Expansão e adipogênese Indução de progenitores de adipócitos do tecido adiposo perivascular isolado pela classificação de células ativadas magnéticas

Os objetivos gerais desses protocolos de isolamento e diferenciação são obter células progenitoras de adipócitos a partir de tecidos adiposos perivasculares e induzir sua diferenciação em adipócitos maduros. Este método permite a análise de populações de células progenitoras de adipócitos específicas e definidas do tecido adiposo perivascular, com impacto mínimo em sua morfologia, viabilidade e potencial de proliferação e diferenciação. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite um maior isolamento de células apresentadoras de antígenos por grama de tecido adiposo, em comparação com a classificação de células ativadas por fluorescência.

Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, faça uma incisão vertical na linha média ao longo do esterno até a área perineal do rato, para acessar a cavidade abdominal. Exponha a artéria mesentérica superior, os pequenos vasos de resistência mesentérica e a aorta torácica e corte todas as conexões com o mesentério e a aorta. Colete o tecido adiposo gonadal e transfira as bolsas de gordura isoladas para um novo recipiente de tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer, ou solução de KRBB, suplementado com montes de 10 milimolares.

Transfira os recipientes para uma placa de Petri contendo a solução de KRBB e coloque a placa sob um microscópio de dissecação. Remova o tecido adiposo perivascular dos pequenos vasos de resistência mesentérica e da aorta. Em uma capa de biossegurança, transfira cerca de 50 miligramas de tecido para um tubo de 1,7 mililitro contendo 1 mililitro de solução de colagenase tipo I e pique o tecido em pedaços de 1 a 3 milímetros.

É importante picar adequadamente o tecido adiposo para permitir que a colagenase se infiltre completamente no tecido conjuntivo. Incube os fragmentos a 37 graus Celsius com agitação por 1 hora. Em seguida, filtre sequencialmente o material digerido através de filtros de células individuais de 100 e 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros.

Colete o filtrado resultante por centrifugação e ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de lise eritrocitária. Transfira a suspensão celular para um novo tubo Microfuge de 1,7 mililitro para uma incubação de 5 minutos em temperatura ambiente, protegida da luz. Em seguida, colete as células da fração vascular estromal com outra centrifugação e ressuspenda o pellet em meio basal da fração vascular estromal para contagem.

Para isolar as células progenitoras de adipócitos por classificação de células ativadas por magnetismo, colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em tampão de bloqueio de classificação de células ativadas por magnetismo em uma concentração de 1 vezes 10 elevado a 6 células por mililitro para uma incubação de 20 minutos a 4 graus Celsius. É essencial que todas as etapas do isolamento sejam feitas a 4 graus Celsius, e não sobre o gelo. Em seguida, incube as células com 5 microlitros de camundongo conjugado com FITC anti-CD34 por 30 minutos.

Recolha as células por centrifugação. Em seguida, incube as células com 4 microlitros de MicroBeads anti-FITC em 96 microlitros de tampão de classificação de células ativadas magneticamente por 5 minutos no escuro. Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna multi-sort no separador magnético com um tubo de resíduos de 5 mililitros sob a coluna.

Enxágue a coluna com 500 microlitros de tampão de classificação de células ativadas magneticamente e descarte o efluente e o tubo de resíduos. Em seguida, coloque um novo tubo sob a coluna e carregue as células no topo da coluna, coletando as células negativas CD34 não rotuladas no novo tubo de coleta. Quando todas as células tiverem passado pelo topo da coluna, lave a coluna 3 vezes com 500 microlitros de tampão de classificação de células ativadas magneticamente desgaseificadas, continuando a acumular o eluato no tubo de coleta.

Após a última lavagem, transfira a coluna para um novo tubo de coleta e use o êmbolo da coluna para liberar 1 mililitro de tampão de classificação de células ativado magneticamente através da coluna para o tubo, para coletar as células CD34 positivas. Coletar as células progenitoras dos adipócitos por centrifugação. Em seguida, incube a fração CD34 positiva em 10 microlitros de receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas de coelho por 30 minutos.

No final da incubação, centrifugue as células novamente e incube o pellet em 4 microlitros de MicroBeads IgG anti-coelho em 96 microlitros de tampão de classificação de células ativado magneticamente para isolamento de esferas magnéticas das células alfa positivas do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas, como acabamos de demonstrar. Para cultivar as células progenitoras de adipócitos alfa do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas CD34 positivas, semeie as células em placas individuais de cultura de tecidos de 6 poços em meio basal e coloque as placas em uma incubadora de cultura de células de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 3 passagens em série, semeie as células em placas pretas de cultura de tecidos de 96 poços em 1 vezes 10 elevado a 2 células por poço e avalie sua proliferação em 8, 24, 48 e 96 horas em 5 vezes 10 elevado a 4ª células por poço, em placas de ensaio de 24 poços, de acordo com os protocolos padrão de ensaio de proliferação.

Para induzir a adipogênese, quando a cultura de células progenitoras de adipócitos atingir a confluência, alimente as células com meio basal progenitor de adipócitos por 48 horas e, em seguida, trate as culturas com proteína morfogênica óssea 4 por mais 48 horas. No terceiro dia, substituir o meio por meio de indução de células progenitoras de adipócitos, sem IBMX e exametasona por 14 dias. O grau de adipogênese nas culturas pode então ser avaliado em 1 vezes 10 elevado a 4ª células por poço em placas de cultura de tecidos de 48 poços, de acordo com os protocolos padrão de ensaio de adipogênese

Embora ambos os métodos demonstrem uma distribuição e viabilidade semelhantes da população celular, o isolamento da classificação celular ativada por magnetismo produz um número maior de células para cultura, em comparação com a classificação de células ativadas por fluorescência. Neste experimento representativo, a proliferação in vitro de células progenitoras estromais da fração vascular estromal e progenitoras de adipócitos classificadas por células ativadas por magnetismo, isoladas da aorta torácica, pequenos vasos de resistência mesentérica e tecido adiposo gonadal de ratos machos, foi avaliada às 8, 24, 48 e 96 horas após o plaqueamento, usando um ensaio quantitativo de DNA. Não foram observadas diferenças de localização nas taxas de expansão da fração vascular estromal em nenhum momento, exceto para as células progenitoras de adipócitos da aorta torácica, que demonstraram menor proliferação em 96 horas, em comparação com as células vasculares estromais do mesmo local.

A estimulação de células progenitoras de adipócitos confluentes com proteína morfogênica óssea 4 por 48 horas induz a diferenciação de adipócitos, evidenciada por um maior acúmulo de lipídios nas gotículas, conforme avaliado tanto pelo ensaio de captação lipídica fluorescente quanto pela coloração Oil Red O. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 8 horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter temperaturas de 4 graus Celsius durante as etapas de isolamento.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e diferenciar as células progenitoras dos adipócitos.