Agulhas personalizadas para alevinos do cérebro de roedor

O objetivo geral desta metodologia é aperfeiçoar um protocolo para microinjeção cerebral utilizando uma agulha de quartzo personalizada e reutilizável que não produz dano tecidual detectável e garante uma entrega confiável, mesmo em regiões profundas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência, como a fisiopatologia de doenças neurodegenerativas e psiquiátricas e os efeitos da terapia gênica e celular por meio de vetores virais e enxertos celulares. A principal vantagem é que essas agulhas não provocam dano tecidual detectável, o que assegura uma entrega confiável em regiões profundas do cérebro.

Eles são economicamente viáveis, pois podem ser limpos e reutilizados. Para iniciar este procedimento, limpe e esterilize os capilares de quartzo colocando-os por cinco minutos em água destilada. Cinco minutos em etanol a 99%, seguidos por cinco minutos em éter dietílico.

Em seguida, deixe os capilares sob a capela por pelo menos uma hora para secar completamente. Enquanto isso, prepare as agulhas longas e finas utilizando um puxador a laser. Depois, coloque as agulhas em uma placa de Petri previamente limpa com etanol 70%.

Cubra o recipiente com uma película de parafina plástica. Em seguida, corte os capilares no microdissector. Fixe firmemente a agulha na mesa do microscópio e posicione sua ponta no centro da tela do computador.

Na barra de menu, clique no ícone de lápis e utilize-o para desenhar uma marca onde a agulha deve ser cortada. Na função da barra lateral, selecione a bandeira que contém o botão Start Cut para permitir que o laser corte o local previamente marcado. Se necessário, corte os orifícios laterais desenhando uma marca e repetindo os procedimentos de corte sem reposicionar a agulha.

Após cortar a agulha, conecte-a a uma bomba de vácuo por meio de um tubo plástico. Em seguida, ligue a bomba e ajuste manualmente a taxa de fluxo para frente para três microlitros por minuto. Então, aspire o etanol 99% seguido pela água destilada para remover impurezas decorrentes do corte.

Em seguida, aspire novamente o etanol a 99% para facilitar a secagem. Posteriormente, armazene as agulhas em uma placa de Petri adequadamente tampada até o dia da cirurgia. Para reutilizar as agulhas, ao final do experimento, limpe-as com detergentes apropriados e etanol a 70% para remover a solução injetada e eventuais resíduos de tecido.

Se necessário, essas agulhas podem até ser fervidas em frascos de vidro dedicados, cheios com água destilada. Nesta etapa, selecione o menu de configurações para calibrar a bomba de acordo com o diâmetro por volume da seringa de microinjeção. E defina a taxa de fluxo em 0,3 microlitros por minuto.

Em seguida, preencha uma seringa de 10 mililitros com água estéril. E use-a para encher a seringa de microinjeção e as peças do kit de montagem de injeção para a bomba de microinjeção manual. Depois disso, conecte a agulha ao kit da bomba de microinjeção manual.

Desconecte a seringa de 10 mililitros da seringa de microinjeção enquanto empurra lentamente o pistão, a fim de deixar uma gota de água na extremidade da seringa de microinjeção. Em seguida, insira o pistão na seringa de microinjeção. Agora, conecte a seringa de microinjeção à bomba e ajuste a taxa de fluxo para 0,3 microlitros por minuto.

Posteriormente, altere a taxa de fluxo para 0,1 microlitro por minuto e inicie o procedimento cirúrgico. Para realizar a cirurgia, rape a cabeça do animal e limpe-a com um lenço umedecido com álcool. Em seguida, posicione a rata na estrutura estereotáxica.

Realize um corte longitudinal sobre o crânio utilizando um bisturi esterilizado. Seja gentil para evitar sangramento excessivo. Em seguida, abra o couro cabeludo usando uma espátula plana e aplique clipes cirúrgicos nas abas da pele para mantê-las abertas.

Com muita delicadeza, desprenda o periósteo para expor o bregma e a área do crânio pela qual a agulha será inserida. Em seguida, fixe o braço no estereotáxico e posicione a ponta da agulha diretamente acima do bregma, tomando cuidado para não quebrar sua ponta. Anote as coordenadas ântero-posterior e médio-lateral do bregma e mova a agulha até as coordenadas desejadas.

Em seguida, abaixe a agulha até que sua ponta quase toque o crânio, marcando o local de perfuração após elevar levemente o braço estereotáxico. Perfore o crânio no local marcado, tendo cuidado para não danificar as meninges e o cérebro. Em seguida, corte um pequeno pedaço de filme de parafina plástica e coloque-o sobre o crânio.

Usando a pipeta de 10 microlitros, faça uma gota da solução para aplicar na película de parafina plástica. Pare a bomba, recolha levemente o êmbolo da bomba e crie uma pequena bolha de ar no capilar puxando suavemente o pistão da seringa de microinjeção. Abaixe a ponta da agulha até que atinja a gota.

Aspire a amostra puxando lentamente o pistão da seringa de microinjeção, evitando a formação de bolhas. Substitua o empurrador da bomba em contato com o pistão e ligue a bomba com uma taxa de fluxo de 0,3 microlitros por minuto. Em seguida, aguarde até a formação de uma gota antes de prosseguir para o próximo passo.

Em seguida, reduza o fluxo para 0,1 microlitro por minuto. Faça um pequeno corte na dura-máter com uma agulha de ponta biselada de aço inoxidável e abaixe lentamente a agulha para penetrar no tecido cerebral. Ao atingir a posição desejada, avance mais 0,1 milímetro, então pare a bomba.

Eleve o braço estereostático em 0,1 milímetro e reinicie a bomba a 0,3 microlitros por minuto. Em seguida, inicie o cronômetro e a injeção. Monitore o movimento da bolha durante a injeção.

No final, pare a bomba e espere cinco minutos antes de retirar lentamente a agulha. Quando a agulha de quartzo estiver completamente extraída, reinicie a bomba e verifique a formação de uma gota na ponta da agulha. Em seguida, feche a abertura na superfície do crânio com cera óssea.

Remova os clipes homeostáticos e feche o couro cabeludo com sutura. Aplique um creme antibiótico na área ao redor da ferida e devolva o animal à sua gaiola de alojamento. Estas são as seções coronais de oito micrômetros dos cérebros de rato no nível do estriado.

Esta imagem mostra os danos provocados pela injeção de dois microlitros de ACSF, utilizando uma agulha de aço inoxidável romba de calibre 26. Em contrapartida, o estriado injetado com uma agulha de quartzo não apresentou nenhum dano detectável. Essas outras imagens mostram os danos induzidos pelas duas agulhas ao nível do hipocampo dorsal.

Mas a agulha de quartzo não produziu nenhum dano detectável. Injeções bem-sucedidas com ambas as agulhas foram comprovadas pela distribuição do azul de tripano. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se for executada corretamente.

Após seguir estes procedimentos, tudo o que for necessário, como cirurgias adicionais, pode ser realizado para responder a diferentes questões, como o efeito induzido por fármacos. Após este avanço, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem o efeito de toxinas e medicamentos e, mais recentemente, de produtos de terapia gênica e celular em modelos animais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar microinjeções em regiões cerebrais profundas sem lesões detectáveis, utilizando agulhas personalizadas de quartzo.

Não se esqueça de que o uso de reagentes e/ou patógenos dissecados a laser pode ser extremamente perigoso. E precauções, como procedimentos de segurança a laser e equipamentos de proteção individual, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.