Agulhas personalizadas para alevinos do cérebro de roedor

O objetivo geral desta metodologia é refinar um protocolo para microinjeção cerebral usando agulha de quartzo personalizada e reutilizável que não produza danos detectáveis aos tecidos e garanta uma entrega confiável mesmo em regiões profundas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como a fisiopatologia de doenças neurodegenerativas e psiquiátricas e os efeitos da terapia gênica e celular por meio de vetores virais e enxerto celular. A principal vantagem é que essas agulhas não produzem nenhum dano tecidual detectável, o que garantiu uma entrega confiável em regiões cerebrais profundas.

Eles são econômicos, pois podem ser limpos e reutilizados. Para iniciar este procedimento, limpe e esterilize os capilares de quartzo, colocando-os por cinco minutos em água destilada. Cinco minutos em etanol a 99%, seguidos de cinco minutos em éter dietílico.

Em seguida, deixe os capilares sob o capô por pelo menos uma hora para secar completamente. Enquanto isso, prepare as agulhas longas e finas usando um extrator a laser. Em seguida, coloque as agulhas em uma placa de Petri previamente limpa com etanol 70%.

Cubra o prato com um filme plástico de parafina. Em seguida, corte os capilares no micro dissetor. Fixe firmemente a agulha na mesa do microscópio e posicione sua ponta no centro da tela do computador.

Na barra de menus, clique no ícone de lápis e use-o para desenhar uma marca para a agulha a ser cortada. Na função da barra lateral, selecione a bandeira que contém o botão Iniciar corte para permitir que o laser corte o ponto marcado anteriormente. Se necessário, corte os orifícios laterais desenhando uma marca e repetindo os procedimentos de corte sem reposicionar a agulha.

Depois de cortar a agulha, conecte-a a uma bomba vazia através de um tubo de plástico. Em seguida, ligue a bomba e defina manualmente a vazão direta para três microlitros por minuto. Em seguida, aspire o etanol a 99% seguido da água destilada para remover as impurezas devido ao corte.

Depois disso, aspire o etanol 99% novamente para facilitar a secagem. Posteriormente, armazene as agulhas em uma placa de Petri devidamente coberta até o dia da cirurgia. Para reutilizar as agulhas, ao final do experimento, limpe-as com os detergentes apropriados e etanol 70% para remover a solução injetada e possíveis resíduos de tecido.

Se necessário, essas agulhas podem até ser fervidas em potes de vidro dedicados cheios de água destilada. Nesta etapa, selecione o menu de configurações para calibrar a bomba de acordo com o diâmetro por volume da seringa de microinjeção. E defina a vazão em 0,3 microlitros por minuto.

Em seguida, encha uma seringa de 10 mililitros com água estéril. E use-o para encher a seringa de microinjeções e o kit de peças do conjunto de injeção para a bomba manual de microninjeção. Depois disso, conecte a agulha ao kit de bomba de microinjeção manual.

Desconecte a seringa de 10 mililitros da seringa de microinjeção enquanto empurra lentamente o pistão, para deixar uma gota de água no topo da seringa de microinjeção. Em seguida, insira o pistão na seringa de microinjeção. Agora, conecte a seringa de microinjeção à bomba e ajuste a vazão em 0,3 microlitros por minuto.

Posteriormente, altere a vazão para 0,1 microlitros por minuto e inicie o procedimento cirúrgico. Para realizar a cirurgia, raspe a cabeça do animal e limpe-a com um lenço umedecido com álcool. Em seguida, posicione o rato no quadro estereotáxico.

Faça um corte longitudinal sobre o crânio usando um bisturi esterilizado. Seja gentil para evitar sangramento excessivo. Em seguida, abra o couro cabeludo usando uma espátula plana e aplique clipes cirúrgicos nas abas da pele para mantê-la aberta.

Muito suavemente, destaque o periósteo para expor o bregma e a área do crânio através da qual a agulha será inserida. Em seguida, monte o braço na armação estereotáxica e mova a ponta da agulha logo acima do bregma, prestando atenção para não quebrar sua ponta. Anote as coordenadas ântero-posterior e lateral medial do bregma e mova a agulha para as coordenadas desejadas.

Em seguida, abaixe a agulha até que sua ponta quase toque o crânio, marcando o ponto de perfuração após levantar um pouco o braço estereotáxico. Perfure o crânio no local marcado, tomando cuidado para não danificar as meninges e o cérebro. Em seguida, corte um pequeno pedaço de filme plástico de parafina e coloque-o no crânio.

Usando a pipeta de 10 microlitros, faça uma gota da solução para aplicar no filme plástico de parafina. Pare a bomba, recupere levemente o empurrador da bomba e crie uma pequena bolha de ar no capilar puxando suavemente o pistão da seringa de microinjeção. Abaixe a ponta da agulha até atingir a gota.

Retirar a amostra puxando o pistão da seringa de microinjecção muito lentamente, evitando a formação de bolhas. Substitua o empurrador da bomba em contato com o pistão e ligue a bomba a uma vazão de 0.3 microlitros por minuto. Em seguida, aguarde até a formação de uma gota antes de prosseguir para a próxima etapa.

Depois, diminua o fluxo para 0,1 microlitros por minuto. Corte a dura-máter com uma agulha de ponta chanfrada de aço inoxidável e abaixe lentamente a agulha para entrar no tecido cerebral. Quando a posição desejada for alcançada, desça mais 0,1 milímetros e pare a bomba.

Levante o braço estereostático em 0,1 milímetros e ligue a bomba novamente a 0,3 microlitros por minuto. Depois disso, inicie o cronômetro e a injeção. Monitore o movimento da bolha durante a injeção.

No final, pare a bomba e espere cinco minutos antes de recuperar lentamente a agulha. Quando a agulha de quartzo estiver completamente extraída, ligue a bomba novamente e verifique a formação de uma gota na ponta da agulha. Em seguida, sele a abertura na superfície do crânio com cera óssea.

Remova os clipes homeostáticos e suture o couro cabeludo. Cubra a área ao redor da ferida com um creme antibiótico e devolva o animal à gaiola de casa. Estas são as seções coronais de oito micrômetros do cérebro do rato no nível do estriado.

Esta imagem mostra os danos produzidos pela injeção de dois microlitros de ACSF, usando uma agulha de aço inoxidável de calibre 26. Por outro lado, o estriado injetado com uma agulha de quartzo não apresentou nenhum dano detectável. Essas outras imagens mostram os danos induzidos pelas duas agulhas ao nível do hipocampo dorsal.

Mas a agulha de quartzo não produziu nenhum dano detectável. Injeções bem-sucedidas com ambas as agulhas foram demonstradas pela distribuição de azul de tripano. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas, se for executada corretamente.

Após esses procedimentos, tudo o que importa, como cirurgias adicionais, pode ser realizado para responder a diferentes perguntas, como o efeito induzido por drogas. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de neurociência explorarem o efeito de toxinas e drogas e, mais recentemente, produtos de terapia gênica e celular em modelos animais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar microinjeções em regiões cerebrais mais profundas sem lesões detectáveis usando agulhas de quartzo personalizadas.

Não se esqueça de que o uso de reagentes e/ou patógenos dissecados a laser pode ser extremamente perigoso. E precauções como procedimentos de segurança a laser e equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.