O modelo do coração invertido para a coleta de transudados intersticiais do coração de rato isolado
20 de junho de 2017
Este protocolo descreve um método para coletar fluido intersticial cardíaco a partir do coração de rato perfundido e isolado. Para separar fisicamente o transudado intersticial do perfusado de efluente venoso coronário, o coração perfundido de Langendorff é invertido e o transudado (fluido intersticial) formado na superfície cardíaca é coletado usando um tampão de látex macio.
O objetivo geral deste modelo de coração invertido é coletar transudato intersticial cardíaco de um coração de rato isolado. Dentro do coração batendo, o sentido individual do coração libera fatores parácrinos e os libera no espaço fluido intersticial circundante. Isso é importante, pois o espaço do fluido intersticial, ele carrega informações para a comunicação entre as células cardíacas.
E isso é particularmente importante em condições de inflamação e regeneração do miocárdio infartado. Neste vídeo, meus colaboradores, Dr.Ding e Tan, mostrarão as técnicas pelas quais nós, neste amor, coletamos fluido intersticial da superfície de um coração de rato perfundido isolado. Para fazer a tampa do coração de látex, ou tampa, tenha um molde de alumínio que corresponda ao tamanho médio do coração de um rato e tenha sido polido com lixa superfina.
Fixe verticalmente o gargalo do molde na fresadora e comece a girar lentamente o molde. Em seguida, despeje 20 mililitros de látex líquido em um copo de vidro de 50 mililitros e abaixe o molde rotativo no látex até que esteja imerso. Em seguida, retire-o lentamente e continue girando o molde por mais 15 minutos até que o látex solidifique.
A rotação é vital para fazer essa mousse e distribuir uniformemente a camada do látex líquido na superfície do molde. Portanto, certifique-se de que o molde esteja girando ao ser levantado do látex. Quando o látex estiver seco, cubra o látex com pó de talco para evitar danos ao látex.
Pare a rotação e, em seguida, retire suavemente o molde da máquina. Remova cuidadosamente o látex do molde. Agora, conecte um tubo de silicone de 25 centímetros de comprimento à saída na tampa de látex.
Este tubo é usado para coletar o transudato cardíaco intersticial, ou TC. Em seguida, prenda firmemente o balão ventricular do tamanho de um rato em uma cânula de metal em forma de L, conectada a uma seringa cheia de água de um mililitro. E encha o balão ventricular do tamanho de um rato com água. Certifique-se de que o balão esteja hermético, inflando-o e esvaziando-o várias vezes usando a seringa.
Em seguida, conecte a cânula a um transdutor de pressão, por meio de um batente de três vias. Por fim, faça uma marca na seringa onde o balão preencherá a cavidade ventricular para a medição da pressão intraventricular. Antes de prosseguir com a preparação do coração, prepare o sistema de perfusão de Langendorff de acordo com o protocolo de texto.
Agora, depois de anestesiar completamente um rato Wistar macho de 300 a 350 gramas, transfira-o para uma mesa de operação em temperatura ambiente. Com a experiência, as etapas seguintes que levam à canulação do coração devem levar apenas cerca de três minutos. Levante a pele e o músculo logo abaixo do esterno, usando uma pinça, e corte ao redor da margem inferior das costelas com uma tesoura pesada.
Em seguida, com uma tesoura fina, faça um pequeno corte no diafragma na margem da costela. Em seguida, corte a costela caudalmente para fazer um retalho de toda a parede torácica ventral. Agora, segure suavemente o coração e vire-o lentamente até que os vasos cardíacos comecem a se esticar.
Em seguida, excise o coração até que a aorta esteja totalmente exposta e transfira o coração para um copo de 100 mililitros contendo 50 mililitros de KHB gelado. Agora, leve imediatamente o coração ao aparelho de profusão e monte a aorta em uma cânula pingando. Prenda-o firmemente com uma sutura 4-0, para que nenhuma bolha de ar possa entrar no coração.
Em seguida, aplique uma pressão de profusão constante ou um fluxo de profusão. Para estabelecer a configuração do coração invertido, primeiro gire suavemente a cânula aórtica até que a parede posterior do cervo esteja na face. Em seguida, corte o tecido conjuntivo para expor a abertura do átrio esquerdo.
Em seguida, segure suavemente o coração e vire-o de cabeça para baixo. Monte o coração no balão ventricular preparado, com o balão desinflado, e alimente-o no ventrículo esquerdo. O coração agora está estabilizado mecanicamente na posição vertical, usando o conjunto do cateter de balão como suporte.
Encha o balão até que ele preencha toda a cavidade ventricular, avançando o êmbolo até a marca de preenchimento. Prenda o coração para que haja o mínimo de estresse na raiz da aorta. Esta parte do procedimento requer prática.
Agora, observe o medidor no balão e ajuste a pressão diastólica para três a cinco milímetros de mercúrio. Pequenas gotículas devem se formar no epicárdio se a pressão for ajustada corretamente. Em seguida, puxe suavemente a tampa de látex sobre o coração.
Mesmo a superfície mais ventricular deve ser coberta. Antes de prosseguir, verifique se há bolhas de ar dentro da tampa. Para remover quaisquer bolhas de ar, use uma sucção suave da seringa.
Agora, posicione a extremidade do tubo de saída 10 centímetros abaixo do coração. Colete o CT pingando em um tubo de 1,5 mililitro e mantenha o tubo abaixo de quatro graus Celsius, incorporando-o em uma mistura 1:1 de gelo e cloreto de sódio. Colete entre 0,15 e 1,5 mililitros de CT, pese a amostra e congele-a em nitrogênio líquido.
Armazene-o a menos 80 graus Celsius até que possa ser processado. Ao retroperfundir o modelo de coração reverso a uma pressão constante de 100 centímetros de água, entre 1/10 a 1% do efluente venoso coronário pôde ser coletado. O conteúdo proteico do CT foi medido com o ensaio BCA e teve uma média de 1,1 miligrama por mililitro.
A eletroforese em gel simples revelou um amplo espectro de proteínas. As amostras normais foram comparadas com as amostras de corações submetidos a 50 minutos de isquemia de reperfusão usando DIGE 2D. Várias proteínas foram reguladas positivamente na TC dos corações isquêmicos.
A análise proteômica foi realizada nas proteínas reguladas positivamente. As purinas também eram de grande interesse. As purinas são moléculas de sinalização fundamentais que regulam a resposta imune cardíaca, o tônus vasomotor e a função cardíaca, principalmente após lesão isquêmica.
A análise por HPLC da TC mostrou concentrações elevadas de muitas purinas nos corações lesionados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que uma transmissão cardíaca sendo formada em um coração isolado não imitará inteiramente a verdadeira composição das condições in-vee-vuh.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para coletar fluido intersticial cardíaco de um coração isolado e perfundido de rato. A técnica envolve inverter o coração perfundido pelo método de Langendorff para separar o transudato intersticial do perfusato venoso coronariano.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Fisiologia cardíaca
- Dinâmica dos fluidos
- Sinalização parácrina
Contexto
- O coração libera fatores parácrinos no líquido intersticial circundante.
- Esse líquido é crucial para a comunicação entre células cardíacas.
- Compreender a dinâmica do líquido intersticial é importante na inflamação e na regeneração miocárdica.
- O estudo utiliza um modelo de coração invertido para a coleta de fluido.
Objetivo do Estudo
- Coletar transudato intersticial cardíaco de um coração de rato isolado.
- Investigar o papel do fluido intersticial na comunicação entre células cardíacas.
- Desenvolver técnicas para estudar a fisiologia cardíaca sob condições específicas.
Métodos Utilizados
- Isolamento do coração de rato utilizando perfusão Langendorff.
- Inversão do coração para facilitar a coleta de fluido.
- Uso de uma cápsula de látex macia para coletar o fluido intersticial.
- Confecção de um molde de alumínio para a cápsula de látex compatível com o tamanho do coração de rato.
Resultados Principais
- Coleta bem-sucedida de fluido intersticial da superfície cardíaca.
- Demonstração da eficácia da técnica em um ambiente de laboratório.
- Informações sobre o papel do fluido intersticial na saúde e nas doenças cardíacas.
- Aplicações potenciais no estudo da inflamação miocárdica e regeneração.
Conclusões
- O método fornece uma maneira confiável de coletar o líquido intersticial cardíaco.
- Compreender a dinâmica do líquido intersticial pode aprimorar a pesquisa cardíaca.
- Este protocolo pode ser aplicado a estudos posteriores sobre a comunicação entre células cardíacas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a amostragem direta do transsudato intersticial cardíaco, proporcionando acesso a moléculas sinalizadoras parácrinas que regulam a função cardíaca e a resposta imunológica. Ao isolar o fluido intersticial do efluente venoso coronariano, os pesquisadores podem reduzir os riscos na validação de alvos no descobrimento de fármacos cardiovasculares por meio de uma compreensão mecanicista dos ambientes de sinalização relevantes para a doença. A abordagem reforça a confiança preditiva na identificação de compostos ativos ao capturar biomarcadores endógenos liberados durante lesão por isquemia-reperfusão e inflamação.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a amostragem de fatores parácrinos endógenos liberados no espaço intersticial.
- Valor Operacional: Fornece um sistema relevante para a doença, destinado à validação funcional de alvos sob condições controladas ex vivo.
- Valor Científico: Apoia a redução de riscos mecanicistas por meio da medição direta de metabólitos purinérgicos e biomarcadores proteicos associados à lesão isquêmica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara amostras biológicas validadas para o desenvolvimento de ensaios posteriores direcionados a vias de sinalização cardíaca.
- Valor Operacional: Fornece saídas quantitativas padronizadas e reprodutíveis por meio de análise por CLAE e proteômica, prontas para triagem de compostos.
- Valor Científico: Facilita a avaliação confiável dos efeitos de compostos na liberação de biomarcadores endógenos em um microambiente controlado de fluido intersticial.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se à descoberta translacional de biomarcadores ao identificar proteínas e purinas superexpressas no transudato cardíaco isquêmico.
- Valor Operacional: Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, mantendo a relevância fisiológica do modelo de coração isolado.
- Valor Científico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao associar a composição do fluido intersticial aos processos de inflamação e regeneração miocárdica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo de coração invertido integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer insights mecanicistas que orientam a seleção de alvos e decisões de otimização de compostos líderes antes das campanhas de triagem fenotípica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio da amostragem direta do fluido intersticial contendo moléculas sinalizadoras.
- Triagem: Permite a preparação para ensaios ao gerar amostras padronizadas de transudato adequadas para a quantificação baseada em HPLC de metabólitos purinérgicos.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de proteínas e metabólitos que permitem análise comparativa entre estados controle e patológicos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao capturar biomarcadores relevantes para modelos de infarto do miocárdio e lesão por reperfusão.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para validação de alvos cardiovasculares em diversas áreas terapêuticas envolvendo sinalização parácrina.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas redes de sinalização parácrina cardíaca.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio da coleta controlada de fluidos sob condições definidas de perfusão.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/não prosseguir ao fornecer acesso direto a biomarcadores endógenos que refletem o engajamento do alvo em sistemas relevantes para a doença.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos cardiovasculares com base na modulação de biomarcadores mecanicistas no fluido intersticial.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em perfusão Langendorff e cirurgia cardíaca para isolamento do coração e cânulação retrógrada.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo transdutores de pressão, cateteres com balão e sistemas de coleta com controle de temperatura.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de manipulação, processamento e análise de fluidos (por exemplo, BCA, HPLC, 2D DIGE) para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o modelo a diferentes condições cardíacas (por exemplo, isquemia-reperfusão, inflamação) para manter a relevância fisiológica.
- Inclui limitações práticas, como taxas variáveis de coleta de transudato (17–147 µL/min) e diluição em relação ao efluente venoso coronariano (0,1–1%), o que pode afetar a sensibilidade na detecção de analitos.
