Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR
30 de dezembro de 2017
A capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas em Drosophila tecidos é fundamental para estudar a sua abundância e relacionadas com o processo de desenvolvimento de localização. Aqui está a descrição de um procedimento simples para dissecar as asas pupal. Estas asas podem ser usadas como amostras em várias técnicas (imuno-histoquímica, ensaio PCR, etc.).
O objetivo geral deste procedimento é um método rápido e eficiente para dissecar as asas de pupa de Drosophila adequado para imunodetecções ou ensaios de PCR. O procedimento aqui descrito foi desenvolvido pela demanda de encontrar um método rápido e eficiente para obter amostras de asas de pupa adequadas para a realização de ensaios de PCR ou protocolos de imunodetecção. Usando um pincel úmido, remova suavemente a pupa APF de zero hora dos frascos de cultura e coloque-os em novos frascos para completar o período de desenvolvimento.
Por exemplo, se estiver usando uma pupa com APF de 24 horas, ela ficará no frasco apenas 22 horas. Às 22 horas, transfira a pupa para a lâmina do microscópio com a fita dupla-face aderida a ela. Essa transferência pode ser feita usando um pincel para evitar danificar a pupa.
A pupa deve ser posicionada formando uma fileira com os lados dorsais para cima e as extremidades cefálicas voltadas para a mesma direção. Depois disso, retorne a lâmina do microscópio a uma temperatura constante e permita que a pupa complete o tempo de desenvolvimento apropriado. Nesse caso, seriam 24 horas.
A lâmina do microscópio com a fita dupla face será uma plataforma de dissecção transitória para remover a caixa de pupa. Durante as duas horas na lâmina do microscópio, a caixa de pupa secará, tornando-a facilmente quebrável com uma pinça. O primeiro passo na dissecação é remover a pupa da carcaça.
Em seguida, a pupa será transferida para uma lâmina diferente com fita dupla-face aderida a ela. A carcaça será deixada para trás. Esta pupa será presa com o lado ventral voltado para cima, colocada no meio da fita.
Antes de realizar o corte da asa, a pupa deve ser coberta com uma solução de acordo com o procedimento por imuno-histoquímica. Esta solução será afixativa e a asa será liberada da cutícula. Usando uma pinça, remova suavemente o opérculo da caixa pupal.
Quebre o estojo com uma pinça, fazendo uma linha ao longo da lateral da pupa até a extremidade caudal dela. Com a iluminação adequada, é possível visualizar a forma interna da pupa, criando um espaço evidente logo acima da dobradiça da asa da pupa. Este espaço serve como guia para realizar a abertura sem danificar a pupa.
À medida que a caixa é aberta lateralmente, será possível retirar partes dela, pegando-as pela borda aberta e carregando-as para o lado oposto onde a fita dupla face as segurará. No final da dissecação, a pupa estará quase nua. Apenas um pedaço de estojo cobrirá a ponta posterior.
Com a ajuda da pinça, empurre suavemente o restante do estojo. Esse movimento elevará a extremidade interna da pupa, permitindo que a cabeça e o tórax permaneçam em uma posição preferencial para ficarem presos ao passo subsequente. Pegue uma nova lâmina com fita dupla-face e inverta-a na pupa.
Em seguida, pressione levemente para fazer a pupa grudar na fita e deslize suavemente a lâmina para remover a pupa do resto das caixas. Inverta a lâmina do microscópio. A pupa ficará presa no lado dorsal ao nível da cabeça ou da área do tórax.
Para uso imuno-histoquímico, cubra toda a pupa nua com 4% de paraformaldeído. Após 10 minutos em afixador, com o auxílio de uma tesoura, faça uma pequena incisão na região da dobradiça da asa ou próximo a ela. Permita que o afixativo atinja o epitélio da asa.
Então, após cinco minutos, rasgue com uma pinça as bordas da cutícula, expandindo o orifício e permitindo a liberação do epitélio da asa do saco cuticular. Assim que o tecido da asa for liberado, deixe-o na solução de paraformaldeído até completar 30 minutos de fixação. O método de dissecação descrito neste vídeo pode ser usado para preparar amostras de alta qualidade de asas de pupa de Drosophila de diferentes estágios de desenvolvimento para muitos tipos de técnicas.
O protocolo pode ser realizado para dissecar uma pupa ou várias pupas ao mesmo tempo. Isso ajuda a acelerar o procedimento, facilitando o alcance de um grande número de asas dissecadas. Para remover a pupa nua da caixa aberta, é importante que a ponta posterior seja pequena o suficiente.
Embora seja possível remover uma fileira de quatro ou cinco pupas nuas ao mesmo tempo, não é um ponto relevante, podendo remover as que permanecem presas ao estojo em etapas sucessivas usando uma única fita dupla-face. Esta é uma imagem confocal de uma asa APF de 24 a 30 horas. A coloração mostra a expressão da proteína patched, o receptor canônico do ouriço, os núcleos e os filamentos de actina.
Um processo de dissecação semelhante poderia ser usado para obter amostras de asas maiores para isolar o mRNA. Este mRNA pode ser usado para sintetizar cDNA que pode ser usado em reações de PCR. Aqui mostramos os produtos obtidos para detectar a expressão de adesivo e actina.
O protocolo oferece um método direto para obter amostras de asas de pupa que retêm a morfologia familiar da asa. A partir dessas preparações, é possível obter pilhas de imagens que podem ser projetadas como imagens 2D ou 3D para investigar a distribuição e/ou o enriquecimento de proteínas durante a diferenciação da asa. Um protocolo semelhante pode ser usado para coletar uma grande amostra de asa de pupa necessária para sintetizar o cDNA, uma molécula essencial nas reações de PCR.
Este procedimento fornece uma abordagem alternativa e complementar aos métodos já publicados para dissecção da asa de pupa.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método rápido e eficiente para dissecar as asas de pupas de Drosophila, que são essenciais para diversas técnicas, como imunodetecção e ensaios de PCR. O procedimento tem como objetivo facilitar o estudo da localização de transcritos e proteínas durante o desenvolvimento.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Genética
Antecedentes
- Compreender a localização de transcritos e proteínas é fundamental em estudos de desenvolvimento.
- Drosophila atua como organismo modelo para pesquisas genéticas e do desenvolvimento.
- Uma preparação eficiente das amostras é necessária para resultados experimentais precisos.
- A imunodetecção e a PCR são técnicas comuns utilizadas em pesquisas biológicas.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um procedimento simples para a dissecação de asas de pupa.
- Aumentar a eficiência na obtenção de amostras para imunodetecção e ensaios de PCR.
- Apoiar pesquisas sobre a localização de transcritos e proteínas durante o desenvolvimento de Drosophila.
Métodos Utilizados
- Uso de um pincel úmido para manipular pupas com cuidado.
- Transferência de pupas para lâminas de microscópio com fita dupla face.
- Temporização da transferência com base na idade da pupa.
- Minimização de danos à pupa durante o processo de dissecação.
Resultados Principais
- O método permite a coleta de amostras intactas de asas de pupa.
- As amostras obtidas são adequadas para diversas aplicações posteriores.
- O procedimento é rápido e minimiza o estresse nas amostras.
- Facilita estudos precisos de localização em Drosophila.
Conclusões
- O método descrito é eficaz para a dissecação de asas de pupa.
- Ele auxilia no estudo dos processos de desenvolvimento em Drosophila.
- A técnica pode ser adaptada para diversas necessidades experimentais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A preparação eficiente de amostras de asas de pupa de Drosophila permite a detecção confiável da expressão de transcritos e proteínas, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Este método fornece um fluxo de trabalho rápido e reprodutível para gerar material biológico de alta qualidade adequado para ensaios subsequentes, reduzindo a variabilidade em triagens fenotípicas e no desenvolvimento de ensaios. Ao padronizar a dissecação das asas, as equipes de pesquisa podem aumentar a confiança preditiva na análise de vias e priorizar alvos com base mecanicista mais sólida.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da detecção localizada de proteínas como patched, um receptor canônico do hedgehog, em tecido alar em desenvolvimento.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao permitir amostragem consistente entre estágios de desenvolvimento para esclarecimento da via.
- Valor Preditivo: Facilita a avaliação do engajamento do alvo e dos padrões de expressão essenciais para a identificação de compostos promissores e triagem de portfólio.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz amostras intactas de asas de pupa adequadas para imunodetecção e ensaios de PCR, permitindo leituras quantitativas da expressão gênica e proteica.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação das amostras, melhorando a reprodutibilidade e a escalabilidade para campanhas de triagem em alto rendimento.
- Prontidão para Ensaios: Gera material compatível com análises moleculares subsequentes, apoiando a avaliação confiável de compostos em telas fenotípicas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Fornece um sistema relevante para a doença no estudo da morfogênese, com aplicabilidade direta à modelagem de vias de desenvolvimento.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a visualização da distribuição e enriquecimento de proteínas durante a diferenciação, fornecendo confiança no alvo.
- Alinhamento Pré-clínico: Apoia a avaliação de biomarcadores por meio da expressão detectável de marcadores como actina e patched no epitélio das asas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até o desenvolvimento de ensaios e avaliação pré-clínica, oferecendo uma técnica reutilizável de preparação de amostras para estudos baseados em Drosophila.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a detecção da comunicação entre células venosas e a formação de veios transversais durante o desenvolvimento de pupa.
- Triagem: Fornece amostras prontas para ensaio com morfologia consistente, aumentando a confiabilidade em leituras baseadas em imunodetecção e PCR.
- Análises: Permite a medição quantitativa dos níveis de transcritos e proteínas, auxiliando análises comparativas entre condições genéticas ou experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta inicial à validação pré-clínica por meio de mecanismos de desenvolvimento conservados, observáveis na morfogênese das asas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado de dissecação aplicável a múltiplos projetos que estudam a genética do desenvolvimento em Drosophila.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de desenvolvimento.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade do preparo de amostras, favorecendo um desempenho consistente dos ensaios.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou não avançar ao fornecer dados confiáveis sobre expressão e localização do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco por meio de dados mecanicistas de maior qualidade obtidos de amostras reprodutíveis.
Considerações sobre a Implementação
- Exige conhecimento básico em manipulação de Drosophila e microscopia.
- Baseia-se em ferramentas padrão: pincel úmido, pinça, lâminas de microscópio com fita adesiva dupla face e paraformaldeído a 4%.
- Requer precisão temporal com base nas horas após a formação de pupa (APF) para corresponder aos estágios de desenvolvimento.
- Adaptável a diferentes estágios de desenvolvimento da asa, mas otimizado para pupas de 24–30 horas APF.
- Limitado pela necessidade de dissecação manual cuidadosa para evitar danos ao tecido, embora a proficiência melhore com a prática.
