Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

O objetivo geral deste procedimento é identificar locais de integração de vetores retrovirais no genoma do hospedeiro e quantificar as frequências relativas de populações de células clonais, cada uma compartilhando o mesmo local de integração. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave na terapia genética retroviral, como qual parte do vetor do genoma do hospedeiro se integrou, como uma célula geneticamente modificada será repovoada após o transplante e como elas são funcionalmente diferentes. A principal vantagem dessa técnica é que as sequências de locais de retrointegração podem ser analisadas com maior precisão e sensibilidade, sequenciando simultaneamente as junções de DNA do hospedeiro do vetor a montante e a jusante.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a segurança de vetores e células geneticamente modificadas em estudos de terapia genética, ele também pode ser aplicado a outros estudos básicos de biologia para investigar o comportamento celular individual in vivo. O primeiro passo neste procedimento é determinar a concentração de DNA e a proporção de absorbância a 260 e 280 nanômetros do DNA genômico a ser analisado. Depois disso, diluir um a dois microgramas do DNA genômico da amostra até um volume final de 170 microlitros de solução de DNA genômico usando água livre de nuclease.

Prepare uma reação de PCR de 200 microlitros misturando o seguinte em um tubo de microcentrífuga. 2,5 microlitros cada um dos primers de biotina específicos para HIV-1, ou um total de 10 microlitros para quatro primers específicos para lentivírus, 20 microlitros de tampão DNA polimerase termoestável 10X, quatro microlitros de dNTPs 10 milimolares, três microlitros de DNA polimerase termoestável e 163 microlitros de DNA genômico. Dividir a solução igualmente em quatro tubos de PCR e efectuar um único ciclo de extensão nas seguintes condições.

94 graus Celsius por 5 minutos, 56 graus Celsius por 3 minutos, 72 graus Celsius por 5 minutos e 4 graus C para armazenamento. Agrupe todas as quatro reações de PCR em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Siga o procedimento do fabricante de um kit de purificação por PCR e elua com 50 microlitros de tampão de eluição.

Prepare-se para uma digestão de 100 microlitros adicionando o seguinte a um tubo de microcentrífuga. 50 microlitros de DNA, 10 microlitros de tampão 10X A, dois microlitros de enzima RSAI e 38 microlitros de água livre de nuclease. Incube a 37 graus Celsius em um termociclador por uma hora.

Em seguida, adicione um microlitro da enzima CviQI à reação e incube a 25 graus Celsius por 30 minutos. Quando a digestão RSAI e CviQI estiver completa, prossiga imediatamente com a terminação romba. Prepare uma mistura de 4,5 microlitros contendo 2,5 microlitros de DNA polimerase I, Fragmento Grande e 2 microlitros de dNTPs de 10 milimolares.

Transfira 1 microlitro da mistura para a amostra de DNA. O volume total será de 102 microlitros. Misture bem por vórtice e incube a 25 graus Celsius por uma hora.

Prossiga imediatamente com a encadernação do grânulo de estreptavidina quando a incubação estiver completa. Prepare os grânulos de estreptavidina fazendo um vórtice breve da solução do grânulo e transferindo 50 microlitros para um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Remova o sobrenadante usando um suporte magnético e lave os grãos com 200 microlitros de solução de ligação.

Ressuspenda as esferas em 100 microlitros de solução de ligação e coloque o tubo longe do suporte magnético. Transfira 100 microlitros do DNA da amostra para os 100 microlitros de solução de esferas ressuspensas e misture cuidadosamente pipetando para evitar qualquer formação de espuma da solução. Incube o tubo à temperatura ambiente por 3 horas em uma roda giratória.

Use o suporte magnético para capturar as contas e descartar o sobrenadante. Lave as esferas duas vezes em 400 microlitros de solução de lavagem e duas vezes em 400 microlitros de tampão DNA ligase 1X T4. Ressuspenda os grânulos em 200 microlitros de tampão 1X T4 DNA ligase e coloque-o longe do suporte magnético.

A ligadura do ligante deve ser realizada imediatamente após a ligação do grânulo de estreptavidina. Prepare uma solução de reação de ligação de 400 microlitros misturando o seguinte em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. 0,5 microlitros do ligante de DNA, 10 microlitros de tampão 10X T4 DNA ligase, 20 microlitros de tampão 5X T4 DNA ligase, 5 microlitros de T4 DNA ligase, 164,5 microlitros de água livre de nuclease e 200 microlitros dos grânulos ressuspensos.

Coloque o tubo de reação em uma roda giratória em temperatura ambiente por 3 horas. Lave os grânulos duas vezes com a solução de lavagem e duas vezes com tampão de DNA polimerase termoestável 1X. Ressuspenda as esferas em 50 microlitros de tampão PCR de DNA polimerase termoestável 1X e coloque-o longe do suporte magnético.

Para iniciar este procedimento, prepare uma reação de PCR de 200 microlitros adicionando o seguinte aos grânulos ressuspensos. 10 microlitros de um primer 1L, 10 microlitros de primer 1R, 20 microlitros de primer Link1, 10 microlitros de tampão DNA polimerase termoestável 10X, quatro microlitros de dNTPs 10 milimolares, oito microlitros de DNA polimerase termoestável e 88 microlitros de água livre de nuclease. Alíquota da mistura de reação em quatro tubos de PCR e realizar PCR com a seguinte condição.

94 graus Celsius por 2 minutos, 25 ciclos de 94 graus Celsius por 20 segundos, 56 graus Celsius por 25 segundos e 72 graus Celsius por dois minutos e uma extensão final a 72 graus Celsius por 5 minutos. Agrupe todas as quatro reações de PCR em um tubo de microcentrífuga de 2 ml. Siga o procedimento do kit de purificação PCR e elua com 50 microlitros de tampão de eluição.

Determinar a concentração de ADN e a razão de absorvância a 260 e 280 nanómetros utilizando um espectrofotómetro UV visível. O DNA agora pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius até que esteja pronto para a próxima etapa. Como os procedimentos para as amplificações específicas da junção esquerda e da junção direita são idênticos, exceto para os primers usados na PCR, apenas a amplificação da junção esquerda será demonstrada.

Prepare uma reação de PCR de 50 microlitros misturando o seguinte em um tubo de PCR. Cinco microlitros de DNA, cinco microlitros de primer 2L 10 micromolar, cinco microlitros de primer 10 micromolar Link2, 5 microlitros de tampão DNA polimerase termoestável 10X, um microlitro de 10 dNTPs milimolares, dois microlitros de DNA polimerase termoestável e 27 microlitros de água livre de nuclease. Realize PCR com a seguinte condição.

94 graus Celsius por 3 minutos, 8 a 15 ciclos de 94 graus Celsius por 20 segundos, 56 graus Celsius por 25 segundos e 72 graus Celsius por dois minutos, e uma extensão final a 72 graus Celsius por 5 minutos. Use o kit de purificação por PCR para purificar o DNA e eluir com 50 microlitros de tampão de eluição. Determine a concentração de DNA e a proporção de absorbância em 260 e 280 nanômetros.

A última etapa na geração de bibliotecas de sequências de junção esquerda e direita é analisar as variações do comprimento do amplicon de PCR realizando eletroforese capilar. Este resultado representativo mostra comprimentos variados de Amplicons de PCR em locais de integração de vetores lentivirais para as junções hospedeiras do vetor a montante e a jusante. O marcador de tamanho de DNA está na faixa M.

Após o sequenciamento dos Amplicons de PCR, a análise da sequência do local de integração computacional é realizada usando um script de programação interno. O ensaio de local de integração bidirecional gera diferentes tamanhos de amplificadores de PCR para as junções vetoriais hospedeiras a montante e a jusante visualizadas por eletroforese capilar. Uma comparação da porcentagem de integração nos genes Alu e repetições L1 de vetores lentivirais em camundongos humanizados que repovoam células dentro de eventos de integração aleatórios gerados in silico revelou que os locais de integração são significativamente enriquecidos em genes.

As frequências relativas de detecção de integromas vetoriais foram calculadas usando apenas as contagens de sequência de junções de locais de integração gerando amplicons de PCR menores que 500bp. Aproximadamente 77% dos vetores puderam ser analisados quantitativamente pela abordagem bidirecional. Na estratégia de quantificação clonal, presumimos que cada clone individual compartilha o mesmo integroma vetorial.

As frequências relativas das junções esquerda e direita são combinadas para representar as quantidades relativas das populações clonais, ou QVI. Este esquema de cores mostra as frequências relativas de 44 clones QVI em células de repovoamento de camundongos humanizados. Com base na análise de integração aleatória in silico 10.000, espera-se uma superestimação de 1,25 vezes das frequências clonais ao usar enzimas de motivo GTAC, e uma superestimação de 2,56 é esperada ao usar uma enzima de motivo TCGA.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser dividida em partes e concluída em dois dias, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as etapas de PCR são extremamente sensíveis e precauções devem ser tomadas para evitar qualquer contaminação. Essa técnica abriu caminho para examinar a segurança de vetores retrovirais terapêuticos e explorar padrões de repovoamento de longo prazo de clones de células-tronco hemotopoiéticas após transplante em macacos rhesus.