Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

O objetivo geral deste procedimento é identificar locais de integração de vetores retrovirais no genoma do hospedeiro e quantificar as frequências relativas de populações de células clonais, cada uma compartilhando o mesmo local de integração. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave na terapia genética retroviral, como qual parte do vetor do genoma do hospedeiro se integrou, como uma célula geneticamente modificada será repovoada após o transplante e como elas são funcionalmente diferentes. A principal vantagem dessa técnica é que as sequências de locais de retrointegração podem ser analisadas com maior precisão e sensibilidade, sequenciando simultaneamente as junções de DNA do hospedeiro do vetor a montante e a jusante.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a segurança de vetores e células geneticamente modificadas em estudos de terapia genética, ele também pode ser aplicado a outros estudos básicos de biologia para investigar o comportamento celular individual in vivo. O primeiro passo neste procedimento é determinar a concentração de DNA e a proporção de absorbância a 260 e 280 nanômetros do DNA genômico a ser analisado. Depois disso, diluir um a dois microgramas do DNA genômico da amostra até um volume final de 170 microlitros de solução de DNA genômico usando água livre de nuclease.