Monitorização da libertação de cálcio ER / SR com o Ca ²⁺ Captador

O objetivo geral deste experimento é exibir nossos protocolos para a cultura e transfecção de células HEK293 e C2C12 com CatchER plus e sua aplicação para monitorar transientes de cálcio mediados por receptores ERSR na medição do NC2KD. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na sinalização de cálcio e na imagem, como a concentração basal de cálcio e suas rápidas mudanças no ERSR de células definidas e como aplicar o biossensor CatchER plus para essas medições. A principal vantagem dessa técnica é que a resposta de fluorescência de células individuais pode ser registrada em tempo real com cinética rápida.

As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de doenças relacionadas ao cálcio ERSR porque o CatchER plus pode monitorar transientes anormais de cálcio nessas organelas que surgem de elementos de sinalização de cálcio disfuncionais. A demonstração visual para este método é crítica, pois as etapas de transfecção celular e imagem de fluorescência são difíceis de aprender porque a cultura de células e a microscopia têm várias áreas de erro. Demonstrando o procedimento estará Florence Reddish, pós-doutoranda do nosso laboratório.

Para iniciar este experimento, semeie células HEK293 nas lâminas de microscópio de vidro esterilizado nas placas de seis centímetros e cultive por um a dois dias até que estejam cerca de 70% confluentes no dia da transfecção. Em seguida, esvazie o DMEM do prato e adicione três mililitros do meio de soro reduzido. Em seguida, adicione a mistura de reagentes de transfecção de DNA ao prato e incube por quatro a seis horas a 37 graus Celsius.

A transfecção de células HEK293 é geralmente mais fácil do que outras linhagens celulares, mas as células são menos resistentes a condições adversas. Portanto, é fundamental expô-los apenas a reagentes de transfecção por quatro a seis horas para evitar a apoptose. Após quatro a seis horas, lave as células com cinco a seis mililitros de HBSS.

Descarte o HBSS do prato e substitua por três mililitros de DMEM fresco. Posteriormente, incubar as células por 48 horas a 37 graus Celsius para permitir a expressão do GECI. Para células de mioblastos C2C12, tripsinize as células adicionando um a dois mililitros de tripsina para cobrir o fundo do prato.

Em seguida, coloque o prato em uma incubadora de 37 graus Celsius por dois a seis minutos para permitir que a tripsina solte as células do fundo do prato. Quando a incubação estiver completa, remova a tripsina e aspire as células em oito mililitros de DMEM. Pipete as células completamente com DMEM para dispersar uniformemente e ressuspender as células.

Em seguida, semeie-os nas lamínulas estéreis em placas de cultura de seis centímetros e, em seguida, adicione três mililitros de DMEM para obter uma confluência final de 60%Em seguida, transfecte as células no mesmo dia. Incube-os por 24 horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, lave as células com cinco a seis mililitros de HBSS.

Descarte o HBSS do prato e substitua por três mililitros de DMEM fresco. Em seguida, incube-os a 37 graus Celsius por 48 horas para permitir a expressão do GECI. Neste procedimento, ligue o microscópio e a fonte de luz e, em seguida, abra o programa PCI simples.

Usando um cotonete, cubra a parte inferior da câmara de imagem de banho de diamante aberto de baixo perfil com uma fina camada de selante. Em seguida, retire uma lâmina contendo as células transfectadas da incubadora e enxágue-a suavemente três vezes com cerca de um mililitro de tampão de Ringer com glicose 10 milimolares e cálcio 1,8 milimolar pré-aquecido a 37 graus Celsius. Deixe cerca de um mililitro de tampão de Ringer no prato para evitar que as células sequem e use uma pinça para tirar a lâmina do prato.

Absorva o excesso de solução tocando a borda da lâmina em um tecido de laboratório. Em seguida, coloque-o na lateral da câmara com as células voltadas para a graxa. Em seguida, prenda a câmara no suporte do palco usando uma chave de fenda.

Adicione cerca de um mililitro de tampão de Ringer à câmara para evitar que as células sequem enquanto a montam no palco e completam a configuração do microscópio. Mude a objetiva do microscópio para a objetiva de imersão em óleo de 40 vezes. Adicione uma gota do óleo de imersão à objetiva.

Em seguida, coloque o suporte no microscópio stage. Em seguida, coloque a ponta de vácuo na câmara para manter a solução nivelada e evitar que ela encha demais. Em seguida, levante a objetiva usando o ajuste de curso até que o óleo na objetiva toque a parte inferior do slide.

Usando o modo de campo claro, ajuste o ganho para 175 e o tempo de exposição para 0,03 segundos para focar as células. Assim que as células estiverem focadas, mude para o modo de fluorescência usando excitação de 488 nanômetros e altere o tempo de exposição para 0,07 segundos. Localize um campo de visão que tenha células suficientes saudáveis com fluorescência adequada para imagens.

Em seguida, tire fotos no modo de fluorescência e campo claro. Circule uma região de interesse nas células ou circule toda a célula para registrar a intensidade da área escolhida. Agora, inicie a medição de intensidade com a taxa de quadros definida em um a cada cinco segundos.

Deixe a intensidade da linha de base estabilizar por 20 a 30 quadros. Em seguida, calcule a quantidade de 4-CMC necessária de um estoque de 20 milimolares com base no volume final da câmara de 450 microlitros para fazer uma concentração final de 200 micromolar. Em seguida, transfira cuidadosamente 60 microlitros de tampão de Ringer da câmara para um tubo de microcentrífuga.

Dilua a quantidade calculada de 4-CMC com esta solução e adicione de volta à câmara para evocar a resposta pretendida das células que estão sendo fotografadas. Dê tempo para que o medicamento se ligue ao receptor e subsequente diminuição do sinal. Em seguida, lave as células com três a seis mililitros de tampão de Ringer e, ao mesmo tempo, adicione o marcador de evento.

Repita os procedimentos para ATP 100 micromolar e CPA 15 micromolar usando uma nova lâmina das células transfectadas para cada ensaio. Quando a medição estiver concluída, encerre a coleta de dados na janela de medição de intensidade no programa PCI simples. Em seguida, tire as fotos de fluorescência e campo claro das células.

Em seguida, abra o arquivo de dados para o experimento. Circule novamente as células ou regiões de interesse para recalcular os valores de intensidade, se necessário. Para determinar as células de mioblastos NC2KD e C2C12, repita o procedimento de transfecção e adicione um mililitro de tampão de Ringer sem cálcio na câmara.

Permeabilize as células com 0,002 a 0,005% de saponina e tampão intracelular por 15 a 30 segundos para esvaziar as células de qualquer CatchER plus que possa estar no citosol. Em seguida, lave as células com três a seis mililitros de tampão KCL contendo EGTA e 10 ionomicina micromolar. Deixe a intensidade diminuir até que um platô seja alcançado.

Em seguida, enxágue as células com três a seis mililitros de tampão KCL com ionomicina 10 micromolar e deixe a intensidade se estabilizar. Depois, adicione diferentes soluções de cálcio para permitir que a intensidade atinja um platô entre cada adição. Para calibrar o sensor para quantificação da concentração basal de cálcio, use EGTA e tampão de cálcio 100 milimolar para obter a intensidade mínima e máxima de fluorescência.

Aqui são mostradas as características representativas para a intensidade normalizada coletada das células de mioblastos C2C12 permeabilizadas transfectadas com CatchER plus. As células foram permeabilizadas com saponina 0,005% no tampão intracelular por 15 a 30 segundos. As soluções de EGTA e cálcio foram preparadas em tampão KCL e N refere-se ao número de células fotografadas.

Essas imagens de fluorescência inseridas são os representantes das células antes e depois do tratamento. 0,2, 0,6, dois, cinco, 10, 20, 50 e 100 milimolares de cálcio foram adicionados às células de mioblastos C2C12 permeabilizadas na presença de 10 ionomicina micromolar para obter um KD de 3,1 mais ou menos 1,4 milimolar. Esta figura mostra uma medição de intensidade representativa de CatchER mais células transfectadas em valores mínimos e máximos após a adição de um EGTA milimolar e 100 milimolares de cálcio com 10 micromolares de ionomicina cada, respectivamente.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 a 60 minutos para a imagem ou três dias se incluir a transfecção. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre manusear as células em um ambiente estéril, preparar os reagentes antes do experimento, aplicar uma camada uniforme de graxa na câmara e ter o aspirador conectado antes de começar. Seguindo este procedimento, outros métodos como western blot podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o nível de expressão do CatchER plus.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da sinalização e imagem de cálcio explorarem a dinâmica do cálcio ERSR em células de mamíferos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transfectar células e imaginá-las usando o CatchER plus.