-o por DM pré-aquecido (3 mL por poço). Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 . NOTA: A diferenciação leva cinco dias para alcançar um estado estável onde as células estão alinhadas e polinucleadas. Normalmente, o primárioOs miotubos são cultivados em um meio de glicose de 1 g / L. Portanto, para evitar a depleção de glicose durante a cultura, preencha a placa com 3 mL de meio para garantir que o substrato suficiente de glicose esteja disponível para as células em todos os momentos. </li><li> Substitua o DM médio a cada dois dias. NOTA: A partir deste ponto, os miotubos são estáveis ​​por até 7 dias sem alteração significativa e a medição da absorção de glicose pode ser realizada a qualquer momento. </li></ol></li><li> Tratamento de células musculares (opcional) NOTA: Os miotubos primários podem ser tratados por vários dias para induzir modificação (teste de drogas, inibidores / ativadores da via de sinalização, etc. ) antes da estimulação de insulina e medidas de absorção de glicose. As células musculares podem ser submetidas a qualquer tratamento que possa ter um impacto na sensibilidade à insulina, e a medida da absorção de glicose irá quantificar esse impacto. Por exemplo, a incubação de células musculares com o palmitato de ácidos graxos saturados promove a resistência à insulina e as células apresentam redução de iNsulin estimulou a absorção de glicose. <ol><li> Prepare 12 mL de DM suplementado com 10% de BSA (sem ácidos graxos) e palmitato de 0,5 mL (PALM). Prepare 12 mL de DM suplementado apenas com 10% de BSA (sem ácidos graxos). </li><li> Prepare duas placas de 6 poços com miotubos primários humanos e cultive-os conforme descrito nas seções 2.1 e 2.2 (com 5 dias de diferenciação). </li><li> No dia 5, lave cada poço com 2 mL de PBS. Em um prato, adicione 2 mL de DM contendo PALM. Para a outra placa, adicione 2 mL de BSA contendo apenas DM. </li><li> Incubar durante 48 h a 37 ° C, 5% de CO 2 . </li></ol></li></ol> 3. Estimulação da insulina <ol><li> Lavar as células musculares diferenciadas duas vezes com 2 mL de PBS. </li><li> Remova PBS cuidadosamente e incuba com 3 mL de MS sem FCS durante 3 h (37 ° C, 5% de CO 2 ) para a depleção de soro. </li><li> Substitua a mídia em todos os poços por 3 mL de DM sem FCS. Adicione insulina 100 nM aos poços 5 e 6. </li><li> Incubar cultura de miotubos humanos para1 h (37 ° C, 5% de CO 2 ). </li></ol> 4. Captação de glicose <ol><li> Após 1 h de estimulação com insulina, lave os poços duas vezes com X-DPBS (1 mL por lavagem). </li><li> Adicione 1 mL de mistura de citocalasina B aos poços 1 e 2 e 1 mL de mistura de DMSO aos poços 3 a 6. Incube durante 15 minutos (37 ° C, 5% de CO 2 ). No final da incubação, coloque imediatamente a placa no gelo. </li></ol> 5. Lise celular <ol><li> Lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS gelado. </li><li> Lyse as células em cada poço com 600 μL de 50 mM de NaOH. Incube no gelo durante 5 min e misture suavemente com rotação orbital lenta. NOTA: Se o lisado for muito viscoso, diluir com 1,5 mL de NaOH. </li><li> Usando uma pipeta, ressuspenda e coleciona o lisado celular. </li></ol> 6. Determinação da glicose radiomarada <ol><li> Coloque 400 μL de cada lisado celular num frasco de contagem de cintilação líquida. Prepare um frasco de controle negativo com 400ΜL de NaOH 50 mM e um frasco de controlo positivo com 20 μL de TC20 (a partir do passo 1.2.3.1). </li><li> Adicione 4 mL de solução de cintilação líquida a cada frasco para injectáveis. Feche a tampa e misture cada frasco completamente (1-2 s). </li><li> Insira cada frasco em um contador de cintilação líquida e mida a radioatividade de acordo com as instruções do fabricante. Contagem de registros por minuto (CPM) para cada frasco de cintilação por 10 min. NOTA: CPM = &quot;desintegrações por minuto&quot; x &quot;eficiência de contagem&quot;. </li></ol> 7. Taxa de captação de glicose <ol><li> Use o restante lisado (200 μL, a partir do passo 5.2) para medir a concentração de proteína. Determine a concentração de proteína de cada lisado celular utilizando Bradford 25 ou um método equivalente. Calcule a quantidade total de proteína (Q) em mg para cada poço. </li><li> Para obter TC1 (o valor para 1 μL de 2dG radiomarcado *), divida o valor de CPM de TC20 em 20. </li><li> Para cada frasco, calcule tA taxa de absorção de glicose é a seguinte: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq1.jpg" /> NOTA: R é medido em pmol / mg / min. A média de R para os poços 1 a 2 dá taxa de transporte passivo, R p . A média de R para poços 3-4 dá taxa de transporte total basal, R bt . A média de R para os poços 5-6 dá taxa de transporte total estimulada pela insulina, R it . <ol><li> Calcule a taxa de transporte ativo basal (R ba ) da seguinte maneira: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq2.jpg" /></li><li> Calcule a taxa de transporte ativa estimulada pela insulina (R ia ) da seguinte maneira: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq3.jpg" /> NOTA: Em células responsivas a insulina como miotubos, as taxas de absorção de glicose são geralmente representadas por três valores: R ba , R ia e a estimulação da dobra de insulina como R ia / R ba . </li></ol></li></ol>

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<li>Hommelberg, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate-induced+skeletal+muscle+insulin+resistance+does+not+require+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (7), 1215-1225 (2011).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+fatty+acid+palmitate-induced+insulin+resistance+is+accompanied+with+myotube+loss+and+the+impaired+expression+of+health+benefit+myokine+genes+in+C2C12+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes.</a> Lipids Health Dis. 12, 104(2013).</li>
<li>Peng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleate+blocks+palmitate-induced+abnormal+lipid+distribution%2C+endoplasmic+reticulum+expansion+and+stress%2C+and+insulin+resistance+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle.</a> Endocrinology. 152 (6), 2206-2218 (2011).</li>
<li>Lambernd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+activity+of+human+skeletal+muscle+cells+prevents+insulin+resistance+by+inhibiting+pro-inflammatory+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways.</a> Diabetologia. 55 (4), 1128-1139 (2012).</li>
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<li>Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-NBDG+as+a+fluorescent+indicator+for+direct+glucose+uptake+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement.</a> J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).</li>
<li>Catalano, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+induced+by+hyperinsulinemia+coincides+with+a+persistent+alteration+at+the+insulin+receptor+tyrosine+kinase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain.</a> PLoS One. 9 (9), e108693(2014).</li>
<li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+is+a+stronger+inducer+of+insulin+resistance+than+hyperglycemia+in+mice+with+type+1+diabetes+mellitus+%28T1DM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM).</a> J Biol Chem. 284 (40), 27090-27100 (2009).</li>
<li>Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+induced+by+high+glucose+and+high+insulin+precedes+insulin+receptor+substrate+1+protein+depletion+in+human+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes.</a> Metabolism. 56 (2), 190-198 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A absorção de glicose é uma medida biológica fundamental para testar ativadores ou inibidores na cultura celular e como eles afetam o uso de glicose e a capacidade da célula de responder à insulina. O método descrito aqui mostrou-se rápido e confiável e tem sido amplamente utilizado em muitos estudos usando miotubos primários de indivíduos saudáveis ​​e / ou pacientes metabólicamente afetados 6 , 7 , 10 , <sup class=...

O músculo esquelético é o maior depósito de glicose em mamíferos e contribui em grande parte para a homeostase da glicose. Este tecido responsivo à insulina é o principal local de captação de glicose que é desencadeado pela estimulação de insulina 1 . Na diabetes tipo 2, a resistência à insulina é observada em vários tecidos, incluindo o músculo esquelético, e conduz à concentração de glicose no sangue acima do normal. Assim, é de grande relevância para determinar o nível de sensibilidade à insulina deste tecido e suas células, quer seja para caracterizar um defeito em um sujeito, quer para avaliar a eficiência de um tratamento com o objetivo de melhorá-lo. Em indivíduos humanos ou animais, a técnica de padrão-ouro para avaliar a sensibilidade à insulina é o grampo hiperinsulinêmico-euglicêmico. Introduzido por DeFronzo em 1979 2 e modificado desde 3 , 4 então, o método permite quantificar todo o corpo aNd tecidos de resposta de insulina medida como a taxa de glicose a ser perfundida sob estimulação de insulina para manter a concentração normal de glicose no sangue. A exploração da sensibilidade à insulina também pode ser realizada no nível celular usando modelos musculares in vitro e a medição das taxas de absorção de glicose continua sendo uma ferramenta eficiente e confiável para quantificar a resposta biológica da célula à estimulação de insulina 5 , 6 , 7 . De fato, a medida da absorção de glicose quantifica a resposta biológica celular à estimulação de insulina, desde a ligação da insulina ao seu receptor até a translocação de vesículas enriquecidas com GLUT4 e incluindo sinalização intracelular e cascatas de fosforilação 8 . Isso é de grande interesse com amostras humanas, pois os miotubos diferenciados mantêm muitas características do fenótipo do doador, incluindo propriedades metabólicasIes e distúrbios observados no paciente 9 , 10 , 11 , 12 . Os miotubos apresentam semelhanças estruturais, metabólicas e fenotípicas com o músculo esquelético 13 , 14 , incluindo a expressão de transportadores de glicose 15 e a maquinaria de sinalização de insulina celular 16 . Assim, a medição da absorção de glicose em miotubos primários é relevante para caracterizar o fenótipo muscular de um doador, ou investigar o efeito de uma intervenção (medicamento, nutrição ou atividade física) na sensibilidade à insulina na célula muscular. A medida da absorção de glicose em miotubos cultivados também é uma ferramenta confiável ao realizar experimentos que modificam a sensibilidade à insulina 17 , 18 . O in vitro </Em&gt; modelo é adequado para o teste de quaisquer compostos que possam melhorar a capacidade de resposta da insulina, ou poderia prevenir ou reverter a resistência à insulina adquirida ou induzida 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Aqui descrevemos um protocolo detalhado para a cultura e diferenciamos os miotubos humanos e medimos as taxas de absorção de glicose celular. O método é aplicável a qualquer fonte de células precursoras de músculo humano, sejam eles provenientes de preparações em laboratório, colaboração ou fornecedores comercialmente disponíveis. As linhas celulares musculares imortalizadas, como C2C12 e L6, respectivamente, de origem de rato e rato, também podem ser usadas para medição de absorção de glicose com este protocolo 7 . Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar as taxas em estados basais e estimulados por insulina usando [3H] 2dG radiomarcado. TO uso de um análogo de glicose rotulado permite uma determinação precisa da entrada de glicose com material de partida reduzido, uma condição comum ao trabalhar com células primárias. A molécula de glicose modificada é incapaz de entrar em caminhos metabólicos e, assim, se acumula dentro da célula, permitindo quantificação confiável através da radioatividade celular total. As condições experimentais incluem o uso de um inibidor do transporte de glicose (citocalasina B), e as medidas são realizadas com e sem insulina. Esta combinação permite a determinação das taxas de entrada ativa da glicose, bem como o cálculo da variação da dobra para o índice de resposta à insulina. O método é apresentado com uma dose de insulina durante um único tempo de incubação, mas o protocolo pode ser facilmente modificado para experiências de resposta a dose ou tempo 12 .

<table><tbody><tr><td>Célula muscular primária humana</td><td>Preparação interna a partir de biópsias do músculo esquelético humano</td><td>Preparação interna a partir de biópsias do músculo esquelético humano</td><td>Se não estiver disponível, use fonte comercial</td></tr><tr><td>Célula muscular primária humana</td><td>Promocell</td><td>C-12530</td><td>Deve ser cultivada com meios associados C23060 e C23061</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Placas</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>multipoços Corning 356400 BioCoat Collagen IPresunto F10</td><td>Dutscher</td><td>L0145-500</td><td>1 g/L de glicose</td></tr><tr><td></td><td>Glutamina Dutscher</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina 100x</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Substituto de soro UltroserG</td><td>Pall France</td><td>15950.017</td><td>substituto de soro em texto</td></tr><tr><td>DMEM baixa glicose</td><td>Dutscher</td><td>L0064-500</td><td>1 g/L de glicose</td></tr><tr><td>Soro Fetal de Bezerro</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Dutscher</td><td>L0625-500</td><td>Contém Mg2+ (0.5 mM) e Ca2+ (0.9 mM)</td></tr><tr><td>Solução de insulina humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>2-desoxi-D-glicose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bovina</td><td>euromedex</td><td>04-100-812-E</td><td></td></tr><tr><td>livre de ácidos graxos BSA</td><td>Roche</td><td>10,775,835,001</td><td></td></tr><tr><td>palmitato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Deoxy-D-glicose, 2- [1,2-3H (N)]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET328A001MC</td><td>Atividade Específica: 5 - 10 Ci (185-370GBq) / mmol, 1 mCi (37MBq</td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>c2743</td><td></td></tr><tr><td>PICO PRIAS VIAL 6 mL</td><td>PerkinElmer</td><td>6000192</td><td></td></tr><tr><td>ultima gold MW CA&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>6013159</td><td>líquido de cintilação</td></tr><tr><td>b&ecirc; Templar Assassin contra-ataque</td><td>PerkinElmer</td><td>2900TR</td><td></td></tr></tbody></table>

medição da absorção de glicose e resposta à estimulação da insulina em<em&gt; in vitro</em&gt; myotubes primários humanos cultivados

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

O músculo esquelético é o maior depósito de glicose em mamíferos e contribui em grande parte para a homeostase da glicose. A avaliação da sensibilidade à insulina das células musculares é de grande relevância para todos os estudos dedicados a explorar o metabolismo da glicose muscular e caracterizar alterações metabólicas. Nas células musculares, as proteínas do transportador de glicose 4 (GLUT4) translocam para a membrana plasmática em resposta à insulina, permitindo assim a entrada maciça de glicose na célula. A capacidade das células musculares para responder à insulina, aumentando a taxa de captação de glicose é uma das leituras padrão para quantificar a sensibilidade das células musculares à insulina. Os miotubos primários humanos são um modelo in vitro adequado, uma vez que as células mantêm muitas características do fenótipo do doador, incluindo a sensibilidade à insulina. Este modelo in vitro também é adequado para o teste de quaisquer compostos que possam impactar a capacidade de resposta da insulina. As medições da taxa de absorção de glicose em miotubos diferenciados refletemSensibilidade à insulina. Neste método, as células musculares primárias humanas são cultivadas in vitro para obter miotubos diferenciados, e as taxas de absorção de glicose com e sem estimulação com insulina são medidas. Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar as taxas de transporte de glicose passiva e ativa usando [ 3 H] 2-desoxi-D-Glucose radiomarcado ([3H] 2dG). Os métodos de cálculo são fornecidos para quantificar as taxas basais e estimuladas por insulina, bem como a dobra de estimulação.

No dia 3, os mioblastos alcançam a confluência ( Figura 1A ). Os mioblastos nesta fase são tipicamente mononucleados. O meio foi alterado e no dia 8, a diferenciação foi completada ( Figura 1B ) (seção de protocolo 2). Após 5 dias de diferenciação, os miotubos são alinhados e tipicamente polinucleados. Os miotubos primários humanos foram submetidos a um tratamento com palmitato ou apenas com BSA antes da medição da taxa de absor...

Neste método, as células musculares primárias humanas são cultivadas in vitro para obter miotubos diferenciados e as taxas de absorção de glicose são medidas. Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar taxas em estados basais e estimulados por insulina usando [ 3 H] 2-desoxi-D-Glucose radiomarcado.

Medição da absorção de glicose e resposta à estimulação da insulina em<em&gt; In Vitro</em&gt; Myotubes primários humanos cultivados

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a captação de glicose estimulada por insulina em células musculares primárias humanas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do metabolismo muscular, como a sensibilidade à insulina nas células musculares. A principal vantagem desta técnica é que ela quantifica o efeito biológico efetivo nas células musculares em resposta à estimulação hormonal.Para iniciar o experimento, prepare o meio de proliferação, ou PM, suplementando o meio Ham's F-10 com 2% de soro fetal bovino, ou FCS, 2% de substituto de soro, 2 milimoles de glutamina e 5 microgramas por mililitro de penicilina estreptomicina. Prepare um meio de diferenciação, ou DM, suplementando o meio de Eagle modificado por Dulbecco, ou DMEM, com 2% de FCS, 2 milimoles de glutamina e 5 microgramas por mililitro de penicilina estreptomicina. Para preparar o X fosfato tamponado salino de Dulbecco, ou XDPBS, faça uma solução de DBPS contendo 0,2% peso por volume de albúmina sérica bovina.Filtre a solução através de um filtro de 0,2 micrômetros. Em seguida, armazene o XDPBS a 4 graus Celsius. Para preparar a solução fria de 2DG, pese 16,4 miligramas de 2DG, solubiliz

glucose-uptake-measurement-response-to-insulin-stimulation-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve uma técnica rápida para quantificar a translocação do GLUT4 do citoplasma para a membrana plasmática de células por citometria de fluxo.

Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para medir indiretamente a captação intracelular de glicose. O ensaio usa um análogo de glicose marcado com fluorescência para estabelecer uma correlação entre a depleção de glicose extracelular e a captação intracelular de glicose.

Ensaio de depleção de glicose in vitro: um método baseado em fluorescência para quantificar a captação de glicose celular por meio da medição da depleção de glicose extracelular

Neste vídeo, demonstramos uma técnica ex vivo para medir a depleção análoga de glicose extracelular em órgãos de camundongos colhidos. Envolve a incubação do tecido do camundongo em uma solução contendo desoxiglicose marcada com fluorescência, que é absorvida pelas células. A captação de análogos de glicose pode ser determinada indiretamente medindo a fluorescência do meio incubado.

Medição da depleção análoga de glicose fluorescente extracelular: uma técnica de medição substituta para avaliar a captação de glicose em órgãos de camundongos ex vivo

O vídeo demonstra uma técnica para medir a captação de glicose em neurônios motores larvais de Drosophila usando um sensor de glicose intracelular baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Depois de dissecar as larvas para expor o cordão nervoso ventral, os neurônios motores são visualizados através da fluorescência emitida pelo fluoróforo doador do sensor. Quando estimulado com glicose, o FRET entre os fluoróforos doadores e aceptores do sensor desencadeia a...

Avaliação da captação de glicose nos neurônios motores de larvas de Drosophila com metabolismo de glicose regulado positivamente

O objetivo do presente protocolo é medir o efeito da glicose mediada por alterações de respiração mitocondrial na presença de compostos naturais intactos 832/13 beta células usando respirometria de alta resolução.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

Aqui, apresentamos homogênea tempo resolvido FRET (HTRF) como um método eficiente para detecção rápida de insulina secretada de células.

Förster homogênea de tempo-resolvido ressonância energia baseada em transferência ensaio para detecção de secreção de insulina

Este protocolo descreve como executar rápidos ensaios de luciferase de baixo custo em média taxa de transferência usando uma luciferase de Gaussia ligada à insulina como um proxy para a secreção de insulina de células beta. O ensaio pode ser realizado com a maioria dos leitores de placas de luminescência e pipetas multicanal.

Medindo a secreção relativa de insulina usando um substituto de luciferase co-secretado

A regulação intacta da absorção de glicose muscular é importante para manter a homeostase de glicose corporal inteira. Este protocolo apresenta avaliação da absorção de glicose estimulada pela insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado ao delinear o impacto de várias intervenções fisiológicas em todo o metabolismo da glicose corporal.

Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

A absorção de glicose é aumentada em neurônios motores Drosophila afetados pela proteína de ligação de DNA TAR (TDP-43), como indicado por um sensor de glicose à base de FRET, geneticamente codificado.

Medição da captação de glicose em modelos de Drosophila de Proteinopatia TDP-43

O esgotamento extracelular da glicose fluorescente se correlaciona com a absorção de glicose e pode ser usado para triagem de alto rendimento da absorção de glicose em órgãos excisados e culturas celulares.

Esgotamento da glicose extracelular como medida indireta de captação de glicose em células e tecidos Ex Vivo

Aprenda a medir a captação de glicose estimulada por insulina em miotubos primários humanos cultivados in vitro. Este método quantifica os efeitos biológicos da insulina no metabolismo muscular.

Medição da absorção de glicose e resposta à estimulação da insulina em

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